Summary
우리는 β-갈 락토의 활성화 표현으로 올무로 인한 막 퓨전 이벤트를 단정 지을 세포 융합 분석을 개발했습니다.
Abstract
스네어 (들 oluble N-ethylmaleimide에 민감한 요소 ttachment 단백질 재를 ceptor) 소포 (V-그물)에 및 대상 멤브레인에 단백질의 상호 작용 (T-올무) 세포 소포의 융합 1-4 catalyze. Reconstitution의 assays는 올무로 인한 막 융합 (5)의 체계 및 규정을 해부에 필수적입니다. 세포 융합 분석 6,7에서 스네어 단백질은 세포 표면에 ectopically 표현됩니다. 이러한 올무가 세포 세포막을 융합하기에 충분한 것으로 입증, 스네어 단백질 드라이브 세포 세포 융합 "을 뒤집힌." 세포 융합 분석은 현미경 분석을 기반으로하기 때문에 여러 V-와 t-올무 상호 작용 양적 분석하는 데 사용하면 덜 효율적이다.
여기 β-갈 락토의 활성화 표현으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 단정 지을만한 새로운 검정 8 설명합니다. 두테트라 사이클린 제어 transactivator (TTA) 및 테트라 사이클린 - 응답 요소의 제어 (트레 - LacZ)에서 LacZ 유전자를 인코딩 플라스미드 기자 : Tet 오프 유전자 발현 시스템 9의 구성 요소는 판독 시스템으로 사용됩니다. 익스프레스 익스프레스는 세포 표면에 t-올무 단백질을 뒤집은 것이 COS-7 세포 (T-세포)로 세포 표면의 V-스네어 단백질 (V-세포)와 transfect 트레 - LacZ를 뒤집힌 것을 COS-7 세포에 우리 transfect TTA . 트레 전사 LacZ의 활성화 및 β-갈 락토 표현에 TTA의 바인딩의 V-및 T-세포 결과의 올무에 의존 융합. β-갈 락토의 활동은 420 nm의에서 흡수하여 colorimetric 방법을 사용하여 정량하고 있습니다.
소포 - 관련 막 단백질 (VAMPs)는 다양한 사후 Golgi 기공을 갖는 구획에 10-15을 거주 V-올무 있습니다. 동일한 수준의 VAMPs 1, 3, 4, 5, 7, 8을 표현함으로써, 우리는 막 융합을 비교효소 세포 융합 분석을 사용하여 활동. spectrometric 측정을 바탕으로,이 분석은 스네어로 인한 막 융합을 분석 및 높은 처리량을 연구 양적 접근 방식을 제공합니다.
Protocol
1. 세포 배양 및 Transfection
- COS-7 세포는 4.5 g / L 포도당와 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 보충 Dulbecco 수정일 독수리의 중간 (DMEM)에서 배양되어 있습니다.
- 플라스미드 transfection는 제조업체의 지시 사항 (Invitrogen)에 따라 Lipofectamine하여 이루어집니다.
2. 세포 표면 스네어의 표현의 형광 미세 분석
- transfection 전날, 3 × 10 4 COS-7 세포는 24 잘 플레이트에 포함 된 멸균 12 mm 유리 coverslips (피셔 과학)에 놓는 있습니다.
- TTA을 인코딩 그 플라스미드의 각 잘, 0.25 μg의 V-세포의 경우 (pTet 오프, CLONTECH) Express는 VAMPs을 뒤집은하는 plasmids의 0.25 μg과 cotransfected 있습니다.
- 각 잘에 t-세포를 들어, 플라스미드 인코딩 트레 - LacZ (pBI-G, CLONTECH)의 0.25 μg는 0.25 μg 익스프레스 SNAP-25와 syntaxins 1 4 뒤집힌있는 plasmids의 각을 cotransfected 있습니다.
- t 후 24 시간ransfection, 세포는 PBS에 4 % paraformaldehyde + + 10 분에 (PBS는 0.1 g / L CaCl 2, 0.1 g / L MgCl 2 보충) 한 다음 PBS에서 10 % FBS에서 차단 + + 30 분에 고정되어 있습니다.
