Summary
嗅觉介导许多不同的昆虫的行为，并经常由数十至数百种挥发性化合物组成的复杂混合物。气相色谱法与多通道记录在昆虫触角叶中，我们描述的生物活性化合物的鉴定方法。
Abstract
所有的生物体生活在一个世界充满感官刺激，确定其所处的环境行为和生理反应。嗅觉是特别重要的昆虫，它用自己的嗅觉系统响应和歧视之中，复杂的刺激气味。这些气味引起的行为，调解过程，如繁殖和栖息地选择1-3。此外，化学传感由昆虫介导的行为，农业和人类健康是非常重要的，其中包括4-6，草食动物的粮食作物7，授粉和传播疾病8,9。因此，在昆虫行为的嗅觉信号，其作用是识别重要的，了解生态过程和人类的食物资源和福祉。
至目前为止，已经难以识别驱动昆虫行为的挥发性物质，往往是乏味。目前的技术包括：气相色谱耦合电生理记录（GC-EAG）和气相色谱耦合的单感器录音（GC-SSR）10-12。这些技术被证明是重要的生物活性化合物的鉴定。我们已经开发出一种方法，使用气相色谱多通道电生理的录音（称为“GCMR”）的神经元在触角叶（AL;昆虫的嗅觉中枢）13,14。这个国家的最先进的技术使我们能够探测气味信息是如何表示的昆虫的大脑。此外，因为在这个级别的嗅觉处理神经元对气味的反应是非常敏感的，因为天线AL神经元的受体神经元到收敛的程度，AL录音可以让活性成分自然的气味，高效和高灵敏度的检测。在这里，我们描述GCMR举一个例子，它的使用。
一些一般的步骤是国际富豪的ved检测生物活性挥发物和昆虫响应。挥发物，首先需要收集的利益来源（在这个例子中，我们使用花沟酸浆属 （属Phyrmaceae）），其特征为需要使用标准的GC-MS技术14-16。昆虫准备用最小的解剖研究，之后记录电极插入触角叶，多渠道的神经开始录制的。处理后的神经数据，然后显示特定的气味分子的昆虫的神经系统造成显着的神经反应。
虽然我们在这里给出的例子中特定授粉研究，GCMR可以扩大到范围广泛的研究生物和挥发性来源。例如，此方法可用于在吸引或排斥矢量昆虫和作物害虫的加臭剂的识别。此外，GCMR也可以被用来识别有益昆虫的引诱剂，如婆llinators。该技术可以扩展到非昆虫科目以及。
Protocol
1。挥发性Follection
- 在这个例子中，我们使用挥发性样品M. lewisii花-高山野花原产于美国加州。收集挥发物，采用动态吸附方法，根据到Riffell 等。14。简单地说，该方法采用一个闭环特氟隆包括在花捕集系统。使用的惰性的真空泵，花的周围空气被吸入，通过一个“陷阱”巴斯德吸管包括充满PORAPAK Q矩阵。从泵的返回空气通过活性炭过滤。一规定时间周期之后，在我们的情况下24小时，PORAPAK Q矩阵，用一种非极性溶剂中，典型的己烷洗脱，收集的浓缩提取物。的提取物，然后储存于-80℃直至分析。如果有必要，样品可以被集中在分析之前，下的氮气流。除非样品良好的特点，运行等分，它通过一个气相色谱 - 质谱（GC-MS）使用样品之前确定挥发性成分。
2。电准备
- 剪切约1厘米，从1,000微升的移液管尖的末尾。放置一个熊蜂（ 熊蜂的凤仙花 ）到移液管尖端部的基础上，并轻轻推向相对端的前端，直到只有头部露出。
- 牙科用蜡融化，并在外露的头，模具的蜡附着在安全的复眼，使蜜蜂的头部完全不动。请务必不要让任何到天线的蜜蜂蜡。
- 一旦头是安全的，做成正方形，窗口等，切口进入头部胶囊用剃刀刀片断路器或适当大小的手术刀切角质层。使用刀片的断路器，从背侧的头壳，紧接后面的天线和相邻的一个的化合物眼。切一条直线上，从一个复眼对侧复眼。直线切割后到对面的复眼，开始做一个切口，背部，直到头壳曲线和其胸部两端附近。在这一点上，朝向头部胶囊的相对端开始削减。最后，一旦一条线被切断的相对端，切断回线的初始切口到起始位置。重要的是要除去角质层是相邻天线，因为这会妨碍插入电极。
