Summary
후각 신호는 곤충의 여러 가지 행동을 중재하고, 휘발성 화합물의 수백 수십 구성 종종 복합 혼합물이다. 곤충 antennal 엽의 멀티 채널 녹음과 가스 크로마토 그래피를 사용하여, 우리는 bioactive 화합물의 식별하는 방법을 설명합니다.
Abstract
모든 생물은 환경에 자신의 행동 및 생리적 반응을 결정하는 감각 자극으로 가득 찬 세상을 살고 있습니다. 후각은에 응답하고, 사이, 복잡한 냄새 자극을 차별하기 위해 후각 시스템을 사용 곤충에 특히 중요합니다. 이 냄새는 재생산 및 서식지 선택 1-3로 프로세스를 중재하는 행동을 이끌어내는. 또한, 수분 4-6 식품 작물 7 herbivory, 질병 8,9의 전송을 포함하여 농업과 인간의 건강을 위해 매우 중요 곤충의 mediates 동작에 의한 화학 감지. 후각 신호와 곤충 행동에서의 역할 확인은 생태 학적 프로세스와 인간의 음식 자원과 웰빙을 모두 이해하는 따라서 중요합니다.
현재까지, 곤충의 행동을 유도 휘발성 물질의 식별이 어렵고 종종 지루한했다. 현재 기술은 다음과 같습니다가스 크로마토 그래피 결합 electroantennogram 기록 (GC-EAG) 및 가스 단일 sensillum 레코딩 (GC-SSR) 10-12를 크로마토 그래피 - 커플 링. 이 기술은 bioactive 화합물의 식별에 중요한 것으로 판명. 13,14, 우리는 antennal 엽에있는 뉴런 (곤충의 기본 후각 센터 AL)에서 멀티 채널 electrophysiological 레코딩 ( 'GCMR'이라고한다)에 커플 링 된 가스 크로마토 그래피를 사용하는 방법을 개발했습니다. 이 최신 기술은 우리가 냄새 정보가 곤충 뇌에 표시하는 방법을 조사 할 수 있습니다. 후각 처리의 수준 냄새에 신경 응답이 AL의 뉴런에 안테나의 수용체 뉴런의 수렴의 정도에 매우 민감 인하여 때문에 또한, AL 녹음은 자연 냄새 효율적이고 고감도로의 활성 성분의 검출을 할 수 있습니다. 여기 GCMR을 설명하고 사용 예를 제공합니다.
몇몇 일반적인 단계는 invol 아르bioactive 휘발성 물질과 곤충 응답의 검출에 ved. 휘발성 물질 먼저 관심 소스에서 수집 (이 예에서 우리는 속 Mimulus (Phyrmaceae)에서 꽃을 사용) 및 표준 GC-MS 기술에게 14-16를 사용하여 필요에 따라 특징해야합니다. 곤충은 기록 전극이 신경 녹음이 시작 antennal 엽 및 다중 채널에 삽입 된 후, 최소한의 절개를 사용하여 학습을위한 준비가되어 있습니다. 신경 데이터의 후 처리는 특정 odorants는 곤충 신경계에서 중요한 신경 반응의 원인이되는 드러내고있다.
우리가 여기에 제시 예는 수분 연구에 특정한이지만, GCMR는 연구 생물 및 휘발성 소스의 광범위한 확장 할 수 있습니다. 예를 들어,이 방법은 odorants 벡터 곤충, 농작물 해충을 끌거나 repelling의 식별에 사용할 수 있습니다. 또한, GCMR는 또한 PO 등의 유익 곤충에 대한 attractants를 식별하는 데 사용할 수 있습니다llinators. 기술은뿐만 아니라 비 곤충 분야로 확대 할 수 있습니다.