- 세포는 안티 - Myc 단클론 항체 9E10 (깔끔한 하이 브리 도마 문화 표면에 뜨는)에 1.5 시간에 incubated 수 있습니다.
- 4 개의 세차 후 PBS + +, 셀 1:500의 희석에 FITC-복합 차 항체 (잭슨 Immunoresearch 연구소)와 1 시간에 incubated 수 있습니다.
- 4 개의 세차 후 PBS + +, 레이블 셀 골드 antifade 시약 (Invitrogen)를 연장으로 장착되어 있습니다.
- 공 촛점 이미지는 올림푸스 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경에서 수집됩니다. 이미지는 어도비 포토샵 소프트웨어로 처리됩니다.
3. 세포 표면 올무 식의 FACS 분석
- transfection 전날, 2 × 10 5 COS-7 세포는 6 잘 플레이트의 각 우물에 놓는 있습니다.
- tra 후 24 시간과 nsfection은 스네어, pTet 오프 및 pBI-G의 plasmids, 방석을 뒤집은 세포는 PBS에 1 % paraformaldehyde와 + + 15 분에 고정하고 PBS에서 10 % FBS에서 + + 15 분에 차단됩니다.
- 세포는 60 분에 반 Myc 단클론 항체 9E10와 incubated 수 있습니다.
- 든 세 세차 후 PBS + +, 셀이 45 분에 FITC-복합 차 항체 (1:200 희석)으로 분류됩니다.
- PBS 든 세 세차는 + +, 세포는 세포 스크레이퍼로 접시에서 긁어 후.
- 15000 세포는 FACSCalibur 흐름 cytometer (BD Biosciences)를 사용하여 분석하고 있습니다. 각 샘플의 평균 형광 강도는 CellQuest Pro 소프트웨어를 사용하여 얻어진다.
4. 효소 세포 융합 분석
- transfection 전날, 1.2 × 10 6 COS-7 세포는 각각 100 mm 조직 배양 접시에 놓는, 그리고 2아르 × 10 5 COS-7 세포는 6 잘 플레이트의 각 우물에 놓는 있습니다.
- 5 μg flipp의 각 - V-세포, 0.5에 대한플라스미드 에드 즉석 반주는 각 100 mm 배양 접시에있는 세포에 pTet 오프 5 μg과 cotransfected 있습니다. 제어 세포는 빈 벡터 pcDNA3.1 (+)와 pTet 오프로 cotransfected 있습니다. VAMPs 1, 4, 5, 7, 8, tunicamycin의 N-글리코 실화를 방지하기 위해 (10 μg / ml) 쇼핑은 transfection시 세포 배양 매체에 포함되어 있습니다.
- 6 잘 플레이트의 각 잘에 t-세포의 경우, 1 μg은 SNAP-25 플라스미드를 뒤집힌 및 pBI-G는 0.5 μg과 cotransfected 아르는 플라스미드 syntaxin4을 뒤집은의 플라스미드 syntaxin1 또는 0.05 μg을 뒤집어 졌죠.
- 24 시간 transfection 후, V-세포는 효소가없는 세포 분리 버퍼 (Invitrogen)와 문화 요리에서 분리됩니다. 단독 세포가 hemacytometer로 간주하고에 resuspended 아르 HEPES 버퍼 DMEM 10 % FBS, 6.7 μg / ML의 tunicamycin 및 0.67 밀리미터 DTT와 함께 보충.
- 4.8 × resuspended 10 5 V-셀은 각도 이미 t-세포를 포함에 추가됩니다.
- 6, 12 시간 또는 24 시간 쥐 37 이후 ° C 5 % CO 2
- 90 분 후, colorimetric 반응은 1 M 나트륨 탄산을 추가하여 중지됩니다.
- 420 나노 미터의 흡광도는 히타치 100-40 분광 광도계를 사용하여 측정된다.
