Summary
Wir haben eine Zellfusion Assay, SNARE-vermittelte Membranfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase entwickelt.
Abstract
Die Interaktionen von SNARE (s oluble N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor a ttachment Protein re Rezeptor)-Proteine auf Vesikeln (v-SNARE) und Zielmembranen (t-SNAREs) katalysieren intrazellulären Vesikelfusion 1-4. Rekonstitution Assays sind für Sezieren des Mechanismus und Regulation des SNARE-vermittelte Membranfusion 5. In einer Zellfusion Assay 6,7 sind SNARE-Proteine ektopisch an der Zelloberfläche exprimiert wird. Diese "umgedreht" SNARE-Proteine Laufwerk Zell-Zell-Fusion, die belegen, dass SNAREs ausreichen, um Zellmembranen fusionieren werden. Weil der Zellfusion Assay auf mikroskopische Analyse basiert, ist es weniger effizient, wenn verwendet, um mehrere v-und t-SNARE Wechselwirkungen quantitativ zu analysieren.
Hier beschreiben wir einen neuen Assay 8, SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase. Zweidas Tetracyclin-gesteuerten Transaktivator (tTA) und ein Reporterplasmid, das die LacZ-Gen unter Kontrolle des Tetracyclin-Response-Element (TRE-LacZ) kodiert: Komponenten des Tet-Off Genexpressionssystem 9 sind als eine Auslese-System verwendet. Wir transfizieren tTA in COS-7 Zellen, die umgedreht V-SNARE-Proteine auf der Zelloberfläche (v-Zellen) und transfizieren TRE-LacZ in COS-7 Zellen, die umgedreht T-SNARE-Proteine auf der Zelloberfläche (t-Zellen) . SNARE-abhängigen Fusion der v-und t-Zellen führt zur Bindung von tTA an TRE, die transkriptionale Aktivierung von LacZ und Expression von β-Galactosidase. Die Aktivität von β-Galactosidase wird quantifiziert unter Verwendung eines kolorimetrischen Verfahren durch Absorption bei 420 nm auf.
Die Vesikel-assoziiertes Membranproteine (Vamps) sind v-SNAREs, die in verschiedenen Post-Golgi vesikulären Kompartimenten befinden 10-15. Durch Expression VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 und 8 auf dem gleichen Niveau, zu vergleichen wir ihre MembranfusionAktivitäten unter Verwendung des enzymatischen Zellfusion Assay. Basierend auf spektrometrische Messung, bietet dieser Test einen quantitativen Ansatz zur Analyse von SNARE-vermittelte Membranfusion und für High-Throughput-Studien.
Protocol
Ein. Zellkultur und Transfektion
- COS-7-Zellen werden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 4,5 g / l Glukose und 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war.
- Plasmid Transfektion mit Lipofectamin nach den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen) durchgeführt.
2. Fluoreszenzmikroskopische Analyse der Zelloberfläche SNARE Expression
- Am Tag vor der Transfektion wurden 3 x 10 4 COS-7-Zellen werden auf 12-mm sterilen Deckgläschen (Fisher Scientific) in 24-well Platten ausgesät enthalten.
- Für v-Zellen in jedem Well, 0,25 ug des Plasmids, das tTA kodiert (pTet-Off, CLONTECH) mit 0,25 ug der Plasmide, dass ausdrückliche umgedreht Vamps kotransfiziert.
- Für T-Zellen in jedem Well wird 0,25 ug des Plasmids, das TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) mit 0,25 ug jedes der Plasmide, dass ausdrückliche umgedreht SNAP-25 und syntaxins 1 oder 4 kotransfiziert.
- 24 Stunden nach transfection, Zellen werden mit 4% Paraformaldehyd in PBS + + 10 min (PBS mit 0,1 g / l CaCl2 und 0,1 g / l MgCl 2 ergänzt), und dann in 10% FBS in PBS blockiert + + 30 min fixiert.
- Die Zellen werden 1,5 h mit den anti-Myc monoklonalen Antikörper 9E10 (neat Hybridomkulturüberstand) inkubiert.