Protocol
1. 휘발성 Follection
- 이 예제에서, 우리는 M.에서 휘발성 샘플을 사용하여 lewisii 꽃 - 캘리포니아에 고산 야생화의 기본. 휘발성 물질이 Riffell 외에 따라 동적 흡착 방법을 사용하여 수집하고 있습니다. 14. 간단히,이 방법은 꽃이 테플론 백에 동봉되는 폐 루프 트래핑 시스템을 사용합니다. 불활성 진공 펌프 사용하여 꽃 주변의 공기는 Porapak Q 행렬로 가득 파스퇴르 피펫으로 구성 "덫"을 통해 형편입니다. 펌프의 반환 공기는 활성탄에 의해 필터링됩니다. 소정의 기간 후에, 우리의 경우 24 H에, Porapak Q 행렬은 집중 추출물를 수집하기 위해, 비 극지 용매, 일반적으로 헥산으로 용출되어 있습니다. 추출물 그런 다음 -80 ° C에서 분석 될 때까지 저장됩니다. 필요한 경우, 샘플은 질소 가스의 흐름에 따라 사전 분석에 집중 할 수 있습니다. 샘플은 이미 잘 - 특징 않는 한,를 통해 그것을 나누어지는을 실행기체 크로마토 그래프 - 질량 분석기 (GC-MS)는 샘플을 사용하기 전에 휘발성 구성 요소를 식별합니다.
2. Electrophysiological 준비
- 1000 μl 피펫 팁의 끝에서 약 1cm를 자른다. 피펫 팁의 기본에 범블비 (Bombus impatiens)를 놓고는 머리가 노출 될 때까지 부드럽게 끝의 반대쪽으로 밀어.
- 치과 왁스를 녹여 및 보안에 대한 화합물 눈 위에와 왁스 준수는 꿀벌의 머리가 완전히 고정되어 만들 수 있는지 확인하기, 노출 된 머리 주위를 뜨는거야. 벌의 안테나에 어떤 왁스를하지 않도록주의하십시오.
- 머리가 안전하면, 면도기 블레이드 - 차단기 나 큐티클을 잘라 할 메스 적절한 크기를 사용하여 헤드 캡슐로 광장, 윈도우 같은 절개를합니다. 블레이드 - 차단기를 사용하여 즉시 화합물 눈에 안테나와 인접 하나 뒤에, 머리 캡슐의 등 측면에서 시작합니다. 절단한 화합물 눈에서 contralateral 화합물 눈에 직선. 반대 화합물 눈에 직선을 절단 한 후, 그 가슴 근처의 헤드 캡슐 곡선과 끝날 때까지 dorsally 절개을 시작합니다. 이 시점에서, 머리 캡슐의 반대 끝 부분 절단하기 시작합니다. 마지막으로, 한 번 줄이 반대쪽으로 절단되었습니다 초기 절개의 시작 위치로 다시 줄을 잘라. 이 전극의 삽입을 방해하므로 그것은 안테나에 인접 해 있습니다 큐티클을 제거하는 것이 중요합니다.
- 큐티클을 잘라되면 다음 벌의 뇌를 노출하고, 더 중요한 것은 antennal 엽해야 벌의 큐티클을 제거 포셉 한 쌍의를 사용합니다. 바로 뇌 dessicated이되지 않도록, 곤충 식염수 뇌를 superfusing 시작합니다. 뇌가 노출되면 조심스럽게 즉시 antennal 엽 위의 perineural 피복을 제거하는 아주 좋은 포셉 한 쌍의를 사용합니다. 정말 조심해야하지에포셉과 구멍 벌의 뇌를.
3. 멀티 채널 녹음과 가스 크로마토 그래피
- 벌 "준비"- 뇌의 노출이있는 튜브에서 수정이 - 지금 electrophysiological 레코딩을위한 준비가되었습니다. 공기 테이블에 자리 잡고 있습니다 자기베이스에 고정 클램프의 벌을 배치합니다.
- IV 가방, 흐름 컨트롤러, 그리고 생리가 계속 뇌를 superfuses 있도록 튜브를 (곤충 생리가 가득) 준비합니다.
- 벌의 눈에, 텅스텐 와이어로 만든 micromanipulator, insertareference 전극을 사용합니다.