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Representative Results
양적 세포 융합 분석을 개발하기 위해, 우리는 트레에 TTA의 바인딩에 의해 강한 전사 활성을 활용할 수 있습니다. TTA의 부재에서, 트레-LacZ에 LacZ 유전자의 전사는 침묵입니다. TTA가 존재하면, 트레에 바인딩와 LacZ의 전사를 활성화합니다. 그림 1은 효소 세포 융합 분석의 순서도를 보여줍니다. TTA는 세포 표면의 특급 V-스네어 단백질, 그리고 트레 - LacZ가 T-세포로 transfected되는 V-셀에 transfected되는 세포 표면에서 명시 적 t-스네어 단백질. 트레 LacZ의 전사 활성화 및 β-갈 락토의 표현에 TTA의 바인딩의 V-및 T-세포 결과의 융합.
그림 2A 협조 올무 구조의 도메인 구조를 보여줍니다. preprolactin 신호 순서는 그물의 N-말단에 융합되어 있습니다. 이러한 엔지니어링 올무가 '뒤집힌'라고합니다올무가 있기 때문에이 세포의 세포막에 대한 자신의 올무 모티브의 방향은 뒤집혀 있습니다. COS-7 세포가 뒤집힌 올무 plasmids와 transfected 때, 스네어 단백질은 세포 표면 (그림 2B)에서 표현됩니다 뒤집어 졌죠. 유동 세포 계측법은 세포 표면 (그림 2C와 D)에서 스네어 단백질의 표현 수준을 측정하는 데 사용됩니다. 자신의 막 융합 용량을 비교하기 위해, VAMPs 같은 수준의 표현해야합니다. 따라서, 우리는 titrated와 각각의 농도가 플라스미드는 transfection에 사용 올무를 뒤집힌 최적화. , VAMP7, VAMP3, 0.5 μg; VAMP4, 0.5 μg, VAMP5, 0.05 μg VAMP1, 0.2 μg : 뒤집 스네어의 plasmids은 다음과 농도 (당 10cm이 성장 지역, 즉, 당 잘 6 잘 접시에)에 transfected 아르 1.0 μg, VAMP8, 0.1 μg, syntaxin1, 0.5 μg, syntaxin4, 0.05 μg. TTA, 트레-LacZ와 SNAP-25을 뒤집은는 10cm이 성장 지역 당 1 μg에 cotransfected했다. suc 아래syntaxins 1과 4는 세포 표면 (그림 2D)에서 동일한 수준에서 표현하는 동안 H 조건, VAMPs 1, 3, 4, 5, 7, 8은 동일한 수준에서 표현됩니다. 으로 공 촛점 및 위상 대비 이미지 분석 (그림 2E)에 의해 도시 된 바와 같이, COS-7 세포의 80 %가 뒤집혀 스네어의 plasmids과 transfected 수 있습니다. 이중 라벨 영상 분석 (그림 2 층)는 transfected V-세포의 70 %가 TTA을 모두 표현하고 즉석 반주 단백질을 뒤집힌 나타냅니다. 트레 - LacZ에 LacZ 유전자는 세포 융합 전에 표현되지 않기 때문에, 우리는 트레 - LacZ를 모두 표현하고 t-올무 단백질을 뒤집은 T-세포 transfected의 비율을 결정 할 수 없습니다.
신경 exocytosis를 중재 neuronal 올무 (V-올무 VAMP2, 그리고 t-올무 syntaxin1와 SNAP-25)은 분석의 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 사실, syntaxin1/SNAP-25을 표현 VAMP2와 T-세포를 표현 V-셀이 결합되어 강력한 β-불어tosidase 표현은 (그림 3) 검출된다. 그러나, VAMP2 또는 SNAP-25 하나가 표현되지 않은 경우 만 기본 β-갈 락토 활동이 세포 융합 및 β-갈 락토의 표현은 V-와 t-올무의 상호 작용에 의존한다는 의미, 검출된다. 이러한 결과는 효소 세포 융합 분석은 V-와 t-올무 효율적 사이 fusogenic pairings을 식별 나타냅니다.
세포 표면 (그림 2D)에서 동일한 수준의 즉석 반주 단백질을 표현함으로써, 우리는 막 융합 활동을 비교합니다. t-올무 syntaxin1/SNAP-25, VAMPs 1, 3, 및 VAMPs 4 7 50 %가 각각 30% 낮은 융합 활동, (그림 4) 반면, 8, 비교하고 가장 높은 퓨전 활동을합니다.으로 대조적으로, VAMP5는 t-올무와 결합 될 때, 오직 기본 β-갈 락토 활동 VAMP5는 synt과 막 융합을 유도하지 않는 제안 (그림 4) 감지axin1/SNAP-25.