- Nach vier Waschungen mit PBS + + werden die Zellen für 1 Stunde mit FITC-konjugierten Sekundärantikörper (Jackson Immunoresearch Laboratories) in einer Verdünnung von 1:500, inkubiert.
- Nach vier Waschungen mit PBS + +, die markierten Zellen werden in Prolong Gold-antifade Reagenz (Invitrogen) montiert ist.
- Konfokale Bilder werden auf einer Olympus Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop gesammelt. Die Bilder werden mit dem Adobe Photoshop-Software verarbeitet.
3. FACS Analyse der Zelloberfläche SNARE Expression
- Am Tag vor der Transfektion 2 × 10 5 COS-7-Zellen werden in jede Vertiefung einer 6-Well-Platten ausgesät.
- 24 Stunden nach transfection mit der aufgeklappten SNARE, pTet-Off und pBI-G Plasmiden werden die Zellen mit 1% Paraformaldehyd in PBS + + für 15 min fixiert und dann in 10% FBS in PBS + + 15 min blockiert.
- Die Zellen werden mit den anti-Myc monoklonalen Antikörper 9E10 für 60 min inkubiert.
- Nach dreimaligem Waschen mit PBS + + werden die Zellen mit FITC-konjugierten sekundären Antikörpern (Verdünnung 1:200) 45 min bezeichnet.
- Nach dreimaligem Waschen mit PBS + + werden die Zellen von den Platten mit einem Zellenabstreifer abgeschabt.
- 15.000 Zellen werden mit Hilfe eines FACSCalibur Durchflußzytometer (BD Biosciences). Die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Probe wird unter Verwendung der CellQuest Pro Software.
4. Enzymatische Cell Fusion Assay
- Am Tag vor der Transfektion 1,2 × 10 6 COS-7-Zellen werden in jede 100-mm-Gewebekulturschalen Schale überimpft und 2 × 10 5 COS-7-Zellen werden in jede Vertiefung einer 6-Well-Platten ausgesät.
- Für v-Zellen, 0,5 - 5 ug jeder flipped VAMP Plasmid wird mit 5 pg von pTet-Ab in den Zellen in jeder 100-mm-Kulturschale cotransfiziert. Kontrollzellen mit dem leeren Vektor pcDNA3.1 (+) und pTet-Off cotransfiziert. Um die N-Glykosylierung von VAMPS 1, 4, 5, 7 und 8, Tunicamycin verhindern (10 ug / ml) in Zellkulturmedium während der Transfektion eingeschlossen.
- Für T-Zellen in jedem Well der 6-Well-Platten, blätterte 1 pg SNAP-25-Plasmid und pBI-G mit 0,5 ug kotransfiziert umgedreht Syntaxin1 Plasmid oder 0,05 ug umgedreht syntaxin4 Plasmid.
- 24 Stunden nach der Transfektion werden die v-Zellen von Kulturschalen mit der enzymfreien Zelldissoziation Buffer (Invitrogen) abgenommen ist. Abgelösten Zellen werden mit einem Hämozytometer gezählt und in HEPES-gepufferter DMEM mit 10% FBS, 6,7 ug / ml Tunicamycin und 0,67 mM DTT ergänzt.
- 4,8 × 10 5 resuspendiert v-Zellen werden in jede Vertiefung bereits mit den T-Zellen zugegeben.
- Nach 6, 12 oder 24 hr rat 37 ° C in 5% CO 2
- Nach 90 min wird die kolorimetrische Reaktion durch Zugabe von 1 M Natriumcarbonat gestoppt.
- Die Absorption bei 420 nm wird mit einem HITACHI 100-40 Spektralphotometer.
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Representative Results
Um eine quantitative Zellfusion Assay zu entwickeln, nutzen wir die starke Aktivierung der Transkription durch die Bindung von tTA an TRE. In Abwesenheit von tTA ist Transkription des LacZ-Gens in TRE-LacZ still. Wenn tTA vorhanden ist, bindet es an den TRE und aktiviert die Transkription der LacZ. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der enzymatischen Zellfusion Assay. tTA in v-Zellen transfiziert, die Ausdruck v-SNARE-Proteine auf der Zelloberfläche und TRE-LacZ in t-Zellen transfiziert, die Ausdruck t-SNARE-Proteine auf der Zelloberfläche. Fusion der v-und t-Zellen führt zur Bindung von tTA an TRE, die transkriptionale Aktivierung von LacZ, und die Expression von β-Galactosidase.