- 的角质层被切断后，使用钳子删除蜂角质层，然后公开蜜蜂的大脑，更重要的是，在触角叶。立即开始与昆虫盐水，superfusing大脑，使大脑不成为dessicated的。后大脑暴露出来，仔细一对非常细小的镊子以上的触角叶外周神经鞘立即删除。要非常小心，不蜜蜂的大脑穿刺的镊子。
3。气相色谱与多声道录音
- 蜜蜂“准备” - 管固定在它的大脑暴露 - 现在是准备好电生理记录。将蜜蜂，固定在夹具的磁基地，位于空气表。
- 安排的输液袋，流量控制器，和油管（充满昆虫盐水），以便，盐水连续superfuses大脑。
- 使用一台显微操作，insertareference电极，钨丝，到蜜蜂的眼睛。
- 使用一个单独的微操纵器，如一个螺旋线的四极管，或硅的多通道电极（Neuronexus技术），插入的多通道电极， 到的蜜蜂触角叶。此电极被连接到一个预放大器，如的TDT系统的S-3 Z系列的TDT系统的Z-的总线bioamp处理器。气相色谱输出matogram经由屏蔽BNC电缆的探测器可以是接口与放大器和数据采集系统，使得两个神经和GC的信号是同步的。
- 等待约30-60分钟，以稳定的神经录音。一旦在记录信道为单位的自发活动和波形形状已成为一致，使用的气味刺激的蜜蜂的注射器，并观察响应的记录信道的气味。
- 记录神经元的细胞外尖峰通过自动阈值由3.5至5西格玛各个记录通道上的信号的记录信道。手动阈值，可能需要一些渠道，以避免电气噪声污染。从神经元的动作电位，会出现作为在记录通道的电压尖峰。当通道的电压超过阈值时，系统缓冲器并保存阈值交叉之前和之后的几毫秒，从而羚牛GA管理单元拍摄的波形，或尖峰。
- 立即到空气表旁边是GC。花的提取物注射到GC之前，请务必升温的GC运行，该方法是正确的。在我们的例子中，我们使用一个开始温度的方法，在50℃，4分钟，随后在10℃/分钟的速率由一个增加的温度。至220°C，届时我们举办的GC 6分钟。我们使用DB-5气相色谱柱（J＆W科学，福尔瑟姆，CA，USA），用氦气作为载气。的入口是不分流，与设定为200℃的温度下火焰离子化检测器的温度被设定为230℃。
- 的提取物样品的花香顶空进样到被加热的注射端口的GC释放到GC柱吸附的挥发物。列的污水分裂1:1之间火焰离子化检测器（FID）和蜜蜂天线使用玻璃“Y”型连接器（J＆W科学）。开始记录奥尔丁从电极注入到GC中的样本。
- GC运行完成后，让制备5〜15分钟的休息。然后或者另一个样品注入到GC或刺激使用单一挥发性化合物或化合物的混合物的制剂。在这后者的刺激的制备方法，从一个恒定的空气流的空气的脉冲改道通过含有该化合物已经沉积的一片滤纸的玻璃注射器。由一个螺线管激活的阀，由软件控制的装置，脉冲刺激气味。
- 如果单位活动突然停止或更改，请检查吊盐水，让准备休息了15分钟。如果自发活动不恢复以前的水平，然后准备应被丢弃和另外一只蜜蜂（如果可用）。
- 实验结束后，用5％福尔马林20分钟的探头还组织修复大脑。其次，消费的大脑并将其放置在2％的戊二醛，4小时，并随后做一个梯度乙醇脱水系列和清除与水杨酸甲酯的脑。基于的组织，其中电极刺破组织应该是清晰可辨的，通过共聚焦显微镜在AL的位置上的固定和结算。
4。数据分析