그림 1. 효소 세포 융합 분석. TTA는 뒤집힌 V-스네어의 plasmids과 cotransfected되고, 트레 - LacZ가 뒤집혀 t-스네어의 plasmids과 cotransfected 있습니다. V-및 T-세포의 융합, 트레에 TTA의 바인딩과 colorimetric 방법에 의해 측정됩니다 β-갈 락토의 표현로 연결됩니다.
그림 2. 표현의 세포 표면에 올무를 뒤집어 졌죠. (A)의 도메인 구조는 올무를 뒤집어 졌죠. preprolactin 신호 순서 (SS) 올무의 N-말단에 융합되고, Myc 태그는 신호 시퀀스와 스네어의 모티브 (코일 코일) 사이에 삽입됩니다. (B) COS-7 세포는 TTA와 빈 벡터 pcDNA3.1 (+)로 cotransfected거나 플라스미드 VAMP5를 뒤집어 졌죠. 24transfection 후 시간, unpermeabilized 세포는 안티 - Myc 단클론 항체 물들 일 수 있습니다. 대표 단일 슬라이스 공 촛점 이미지가 표시됩니다. (C와 D) 24 TTA와 pcDNA3.1 (+)와 cotransfection 후 시간 또는 VAMPs (V-세포) 또는 트레 - LacZ와 cotransfection 후 24 시간을 뒤집은는 이성을 상실 SNAP-25와 syntaxins 1 4 (T-세포 ), unpermeabilized 세포는 안티 - Myc 항체 물들과 유동 세포 계측법에 의해 분석됩니다. (C) 세포의 대표 FACS 프로필을 pcDNA3.1 (+)로 transfected 또는 플라스미드 VAMP1를 뒤집어 졌죠. 각 샘플의 평균 형광 강도는 CellQuest Pro 소프트웨어를 사용하여 결정됩니다. (D) 세포 표면에있는 같은 수준에서 동일한 수준에서 VAMPs을 표현하고 표현 syntaxins 1 4, 스네어의 plasmids은 titrated 농도에 transfected 아르 협조했습니다. 표시하면 올무 단백질의 세포 표면 착색의 평균 형광 강도입니다. 오류 막대는 4 독립적 인 실험 표준 편차를 나타냅니다. cotransfe 후 (E와 F) 24 시간 TTA와 ction와 협조 VAMP5 플라스미드, 세포와 permeablized 아르 0.2 % 트리톤 PBS에서 X-100 + +와 (E) 안티 - Myc 항체 물들 일, 또는 반 Myc 단클론 항체와 polyclonal 항체에있는 (F) 듀얼 스테인드 TET 억제 (TTA을 감지하는). (E) 대표 공 촛점과 위상 대비 이미지가 표시됩니다. 반 Myc 항체 (VAMP5)와 위상 콘트라스트 채널의 셀의 총 개수 (N = 60 셀) 계산되며, transfection 효율이 (80 %) 계산에 의해 표시된 transfected 세포의 수입니다. (F) VAMP5 및 TTA를 모두 표현 transfected 세포의 수, 명시 적 VAMP5, TTA 또는 둘 다 (N = 75 transfected 세포) 계산하는 transfected 세포의 총 수입니다. VAMP5 및 TTA를 모두 표현 transfected 세포의 비율은 다음 (70 %) 계산됩니다. 스케일 바, 20 μm이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 세포 융합은 V-와 t-올무의 상호 작용에 따라 달라집니다. 익스프레스 TTA와 VAMP2는 t-세포와 incubated하는 V-셀이 명시 트레 - LacZ, syntaxin1 및 SNAP-25. 24 H 후, 셀이 lysed되고 세포 lysates에서 β-갈 락토의 활동은 420 nm의에서 흡수하여 colorimetric 방법을 사용하여 결정됩니다. 중 VAMP2 이성을 상실 또는 SNAP-25 플라스미드가 transfection에서 생략 된 경우에만 기본 B-갈 락토 활동이 검출된다.
