Summary
Nós desenvolvemos um ensaio de fusão de células que quantifica SNARE mediadas por eventos de fusão da membrana por expressão activada de β-galactosidase.
Abstract
As interacções dos SNARE (s factor de N-etilmaleimida sensível oluble ttachment um re ceptor de proteína) de proteínas em vesículas (v-SNAREs) e sobre as membranas-alvo (t-SNAREs) catalisam fusão das vesículas intracelulares 1-4. Os ensaios de reconstituição são essenciais para dissecar o mecanismo e regulação de SNARE mediada por fusão de membrana 5. Num ensaio de células de fusão 6,7, proteínas SNARE são expressos ectopicamente na superfície da célula. Estes "invertida" SNARE proteínas unidade de fusão célula-célula, demonstrando que SNAREs são suficientes para fundir as membranas celulares. Uma vez que o ensaio de fusão de células é baseada na análise microscópica, é menos eficaz quando utilizado para a análise múltipla v-e t-SNARE interacções quantitativamente.
Descrevemos aqui um novo ensaio que quantifica 8 SNARE mediadas por eventos de fusão de células activado por expressão de β-galactosidase. Doiscomponentes do sistema de expressão do gene Tet-Off 9 são utilizados como um sistema de leitura: o transactivador tetraciclina controlada (tTA) e um plasmídeo repórter que codifica para o gene LacZ sob o controlo do elemento de resposta a tetraciclina (TRE-LacZ). Nós tTA em transfectar células COS-7 que expressam invertidas v-SNARE proteínas na superfície da célula (V-células) e transfectam TRE-LacZ em células COS-7 que expressam invertida t-SNARE proteínas na superfície celular (células T) . SNARE dependente da fusão dos v-e t-células resulta na ligação de tTA a TRE, a activação da transcrição do LacZ e da expressão de β-galactosidase. A actividade de β-galactosidase é quantificado utilizando um método colorimétrico por absorvância a 420 nm.
As proteínas de vesículas associadas a membranas (Vamps) são v-SNAREs que residem em várias pós-Golgi compartimentos vesiculares 10-15. Ao expressar Vamps 1, 3, 4, 5, 7 e 8 no mesmo nível, compara-se a sua fusão de membranaactividades utilizando o ensaio enzimático de fusão celular. Com base em medições de espectrometria, este ensaio proporciona uma abordagem para a análise quantitativa SNARE mediada por fusão de membrana e de alto rendimento estudos.
Protocol
1. Cultura de Células e Transfecção
- Células COS-7 foram cultivadas em Meio de Dulbecco Modificado de Eagle (DMEM), suplementado com 4,5 g / l de glucose e 10% de soro fetal bovino (FBS).
- Transfecção de plasmídeo foi feito com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen).
2. Análise microscópica de fluorescência de células de expressão de superfície SNARE
- Um dia antes da transfecção, 3 × 10 4 células COS-7 foram semeadas em lamelas estéreis de 12 milímetros de vidro (Fisher Scientific), contidos em placas de 24 poços.
- Para v-células em cada cavidade, 0,25 ug do plasmídeo que codifica tTA (BRST-Off, CLONTECH) é co-transfectadas com 0,25 ng dos plasmídeos que expressam invertidas VAMPS.
- Para t-células em cada cavidade, 0,25 ug do plasmídeo que codifica TRE-LacZ (pBI-G, CLONTECH) é co-transfectadas com 0,25 ug de cada um dos plasmídeos que expressam invertidas SNAP-25 e syntaxins 1 ou 4.
- 24 horas após transfection, as células são fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS + + (PBS suplementado com 0,1 g / l de CaCl2 e 0,1 g / l de MgCl 2), durante 10 min e, em seguida, bloqueadas em FBS a 10% em PBS + +, durante 30 minutos.
- As células são incubadas durante 1,5 horas com os anti-Myc 9E10 anticorpos monoclonais (sobrenadante da cultura de hibridoma pura).
- Depois de quatro lavagens com PBS + +, as células são incubadas durante 1 hora com FITC-anticorpos secundários conjugados (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a uma diluição de 1:500.
- Depois de quatro lavagens com PBS + +, as células marcadas são montados em Prolongar reagente Antifade Gold (Invitrogen).
- Imagens confocal são coletados em um microscópio de varredura a laser confocal Olympus. As imagens são processadas com o software Adobe Photoshop.
3. Análise FACS de células de expressão de superfície SNARE
- Um dia antes da transfecção, 2 × 10 5 células COS-7 foram semeadas em cada poço de placas de 6 poços.