- 별도의 micromanipulator를 사용, 이러한 코일 와이어 tetrode, 또는 실리콘 멀티 채널 전극 (Neuronexus 기술)로, 멀티 채널 전극을 삽입 벌의 antennal 엽에. 이 전극 등의 가열 치사 시스템의 Z-버스 bioamp 프로세서에 가열 치사 시스템의 S-3 Z 시리즈와 같은 사전 증폭기에 연결되어 있습니다. 가스 Chro의 출력차폐 된 BNC 케이블을 통해 matogram의 감지기가 모두 신경 및 GC 신호가 동기화되는 등의 증폭기 및 데이터 수집 시스템과 인터페이스 할 수 있습니다.
- 안정화 할 수있는 신경 레코딩을위한 약 30~60분 기다립니다. 자연 활동 및 녹화 채널에 단위의 파형 모양이 일관성이되었습니다되면, 벌을 자극하고 냄새에 기록 채널의 반응을 관찰하는 악취 주사기를 사용합니다.
- 에 의해 뉴런의 세포 스파이크를 기록 자동 임계 값 각 기록 채널에서 신호의 3.5-5 시그마하여 녹화 채널을. 수동 임계 값은 전기 노이즈의 오염을 방지하기 위해 일부 채널 필요할 수 있습니다. 뉴런의 활동 전위가 기록 채널에 전압 스파이크로 표시됩니다. 채널의 전압이 임계 값을 초과하면 시스템은이를 실려, 임계의 교차로 전후 몇 밀리 초 버퍼 및 저장GA는 파형의 스냅 샷, 또는 스파이크.
- 바로이 공기 테이블 옆에있는 GC입니다. GC에 꽃 추출물을 주입하기 전에 GC 실행의 온도 램프를위한 방법이 올바른지 확인하십시오. 우리 예제에서, 우리는 10 ° C / 분의 속도로 온도의 증가에 이어 4 분 50에서 시작 온도 방법 ° C를 사용합니다. 220 ° 우리가 추가 6 분의 GC을 보유하고있는 시간에 C,. 우리는 캐리어 가스로 헬륨이있는 DB-5 GC 컬럼 (J & W 과학, Folsom, CA, USA)를 사용합니다. 입구는 200 ° C.로 설정 온도, splitless입니다 불꽃 이온화 검출기 온도는 230 ° C.로 설정되어 있습니다
- GC 칼럼으로 adsorbed 휘발성 물질을 해제 할 수있는 GC의 온수 주입 포트에 꽃 천정 공간의 추출물 샘플을 주입. 열에서 유출 물은 불꽃 이온화 검출기 (FID) 및 유리 "Y"커넥터 (J & W 과학)를 사용하여 벌 안테나 사이에 1:1 분할되어 있습니다. REC를 시작당신은 GC에 샘플을 투입으로 전극에서 ording.
- GC 실행 완료 후, 5 15 분을 위해 준비 나머지를 보자. 그런 다음 GC에 다른 샘플을 주입 또는 단일 휘발성 화합물 또는 화합물의 혼합물을 사용하여 준비를 자극한다. 준비를 자극이 후자의 방법에서는 일정한 공기 흐름에서 공기의 펄스는 화합물이 증착 된되는 필터 종이를 포함하는 유리 주사기를 통해 우회합니다. 냄새 자극은 소프트웨어에 의해 제어 솔레노이드가 활성화 된 밸브에 의해 펄스되었습니다.
- 단위 활동이 갑자기 중단하거나 변경할 경우, 생리 똑을 확인하고 15 분 동안 준비 나머지를 보자. 자연 활동이 이전 수준을 회복하지 않으면 사용 가능한 경우 다음 준비는 폐기하고 다른 꿀벌이 사용되어야합니다.
- 실험 후, 여전히 조직의 프로브와 20 분에 포르말린 5퍼센트으로 뇌를 해결할 수 있습니다. 다음, 소비세 뇌그리고 4 시간에 2 % 글 루타 알데히드에 배치하고, 이후 등급 에탄올 탈수 시리즈를 수행하고 살리실산 메틸과 뇌를 취소합니다. 조직, 전극의 조직은 공 촛점 현미경에 의해 명확하게 알아볼 수 있어야합니다 구멍을 AL에있는 위치의 고정과 개간을 기반으로합니다.