그림 4. VAMPs의 융합 활동의 비교. 최적화 된 transfection 조건, VAMPs 1, 3, 4, 5, 7, 8에서 V-세포의 세포 표면에있는 같은 수준 표현됩니다. T-세포와 V-세포를 결합 후 24 시간이 예보도 syntaxin1/SNAP-25은 세포 융합은 효소 세포 융합 분석을 사용하여 정량하고 있습니다. 오류 막대는 4 독립적 인 실험 표준 편차를 나타냅니다. ** P <0.01, *** P <0.001 대 VAMP1.
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Discussion
원래 세포 융합 분석 6 형광 현미경으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 결정합니다. 여기 β-갈 락토 및 spectrometric 측정의 활성화 표현으로 올무로 인한 세포 융합 이벤트를 단정 지을 혁신적인 분석을 설명합니다. 이 분석을 사용하여, 우리는 정기적으로 15 분석 - 20 V-와 t-올무 한 실험에서 조합. 세포 표면에 올무 식을 측정하는 유동 세포 계측법을 사용하여, 우리는 VAMPs의 표현 수준을 적정하다하고 막 융합 용량을 (도 2 및도 4) 비교합니다. 또한, 효소 세포 융합 분석을 사용하여, 우리는 VAMP1 단백질의 세포 표면 밀도의 세포 융합 활동의 의존도를 결정하고, 세포 융합 반응 8 VAMP1 단백질의 더 cooperativity을 관찰하지, 여러 올무 단지의 공동 작업이 필요하지 않습니다 것을 제안 세포 세포막을 융합합니다.
putative N-글리코 실화의 moti가 있습니다FS (Asn-X-Ser/Thr) 스네어 단백질 인치 N-글리코 실화가의 융합 활동이 올무 단백질 6 뒤집힌 억제하기 때문에 두 가지 방법이 뒤집혀 스네어 단백질의 글리코 실화를 방지하기 위해 사용되었습니다. 첫째, 글리코 실화 현장 변이가 올무 6을 구성 뒤집힌으로 소개합니다. 둘째, 같은 현재 프로토콜에서 설명한 N-글리코 실화 억제제의 tunicamycin (6.7 μg / ML)은 세포 융합 반응에 포함되어 있습니다. 또한, 0.67 밀리미터 DTT는 올무 융합 활동을 억제 것이다 뒤집힌 스네어 단백질 중 이황화 채권의 형성을 방지하기 위해 세포 융합 반응에 추가됩니다. 우리 실험은 6.7 μg / ML의 tunicamycin 및 세포 배양 매체에서 0.67 밀리미터 DTT의 추가는 COS-7 세포의 증식과 생존에 방해가되지 않는 것으로 나타났다. 우리는 정기적으로 V-및 T-세포 결합 후 24 시간에 세포 융합 반응을 해지 할 수 있습니다. 그러나, 중요한 올무로 인한 세포 융합은 v-를 결합 후 6 시간을 감지ND t-세포 8. 효소 세포 융합 반응은 세포 융합 후 β-갈 락토의 표현에 의존하기 때문에,이 판독 시스템의 시간 코스는 이성을 상실 스네어 단백질에 의해 중재 막 융합의 시간 코스를 lags.
효소 세포 융합 분석은 포유류의 세포에 잠재적 인 V-와 t-올무 상호 작용의 막 융합 활동을 조사에 대한 양적 reconstitution 분석을 제공합니다. coexpressing 규제 단백질 (예를 들어, Munc18)과 세포 표면이나 세포 융합 반응의 재조합 규제 단백질을 포함하여 올무으로이 분석은 스네어로 인한 막 융합의 규제 메커니즘을 명료하게하다하는 데 사용할 수 있습니다. 또한이 분석은 억제제 또는 올무로 인한 막 융합의 activators에 대한 높은 처리량 검사에서 응용 프로그램이 있어야합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원에서 루이스 빌과 CA135123 대학 (CH까지)에서 시작 자금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