- 24 hr após transfection com o virado SNARE, BRST-Off e pBI-G plasmídeos, as células são fixadas com paraformaldeído a 1% em PBS + +, durante 15 minutos, e, em seguida, bloqueadas em FBS a 10% em PBS + +, durante 15 minutos.
- As células são incubadas com o anti-Myc 9E10 anticorpos monoclonais durante 60 min.
- Após três lavagens com PBS + +, as células são marcadas com FITC-conjugado de anticorpos secundários (diluição a 1:200) durante 45 min.
- Após três lavagens com PBS + +, as células são raspadas das placas com um raspador de células.
- 15.000 células são analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences). A intensidade média de fluorescência de cada amostra é obtido utilizando o software CellQuest Pro.
4. Ensaio de Fusão celular enzimática
- Um dia antes da transfecção, 1,2 x 10 6 células COS-7 foram semeadas em cada placa de cultura de tecidos de 100 mm e 2 x 10 5 células COS-7 foram semeadas em cada poço de placas de 6 poços.
- Para v-células, 0,5 - 5 mg cada de Flipped VAMP plasmídeo é co-transf ectadas com 5 ug de BRST-Off para dentro das células em cada placa de cultura de 100 mm. As células de controlo são co-transfectadas com o vector vazio pcDNA3.1 (+) e BRST-Off. Para impedir que o N-glicosilação de gáspeas 1, 4, 5, 7 e 8, tunicamicina (10 ug / ml) é incluída no meio de cultura celular durante a transfecção.
- Para t-células em cada poço das placas de 6 poços, 1 ug do virado SNAP-25 e plasmídeo pBI-G são co-transfectadas com 0,5 ug de plasmídeo ou invertida syntaxin1 0,05 ug de plasmídeo syntaxin4 invertida.
- 24 horas após a transfecção, o V-células são separadas de pratos de cultura com a enzima livre de dissociação celular Buffer (Invitrogen). As células destacadas são contadas com um hemocitómetro e novamente suspensas em HEPES-tampão DMEM suplementado com FBS a 10%, 6,7 ug / ml de tunicamicina e 0,67 mM de DTT.
- 4,8 x 10 5 ressuspenso v-As células são adicionadas a cada poço já contendo as células-T.
- Depois de 6, 12 ou 24 horas de ratos de 37 ° C em CO2 a 5%
- Após 90 min, a reacção colorimétrica é parada pela adição de carbonato de sódio 1 M.
- Absorvância a 420 nm é medida utilizando um espectrofotómetro de HITACHI 100-40.
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Representative Results
Para desenvolver um ensaio de fusão celular quantitativo, tiramos vantagem da activação transcricional forte pela ligação de tTA a TRE. Na ausência de tTA, a transcrição do gene LacZ em TRE-LacZ é silenciosa. Quando tTA estiver presente, liga-se ao TRE e activa a transcrição de LacZ. Figura 1 mostra um fluxograma do ensaio enzimático das células de fusão. tTA é transfectado em células que v-v-SNARE expressa proteínas na superfície celular, e TRE-LacZ é transfectado em células T que expressam t-SNARE proteínas na superfície da célula. Fusão dos v-e t-células resulta na ligação de tTA a TRE, a activação da transcrição de LacZ, e a expressão de β-galactosidase.
A Figura 2A ilustra a estrutura do domínio de construções SNARE invertidas. A sequência de sinal preprolactin é fundida ao N-terminais de SNAREs. Estes SNAREs engenharia são chamados de "virada"SNAREs porque a orientação de seus motivos SNARE contra membranas celulares é invertida. Quando células COS-7 foram transfectadas com plasmídeos virado SNARE, virado proteínas SNARE são expressos na superfície da célula (Figura 2B). A citometria de fluxo é utilizada para medir os níveis de expressão de proteínas SNARE na superfície celular (Figuras 2C e D). A fim de comparar as suas capacidades de fusão de membrana, vampiros precisam ser expressas no mesmo nível. Portanto, é titulada e optimizada a concentração de cada virado SNARE plasmídeo usado na transfecção. Plasmídeos invertidas SNARE são transfectadas nas seguintes concentrações (por 10 centímetros área de crescimento 2, ou seja, por poço em placas de 6 poços): VAMP1, 0,2 ug; VAMP3, 0,5 ug; VAMP4, 0,5 ug; VAMP5, 0,05 ug; VAMP7, 1,0 ug; VAMP8, 0,1 ug; syntaxin1, 0,5 ug; syntaxin4, 0,05 ug. tTA, TRE-LacZ e capotou SNAP-25 foram co a 1 mg por 10 cm 2 área de crescimento. Sob sucessocondições h, VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 e 8 são expressos no mesmo nível, enquanto syntaxins 1 e 4 são expressos no mesmo nível que a superfície celular (Figura 2D). Como mostrado por meio de análise confocal e de contraste de fase de imagem (Figura 2E), 80% das células COS-7 foram transfectadas com plasmídeos invertidas SNARE. A análise de imagem dupla marcação (Figura 2F), indica que 70% das células transfectadas v-expressar tanto o tTA e sacudiu proteínas VAMP. Uma vez que o gene LacZ em TRE-LacZ não é expressa, antes da fusão celular, que não são capazes de determinar a percentagem de células T transfectadas que expressam tanto TRE-LacZ e virado t-SNARE proteínas.