4. 데이터 분석
- 분석은 기록 된 신경 단위를 분리하고 식별 할 수있는 실험 후 데이터를 수집했습니다. 이러한 피크 또는 계곡 진폭, 최대 반폭 등의 스파이크 모양, 또는 감소 조치에 따라 별도의 파형, 또는 "스파이크"(주요 구성 요소) 17 일반적인 소프트웨어 프로그램을 (오프라인 정렬 기, MClust 및 SClust)를 사용 18 (그림 2). 3 차원 공간에서 분리 (PC1-PC3)과 서로의 통계적 다른 것을 스파이크의 만 클러스터를 사용합니다 (변수 ANOVA, P <0.05) (그림 2) 추가 분석을 위해. 를 참조하십시오tetrode 기록과 스파이크 - 정렬 방법에 대한 자세한 설명을위한 인용 # S 17-19.
- 시간 스탬프 각 클러스터에 스파이크하고, 래스터 플롯과 발사 속도 응답 (도 2, 3A)를 만들 MATLAB 또는 Neuroexplorer을 (Nex 기술, 윈스턴 세일럼, NC)를 사용하여 분석을 위해 이러한 데이터를 내보낼 수도 있습니다.
- 동시에 기록 GC 데이터를 사용 휘발성 물질의 유지 시간을 확인합니다. 그 시간 지점에서 단위 반응을 검사 할 크로마토 그램의 피크의 꼭대기에 의해 결정 휘발성 물질의 보유 시간을 사용합니다.
- GC 실행을 통해 각 단위 반응을 확인하려면, 100 밀리 초 간격으로 스파이크의 개수 및 bin 및 휘발성 물질을 용출의 보존 기간을 참조하여 속도 응답을 해고의 시간 과정을 검토합니다. 100 밀리 초 간격의 스파이크의 binning는 GC에서 용출 odorant에 neuronal 응답의 시간 코스에 대해, 충분히 상세하게, 또는 신호를 제공합니다.
- EXA에다른 용출의 휘발성 물질에 인구 응답을 채굴, 전에 3 초 샘플링 창을 통해 1.5 초를 개별 단위의 발사 속도 응답을 통합하고, 1.5 초 후의 보존 기간 휘발성 (그림 3). 이 기간은 GC에서 휘발성 용출 기간의 전형적인 있습니다. 및 (열) GC 유출에 앙상블 응답을 나타내는 각 행과 활동 매트릭스로를 준비하고 (; 우리는이 색상 코딩을 (파란색은 낮은 응답입니다 빨간색이 높은 발사 속도 응답이다) 단위의 속도 응답을 발사 보여 그림 3).
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Representative Results
M.를 사용하여 GCMR 분석에서 lewisii 꽃 향기가, 우리는 GC에 추출물의 3 μl를 삽입. GC를 통해 용출 휘발성 물질의 총 수는 일반적으로 60-70 휘발성 물질입니다. M.의 향기 lewisii는 주로 여섯 탄소 등 2 헥산 올과 같은 휘발성 물질, 그리고 천정 공간의 <1 %를 구성하는 sesquiterpenoids로 구성된 향기의 나머지 부분과 함께, β-myrcene (acyclic)와 α-피넨 포함 monoterpenoids로 구성되어 있습니다.
GCMR는 antennal 엽의 뉴런의 감도뿐만 아니라 생물학적으로 중요한 휘발성 물질의 neuronal 처리를 활용합니다. 그러나,이 자연의 멀티 채널 녹음이 효과에 antennal 엽에있는 뉴런의 무작위 표본을 채취하시면됩니다. 다른 준비 사이의 프로브 위치의 위치에 약간의 변화가 기록 배열이 다른 뉴런를 맛보실가 발생할 수 있기 때문입니다. 또한, 정확한 위치 및 모녹음이 세포이기 때문에 기록 된 뉴런의 rphologies를 알 수 있습니다. 이러한 효과에 대한 수용하기 위해, 우리는 일반적으로 각 준비 8-18 신경 단위, 8-16 준비를 GCMR 실험을 실행합니다. 그림의 목적을 위해, 그러나, 우리는 하나의 준비 (8 단위)의 데이터를 사용합니다.