2A zeigt die Domänenstruktur von blätterte SNARE-Konstrukte. Die preprolactin Signalsequenz an den N-Termini von SNAREs fusioniert. Diese technischen SNAREs werden 'umgedreht'SNAREs weil die Ausrichtung ihrer SNARE Motive gegen zelluläre Membranen wird umgedreht. Wenn COS-7-Zellen mit Plasmiden umgedreht SNARE transfiziert werden, umgedreht SNARE-Proteine auf der Zelloberfläche (2B) exprimiert werden. Durchflusszytometrie werden die Expressionsniveaus von SNARE-Proteine auf der Zelloberfläche (2C und D) zu messen. Um ihre Membranfusion Kapazitäten vergleichen, müssen VAMPS um auf dem gleichen Niveau exprimiert werden. Daher wir titriert und optimiert die Konzentration jedes umgedreht SNARE verwendete Plasmid in Transfektion. Flipped SNARE Plasmide werden in den folgenden Konzentrationen (je 10 cm 2 Wachstumsbereich, dh pro Well in 6-Well-Platten) transfiziert:; VAMP3, 0,5 ug; VAMP4, 0,5 ug; VAMP5, 0,05 ug; VAMP1, 0,2 ug VAMP7, 1,0 ug; VAMP8, 0,1 ug; Syntaxin1, 0,5 ug; syntaxin4, 0,05 ug. tTA, TRE-LacZ und blätterte SNAP-25 wurden mit 1 g pro 10 cm 2 Wachstumsbereich kotransfiziert. Unter Erfolgh Bedingungen VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 und 8 sind auf dem gleichen Niveau exprimiert, während syntaxins 1 und 4 auf der gleichen Höhe an der Zelloberfläche (2D) exprimiert werden. Wie durch konfokale und Phasenkontrast Bildanalyse (2E) gezeigt, sind 80% der COS-7-Zellen mit blätterte SNARE transfiziert. Dual Kennzeichnung Bildanalyse (2F) zeigt an, dass 70% der transfizierten v-Zellen sowohl tTA auszudrücken und umgedreht VAMP Proteine. Weil das LacZ-Gen in TRE-LacZ nicht vor der Zellfusion ausgedrückt, sind wir nicht in der Lage, den Prozentsatz transfizierter T-Zellen, die sowohl TRE-LacZ auszudrücken und umgedreht T-SNARE-Proteine zu bestimmen.
Die neuronalen SNAREs (v-SNARE VAMP2 und t-SNAREs Syntaxin1 und SNAP-25), die synaptische Exozytose vermittelt werden verwendet, um die Durchführbarkeit des Assays zu testen. Tatsächlich, wenn die V-exprimierenden Zellen VAMP2 und t-exprimierenden Zellen syntaxin1/SNAP-25 kombiniert sind, robuster β-Galactosetosidase Expression detektiert wird (Abbildung 3). Wenn jedoch entweder VAMP2 oder SNAP-25 nicht exprimiert wird, wird nur Basislinie β-Galactosidase-Aktivität erfasst wird, anzeigt, dass Zellfusion und die Expression von β-Galactosidase auf Wechselwirkungen von v-und t-SNAREs verlassen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die enzymatische Zellfusion Assay fusogenen Paarungen zwischen v-und t-SNAREs effizient identifiziert.
VAMP Proteinen durch Expression in gleicher Höhe an der Zelloberfläche (2D), zu vergleichen wir ihre Membranfusion Aktivitäten. Mit dem t-SNAREs syntaxin1/SNAP-25, Vamps 1, 3 und 8 haben vergleichbare und die höchsten Fusionsarbeiten, während Vamps 4 und 7 50% aufweisen und 30% niedriger Fusionsarbeiten, bzw. (Abbildung 4). Im Gegensatz dazu, wenn VAMP5 mit den t-SNAREs kombiniert wird, wird nur Baseline β-Galactosidase-Aktivität nachgewiesen werden (Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass VAMP5 fährt nicht Membranfusion mit der syntaxin1/SNAP-25.