As SNAREs neuronais (v-SNARE VAMP2, e t-SNAREs syntaxin1 e SNAP-25), que medeiam a exocitose sináptica são usados para testar a viabilidade do ensaio. Na verdade, quando o V-células que expressam VAMP2 e células T expressando syntaxin1/SNAP-25 são combinados, robusto β-Galactosidase expressão é detectada (Figura 3). No entanto, quando um ou outro VAMP2 ou SNAP-25 não é expresso, apenas actividade basal β-galactosidase é detectado, o que indica que a fusão celular e da expressão de β-galactosidase dependem de interacções de v-e t-SNAREs. Estes resultados indicam que o ensaio de fusão de células enzimática identifica emparelhamentos fusogénicos entre v-e t-SNAREs eficientemente.
Expressando as proteínas VAMP ao mesmo nível da superfície celular (Figura 2D), compara-se as suas actividades de fusão de membrana. Com o t-SNAREs syntaxin1/SNAP-25, VAMPS 1, 3, e 8 têm comparáveis e as actividades mais elevadas de fusão, ao passo que o VAMPS 4 e 7 têm 50% e actividades de fusão inferiores a 30%, respectivamente (Figura 4). Em contraste, quando é combinado com VAMP5 as t-SNAREs, apenas actividade basal β-galactosidase é detectada (Fig. 4), sugerindo que VAMP5 não conduzir a fusão da membrana com o syntaxin1/SNAP-25.
Figura 1. Ensaio de fusão de células enzimática. tTA é co-transfectado com invertidas v-SNARE plasmídeos, e TRE-LacZ é co-transfectado com invertidas t-SNARE plasmídeos. A fusão de v-e t-células leva à ligação de tTA de TRE e a expressão de β-galactosidase, que é medida por um método colorimétrico.
Figura 2. Expressão dos SNAREs invertida na superfície da célula. (A) estrutura de domínio de SNAREs capotou. A sequência de sinal preprolactin (SS) é fundida com o N-terminais de SNAREs, e uma etiqueta Myc é inserida entre a sequência de sinal e os motivos SNARE (coiled-coil). (B) As células COS-7 foram co-transfectadas com o vector de tTA e vazio pcDNA3.1 (+) ou virado VAMP5 plasmídeo. 24hr após transfecção, as células unpermeabilized são coradas com um anticorpo monoclonal anti-Myc. Representante de segmento único imagens confocal são mostrados. (C e D), 24 h após a co-transfecção com tTA e pcDNA3.1 (+) ou virado vampiros (v-células), ou 24 horas após a co-transfecção com TRE-LacZ, virado SNAP-25 e syntaxins 1 ou 4 (células T- ), células unpermeabilized são corados com o anticorpo anti-Myc e analisadas por citometria de fluxo. (C) Os perfis representativos de FACS das células transfectadas com pcDNA3.1 (+) ou virado VAMP1 plasmídeo. A intensidade média de fluorescência de cada amostra é determinada utilizando o software CellQuest Pro. (D) Para expressar VAMPS no mesmo nível e expressa syntaxins 1 e 4 no mesmo nível que a superfície da célula, virado plasmídeos SNARE são transfectados em concentrações tituladas. São mostradas as intensidades médias de fluorescência de coloração da superfície celular das proteínas SNARE. As barras de erro representam o desvio padrão de 4 experiências independentes. (E e F), 24 h após cotransfe ction com tTA e sacudiu VAMP5 plasmídeo, as células são permeabilizados com 0,2% de Triton X-100 em PBS + + e (E) corados com o anticorpo anti-Myc, ou (F) manchado dupla com o anticorpo anti-Myc monoclonal e um anticorpo policlonal para o repressor tet (tTA de detectar). (E) são mostrados os confocal representante e imagens de contraste de fase. O número de células transfectadas que são etiquetados pelo anticorpo anti-Myc (VAMP5) e o número total de células no canal de contraste de fase são contados (n = 60 células), e a eficiência de transfecção é calculada (80%). (F) O número de células transfectadas que expressam tanto VAMP5 e tTA, e o número total de células transfectadas que expressam VAMP5, tTA ou ambos são contados (n = 75 células transfectadas). A percentagem das células transfectadas que expressam tanto VAMP5 tTA e é então calculada (70%). Barras de escala, 20 mM. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Fusão celular depende das interações de v-e t-SNAREs. v-células que expressa tTA e VAMP2 são incubadas com células T que expressam o TRE-LacZ, syntaxin1 e SNAP-25. Após 24 h, as células são lisadas e a actividade de β-galactosidase nos lisados das células é determinada utilizando um método colorimétrico por absorvância a 420 nm. Apenas basal actividade b-galactosidase é detectado quando quer invertida VAMP2 ou SNAP-25 plasmídeo é omitido da transfecção.