GCMR 실험에서, 우리는 단위가도 3a에 도시 등 휘발성 물질에 대한 그들의 반응에 놀라 울 선택적 것을 발견했습니다. 낮은 성분은 (검은 색) 각 피크가 시간이 지남에 따라 검출기에 도착되는 특정 휘발성에 해당하는 이온 크로마토 그램을 나타냅니다. 상위 추적 (파란색)는 장치의 가열 율 응답을 보여줍니다. 단위 응답 binning 100 밀리 초 간격에서 생산 스파이크의 숫자 계산, 그리고 속도를 생성하기 위해 그 기간에 의해 분할되었다. 의 예에서, 신경 단위는 D-리모넨에 대응 선택적입니다. 참고로,이 단위에서, 자연 서지g 속도는 여전히 변수 및 랜덤 변동에 따라 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, D-리모넨에 대한 답변 시간을 통해 발사 속도 응답의 차이에 의해 계산으로 잘 95 % 신뢰 구간 위에 있었다.
모든 단위는하지만, GC에서 용출 휘발성 물질에 응답했습니다. 사실은, 평균에 각 앙상블의 기록 단위의 약 50 %는 (그림 3B) 응답했다. 이것은 GC에서 용출되는 꽃 천정 공간의 휘발성 화합물의 다양성 주어진 놀라운 것입니다. 그러나, 앙상블의 비 응답 단위의 비율은 이전의 연구 13,14에서 발견 준비 사이 놀라 울 정도로 일치합니다.
단일 장치의 응답 외에도, GCMR 시스템은 또한 GC에서 용출 odorants에 인구 수준의 응답의 분석을 할 수 있습니다. 여기에 표시된 예에서는 여러 odorants의 그룹에 대한 강력한 앙상블 선택성이 있습니다 (
1 그림. 헤드 스페이스 흡착 및 GCMR 시스템의 개략도가. (A) 도식에서 꽃이 테플론 백 둘러싸인 및 진공 펌프를 사용하고, 가방에서 공기를 집중 휘발성 트랩 (Porapak Q)를 통해 빨아들입니다 휘발성 물질을 방출. 공기 필터와 동봉 된 꽃 반환됩니다. (B) 꽃 천정 공간의 추출 샘플이 주입됩니다GC에서 에드와 열에서 유출 물이 흐름 등 그 절반도 GC의 불꽃 이온화 검출기를 입력 분할되고, 유출의 절반이 온수 전송 라인에 의해 수행되고 벌의 안테나에 동시에 도착합니다. AL 신경의 앙상블에서 활동 전위는 지속적으로 GC를 통해 악취 인도의 20 분 동안 extracellularly 기록됩니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 단위의 정렬은 최고 AL의 멀티 채널 녹음 배열 (MR)를 사용하여 기록했다. 두 정강이 배열 AL의 큰 볼륨을 포함하는 등 간격을두고 있습니다. (A) 파형 특성 (예 : A tetrode 기록의 각 "스파이크"의 litude, 계곡)은 3 차원 공간에서 역모를 할 수 있습니다. 여기에 표시된 예에서 4 녹화 채널의 3 각 스파이크의 높이가 3-D에 도시된다. 각 장치가 자신의 스파이크 모양을 가지고 있기 때문에, 해당 단위에서 스파이크함으로써 단위를 식별하고 서로 정렬 할 수 있도록 함께 클러스터 것입니다. 그리고 glomeruli 및 neuropil을 처리 내에서 광범위한 영역의 기록을 제공 각 생크는 4 채널의 파형 모양 (C) 위치, 정렬 단위는 명확 해고 응답의 차이 (래스터 플롯 B)를 보여 주었다. 신경 활동이 4 개의 채널 각각에 기록 된 (등 참조) 3 차원 공간에서 역모를하고, 파형의 특성에 따라 정렬. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. (A) M.