Abbildung 1. Enzymatische Zellfusion Assay. tTA mit blätterte v-SNARE Plasmiden kotransfiziert und TRE-LacZ mit umgedreht t-SNARE Plasmiden kotransfiziert. Die Fusion von v-und t-Zellen führt zur Bindung von tTA an TRE und der Expression von β-Galaktosidase, die durch eine kolorimetrische Methode gemessen wird.
Abbildung 2. Expression umgedreht SNAREs an der Zelloberfläche. (A) Domain Struktur umgedreht SNAREs. Die preprolactin Signalsequenz (SS) an den N-Termini von SNAREs fusioniert, und ein Myc-Tag ist zwischen der Signalsequenz und der SNARE Motive (coiled-coil) eingesetzt ist. (B) COS-7-Zellen werden mit tTA und dem leeren Vektor pcDNA3.1 (+) cotransfiziert oder gespiegelt VAMP5 Plasmid. 24h nach Transfektion werden unpermeabilized Zellen mit einem monoklonalen Anti-Myc-Antikörper gefärbt. Vertreter Einzel-Slice-konfokale Bilder angezeigt werden. (C und D) 24 Stunden nach Cotransfektion mit tTA und pcDNA3.1 (+) oder gespiegelt VAMPS (v-Zellen) bzw. 24 Stunden nach Cotransfektion mit TRE-LacZ, umgedreht SNAP-25 und syntaxins 1 oder 4 (t-Zellen ) werden unpermeabilized Zellen mit dem anti-Myc-Antikörper gefärbt und durch Durchflusszytometrie analysiert. (C) Repräsentative FACS Profile der Zellen mit pcDNA3.1 (+) transfiziert oder gespiegelt VAMP1 Plasmid. Die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Probe wird bestimmt nach der CellQuest Pro Software. (D) Zu VAMPS auf dem gleichen Niveau exprimieren und Express syntaxins 1 und 4 auf der gleichen Höhe an der Zelloberfläche, umgedreht SNARE Plasmide an titriert Konzentrationen transfiziert werden. Dargestellt sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten Zelloberflächenfärbung der SNARE-Proteine. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 4 unabhängigen Experimenten. (E und F) 24 Stunden nach cotransfe ction mit tTA und umgedreht VAMP5 Plasmid werden Zellen mit permeablized 0,2% Triton X-100 in PBS + + und (E) mit dem anti-Myc-Antikörper gefärbt, oder (F) dualen gefärbt mit dem Anti-Myc monoklonalen Antikörper und einem polyklonalen Antikörper gegen den Tet-Repressor (um tTA erkennen). (E) sind repräsentativ konfokalen und Phase kontrastreiche Bilder. Die Anzahl der transfizierten Zellen, die durch den Anti-Myc-Antikörper (VAMP5) und der Gesamtzahl der Zellen in der Phasenkontrast-Kanal werden gezählt (n = 60 Zellen) und Transfektionseffizienz wird berechnet (80%) gekennzeichnet sind. (F) Die Anzahl der transfizierten Zellen, die sowohl tTA VAMP5 und auszudrücken, und die Gesamtzahl der transfizierten Zellen, die VAMP5, tTA oder beide gezählt werden (n = 75 transfizierte Zellen). Der Prozentsatz der transfizierten Zellen, die sowohl VAMP5 und tTA exprimieren wird dann berechnet (70%). Maßstabsbalken, 20 um. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3. Zellfusion hängt von den Wechselwirkungen der v-und t-SNAREs. v-Zellen, die tTA und VAMP2 mit T-Zellen inkubiert, die Ausdruck TRE-LacZ, Syntaxin1 und SNAP-25. Nach 24 h werden die Zellen lysiert und die Aktivität von β-Galactosidase in den Zelllysaten wird unter Verwendung eines kolorimetrischen Verfahrens durch Absorption bei 420 nm auf. Nur Basislinie b-Galactosidase-Aktivität erkannt wird, wenn entweder umgedreht VAMP2 oder SNAP-25-Plasmid von Transfektion weggelassen.