Figura 4. Comparação das actividades de fusão de vampiros. Sob condições de transfecção, Vamps otimizadas 1, 3, 4, 5, 7 e 8 são expressos no mesmo nível que a superfície celular de células-v. 24 horas depois de combinar o V-células com as células T, que express syntaxin1/SNAP-25, fusão celular é quantificada utilizando o ensaio enzimático de fusão celular. As barras de erro representam o desvio padrão de 4 experiências independentes. ** P <0,01; *** P <0,001 vs VAMP1.
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Discussion
O ensaio de fusão de células original, 6 determina SNARE mediadas por eventos de fusão de células por microscopia de fluorescência. Descrevemos aqui um ensaio que quantifica inovador SNARE mediadas por eventos de fusão de células activado por expressão de β-galactosidase e medição espectrométrica. Utilizando este ensaio, que rotineiramente analisar 15-20 v-e t-SNARE combinações em uma única experiência. Utilizando citometria de fluxo para medir a expressão SNARE na superfície da célula, é titular os níveis de expressão de gáspeas e comparar as suas capacidades de membrana de fusão (Figuras 2 e 4). Além disso, utilizando o ensaio de fusão de células enzimática, determinou-se a dependência da actividade de fusão célula a densidade da superfície da célula de VAMP1 proteína, e não observaram qualquer cooperatividade da VAMP1 proteína de fusão na célula de reacção 8, sugerindo que a acção concertada de vários complexos SNARE não é necessária para fundir as membranas celulares.
Há moti N-glicosilação putativafs (Asn-X-Ser/Thr) em proteínas SNARE. Por causa de N-glicosilação inibe as actividades de fusão de proteínas SNARE virado 6, duas abordagens têm sido usados para evitar a glicosilação de proteínas invertidas SNARE. Em primeiro lugar, a glicosilação local mutações são introduzidas virado SNARE constrói 6. Em segundo lugar, tal como descrito no protocolo de corrente, a tunicamicina inibidor de N-glicosilação (6,7 ug / ml) é incluída na reacção de fusão celular. Além disso, 0,67 mM de DTT é adicionada na reacção de fusão de células para evitar a formação de ligações dissulfureto entre as proteínas SNARE invertida, o que inibe as actividades de fusão SNARE. As nossas experiências mostraram que a adição de 6,7 ng / ml e 0,67 tunicamicina DTT mM em meio de cultura de células não interfere com a proliferação e sobrevivência de células COS-7. Rotineiramente terminar a reacção de fusão de células em 24 horas depois de se combinar v-e células-T. No entanto, a fusão celular significativa SNARE mediada é detectado após 6 horas combinando um v-nd t-células 8. Porque a reacção enzimática fusão celular depende da expressão de β-galactosidase após a fusão celular, o curso de tempo do presente sistema de leitura fica ao longo do tempo de fusão mediada por proteínas de membrana invertidas SNARE.
O ensaio de fusão de células enzimática oferece um ensaio de reconstituição quantitativa para examinar a actividade de fusão de membrana de potenciais e v-t-SNARE interações em células de mamíferos. Por proteínas coexpressing reguladoras (por exemplo, Munc18) e laços na superfície celular ou através da inclusão de proteínas recombinantes reguladoras na reacção de fusão celular, este ensaio pode ser utilizado para elucidar os mecanismos de regulação da SNARE mediada por fusão membranar. Além disso, este ensaio deve ter aplicações em high-throughput screening para inibidores ou activadores de SNARE mediada por fusão membranar.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por fundos de inicialização da Universidade de Louisville e CA135123 dos Institutos Nacionais de Saúde (para CH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
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