에서 용출 물질에 단위 응답 속도 histograms 발사 lewisii 헤드 스페이스 추출 (3 μl 주입) (하단 추적, 블랙). 특정 odorants (예 : D-리모넨, 빨간색 화살표) 단위로 상당한 반응을 evoked GC에서 용출 각 odorant에 MR에서 기록 된 모든 단위의 (B) 응답합니다.. 표면 줄거리는 개별 단위의 정규화 된 발사 속도 응답에 따라 색으로 구분되어 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
곤충 후각로 인한 행동이 복제, 호스트 사이트 선택, 적절한 음식 자원의 식별 등을 포함하여 다양한 프로세스를 운전합니다. 이러한 프로세스의 연구는 소스뿐만 아니라 행동을 중재 아르 이러한 화합물을 식별 할 수있는 능력에서 방출 된 휘발성 물질을 식별 할 수있는 능력이 필요합니다. 문제를 복잡하게하는 것은 냄새가 함께 각각의 성분 6,7,13,19,20 다르게 인식되고 독특한 향을 만들어 각각의 화합물의 수백 수십 구성된다는 것입니다. 처음 성 페로몬 시스템 12 실시 연구, 그리고 더 최근의 식품 및 산란 관련 냄새 13,20에서, 혼합물의 행동 효과는 혼합에 몇, 주요 휘발성 물질의 함수로 거주하는 것으로 나타하고 있습니다 혼합물은 개별 성분보다 훨씬 더 큰 행동 반응을 이끌어내는 것을. 그 키를 식별성분 따라서 현대 화학 생태뿐만 아니라 후각 신경 생물학의 중요한 구성 요소입니다.
기술의 다양한 곤충의 행동을 유도하는 bioactive 화합물의 식별을 위해 지난 50 년 동안 발현. 곤충 안테나에 의한 휘발성 물질의 검출을위한 주요 기술은 기체 크로마토 그래피 - electroantennography (GC-EAG)입니다. EAG는 원래 일반적으로 자극하는 동안 곤충 안테나의 끝과베이스 사이에 많은 후각 뉴런의 전기 depolarisations에 의해 야기 할 가정 작은 전압 변동을 기록 슈나이더 21에 의해 개발되었다. EAG는 나중에 antennal 응답 할 12,22을 이끌어내는 헤드 스페이스 휘발성 물질의 정확한 식별을위한 GC와 통합되었습니다. 또한, 곤충 안테나에서 각각의 수용체 뉴런의 기록은 나중에 11,23을 개발 및 단일 sensillum 녹음, 또는 GC-SSR을 제공하기 위해 GC와 결합.lthough GC-SSR 더 시간이 많이 어려운 GC-EAG보다, 녹음은 GC-유출 물에 대한 응답으로 작업 잠재력을 통해 각 세포 반응에 대한 정보를 제공하고, 특정 화합물에 대한 전문 아르 그 수용체의 식별을 허용 GC-EAG (24)에 의해 놓친 될 수 있습니다.
GC-EAG와 GC-SSR 기법은 주변에서 응답을 이끌어내는 그 휘발성 물질의 식별을 제공하며, 따라서 odorant 리셉션에 참여하고 있습니다. 최근 기술은 포유류와 곤충 모두의 중추 신경계에 대한 답변을 검토하기 시작했습니다, 그래서 odorant의 인식에 관여하고 있습니다. 이 기술은 두 광범위한 카테고리에 해당 : 이미징 방법 25 GC-I (가스 크로마토 그래피 - 이미지)와 직접 electrophysiological 방법 (예 : GCMR)이라고한다. GC-I와 GCMR 때문에 투영, 또는 출력에 감각 뉴런의 융합,에서 뉴런의 몇 가지 장점을 제공합니다AL뿐만 아니라, 이러한 방법이 odorants이 곤충 뇌에 표시하는 방법의 결정을 허용. 또한, 유사한 방법 이제 포유류의 뇌 25 사용하고 있습니다.