Abbildung 4. Vergleich der Fusion Aktivitäten Vamps. Unter optimierten Bedingungen Transfektion, VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 und 8 sind auf der gleichen Höhe an der Zelloberfläche von v-Zellen exprimiert. 24 Stunden nach der Vereinigung der v-Zellen mit den T-Zellen, die exPresse syntaxin1/SNAP-25 wird Zellfusion quantifiziert unter Verwendung des enzymatischen Zellfusion Assay. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 4 unabhängigen Experimenten. ** P <0,01; *** P <0,001 vs VAMP1.
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Discussion
Das Originalbild Zellfusion Assay 6 bestimmt SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse durch Fluoreszenzmikroskopie. Hier beschreiben wir eine innovative Assay, SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase und spektrometrische Messung. Unter Verwendung dieses Tests analysieren wir routinemäßig 15-20 v-und t-SNARE-Kombinationen in einem einzigen Experiment. Mittels Durchflusszytometrie zur SNARE-Expression auf der Zelloberfläche zu messen, zu titrieren wir die Expression von Vamps und vergleichen ihre Membranfusion Kapazitäten (Abbildungen 2 und 4). Zusätzlich hatte der enzymatischen Assay Zellfusion, bestimmten wir die Abhängigkeit der Zellfusion Aktivität auf Zelloberflächen Dichte VAMP1 Protein und beobachtet keine Kooperativität VAMP1 Proteins in der Zelle Fusionsreaktion 8, was darauf hindeutet, dass konzertierte Aktion von mehreren SNARE-Komplexen nicht erforderlich ist die Zellmembranen zu verschmelzen.
Es gibt putative N-Glykosylierung motifs (Asn-X-Ser/Thr) in SNARE-Proteine. Da die N-Glykosylierung inhibiert die Fusionsprodukte Tätigkeiten umgedreht SNARE-Proteine 6 wurden zwei Ansätze verwendet worden, um die Glycosylierung von gekippt SNARE-Proteine zu verhindern. Zunächst werden Glykosylierung-site Mutationen in blätterte SNARE konstruiert 6 eingeführt. Zweitens wird, wie in dem aktuellen Protokoll beschrieben, wird die N-Glykosylierung Inhibitor Tunicamycin (6,7 ug / ml) in der Zelle Fusionsreaktion enthalten. Zusätzlich wird 0,67 mM DTT in der Zellfusion Reaktion zugegeben, um die Bildung von Disulfidbindungen zwischen umgedreht SNARE-Proteine, die SNARE Fusionsarbeiten inhibieren würde verhindern. Unsere Experimente zeigen, dass die Zugabe von 6,7 ug / ml Tunicamycin und 0,67 mM DTT in Zellkulturmedium nicht mit der Proliferation und das Überleben von COS-7-Zellen interferieren. Wir routinemäßig beenden Zellfusion Reaktion bei 24 Stunden nach Kombinieren v-und t-Zellen. Jedoch erhebliche SNARE-vermittelte Zellfusion 6 Stunden nach Kombinieren v-a detektiertennd t-Zellen 8. Da die enzymatische Zellfusion Reaktion hängt von der Expression von β-Galactosidase nach der Zellfusion, eilt der zeitliche Verlauf dieser Auslesesystem den zeitlichen Verlauf der durch Membranfusion umgedreht SNARE-Proteine vermittelt wird.
Die enzymatische Zellfusion Assay eine quantitative Rekonstitution Assay zur Untersuchung der Aktivitäten der Membranfusion Potential v-und t-SNARE Wechselwirkungen in Säugerzellen. Coexpression von regulatorischen Proteinen (zB Munc18) und SNAREs an der Zelloberfläche oder durch die Aufnahme rekombinanter regulatorische Proteine in der Zelle Fusionsreaktion kann dieser Assay verwendet werden, um die regulatorischen Mechanismen der SNARE-vermittelte Membranfusion aufzuklären. Zudem sollte dieser Test haben Anwendungen in Hochdurchsatz-Screening auf Inhibitoren oder Aktivatoren der SNARE-vermittelte Membranfusion.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch Anschubfinanzierung von der University of Louisville und CA135123 von den National Institutes of Health (bis CH) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
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