이러한 장점에도 불구하고, GCMR 및 GC-I도 단점을 제공합니다. 데이터 분석 시간이 소요 될 수 있으며, GCMR의 경우, 기록 된 신경 단위의 사구체 계획은 세포중인 녹음으로 인해 알 수없는 수 있습니다. 또한, 곤충 AL은 프로젝션 뉴런 (PNs) 그래서 어려운 기록 단위의 식별을 지역 interneurons (LNs)를 포함하여 여러 가지 neuronal 종류에 의해 innervated입니다. 그러나, 나방에서 M. sexta, 최근 작품 PNs와 LNs은 따라서 자신의 자발적인 활동 (26)에 의해 다음 뉴런 유형의 식별을 허용, 뉴런의 난리 행동에 의해 식별 될 수 있다는 증명했다. 그럼에도 불구하고, GCMR 및 GC-I는 odorants의 식별을 허용하는 activat강력한 EAG 응답뿐만 아니라 결정을 유도하지 않을 수 있습니다 전자 전문 수용체 뉴런이 어떻게 뇌 과정에서 뉴런 휘발성 물질의 인구. 우리의 예비 데이터가 GCMR보다 더 적당 할 수 있다고하지만 서로 다른 방법을 비교 연구는 아직 진행되지 않은 GC-EAG bioactive이지만 추출물 (Riffell되지 않은 결과)의 추적 수준에 있습니다 그 화합물에. 미래의 작업은 서로 다른 방법론 사이의 분석 시간 bioactive odorants을 검출의 감도에 무역 - 오프를 검토 할 수 있습니다.
우리는 B. 사용 분석 방법을 자세히 설명을 여기에 집중했지만 impatiens의 꿀벌과 M.의 향기 lewisii, 추출물 및 특정 수정 사항이있는 경우 사용 된 곤충 종 변경 될 수 있습니다. 곤충 종들은 크기에 따라 다른 피펫 팁 (10-200 μl)로 배치 할 수 있습니다. 나방, Manduca 같은 큰 종sexta는, 6 ML 샘플 병에 배치 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 준비가 살아이를 안정적으로 레코딩 할 기간이 몇 시간을 허용 보관됩니다.
화합물의 분리에 대한 분석 방법은 bioactive 화합물의 식별을위한 곤충 뇌 현재 강력한 도구의 electrophysiological 녹음과 함께 함께 촬영하고, 행동 실험과 함께 사용하는 경우, 식품 관련 위해 중요한 휘발성 물질을 결정하여 수단을 제공 할 수 있습니다 곤충 13 행동뿐만 아니라 호스트 사이트 2에 관련된 사람들, 농업 해충과 질병의 벡터에 중요한 혈액 호스트 관련 행위 27.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NSF 기금 IOS 1,121,692에 의해, 워싱턴의 연구 재단의 대학에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Porapak Type Q 80-100 mesh | Waters | WAT027060 | |
| Reynolds Oven Bags | Reynolds | ||
| GC | Agilent | 7820A | |
| GC column | J&W Scientific, Folsom, CA, USA | DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm) | |
| Analytical helium carrier gas | Praxair | HE K | 1 cc/min |
| 16-channel silicon electrode | Neuronexus Technologies | a4x4-3mm50-177 | |
| Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) | Sandvik Kanthal HP Reid | PX000004 | For making custom tetrodes and stereotrodes |
| Pre-amplifier | Tucker-Davis System | PZ-2 | |
| Amplifier | Tucker-Davis System | RZ-2 | |
| Data acquisition system - OpenEx suite | Tucker-Davis System | ||
| Online spike-sorting software - SpikePac | Tucker-Davis System | ||
| Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox | David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota | Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html | MATLAB toolbox |
References
- Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
- Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
- Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
- Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
- De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
- Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
- Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
- Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
- Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.
- Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
- Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
- Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098 (2009).
- Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282 (2011).
- Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
- Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
- Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
- Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
- Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
- Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
- Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
- Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
- Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).