- 分析所收集的数据，实验后的分离和识别所记录的神经单位。使用典型的软件程序（离线的分拣，MClust，并SClust）独立波形，或“尖峰”，根据穗的形状，如峰值或谷值振幅，半峰宽等，或减少的措施（主要成分）17 ，18（ 图2）。只有那些使用集群的尖峰，在 三维空间中分离（PC1-PC3），在统计学上彼此不同的（多元方差分析，P <0.05）（ 图2），以供进一步分析。请参阅引用＃S 17-19的四极记录和穗排序方法的完整描述。
- 在每个群集高峰时间戳记，并导出这些数据进行分析，使用MATLAB或Neuroexplorer的（NEX），北卡罗来纳州温斯顿-塞勒姆，创建栅格图和射击频率响应（ 图2，图3A）。
- 识别使用同时记录GC数据的挥发物的保留时间。使用的挥发物的保留时间，确定从色谱图中的峰的顶点，在这些时间点检查单元响应。
- 要检查个别单位的反应，通过GC运行，BIN数的峰值在100毫秒的间隔和检查过程中，发射率参考洗脱挥发物的保留时间。在100毫秒的时间间隔的像素合并的尖峰提供足够的细节，或信号，有关的时间过程中神经元的响应于从GC洗脱加臭剂。
- 要EXA开采的人口不同洗脱挥发物的反应，集成的单个的单元的发射率响应超过3秒的采样窗口，1.5秒前，和1.5秒后，在保留时间为易失性的（ 图3）。此时间段典型的洗脱挥发性从GC的持续时间。我们发射率响应的单位按颜色编码（红色的是射速高，反应，蓝色是一种低响应），并安排他们的活动矩阵，每一行代表合奏GC污水（列）（ 图3）。
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Representative Results
在使用M. GCMR分析的lewisii花香的味道，我们3微升提取物注入到GC。挥发物的纯化，通过GC的总数通常为60-70挥发物。香味M. lewisii是主要组成的单萜类化合物，包括β-月桂烯（非周期性）和α-蒎烯，用剩余六碳挥发物，如2 -己醇，倍半萜类化合物，包括<1％的顶空组成的气味。
GCMR利用触角叶神经元的敏感性，以及神经元的处理用的重要的生物的挥发物。然而，这种性质的多声道录音，效果，采取随机抽样的神经元在触角叶。这是因为在不同制剂之间的探头的位置的位置的轻微的变化可能会导致在记录阵列采样不同的神经元。此外，确切位置和Mo因为该记录是细胞外记录神经元的rphologies的是未知的。为了适应这些影响，我们通常运行GCMR实验用8到16个准备，在每个准备用8至18个神经元。然而，为了说明的目的，我们将使用的数据只从一个准备（8个单位）。
从GCMR实验中，我们已经发现，单位是惊人的选择性中的挥发物的反应中，如在图3A中描绘。下面的曲线（黑色）表示的离子色谱图，其中每个峰对应于一个给定的挥发性，到达检测器，随着时间的推移。上部跟踪（蓝色）显示击发率响应的一个单元。单位反应，通过像素合并在一个100毫秒的时间间隔中产生的尖峰的数字计算，并除以该时间内产生的速率。在该示例中，是神经元选择性地响应于D-柠檬烯。需要注意的是，在这个单元中，自发FIRIN克率仍然可以是可变的和随机波动。然而，D-柠檬烯的反应，远高于95％的置信区间，通过时间的发射率响应的方差计算。
然而，并非所有单位从GC挥发物洗脱。事实上，在平均约50％的记录单元在每个合奏无响应（ 图3B）。这是令人惊讶的，在花顶空进样的GC洗脱挥发性化合物的多样性。然而，在合奏的比例不响应单位之间的准备工作，如发现在以往的研究13,14是出奇的一致。
的单个单位的反应之外，GCMR系统还可以分析的人口水平的响应洗脱从GC的气味分子。在这里所示的例子中，有强烈的合奏几个加臭剂的基团选择性（
图1。顶空吸附和GCMR的系统的概略图，（A）在电路图上，花封入内特氟隆袋，并使用真空泵通过一个易失性的陷阱（PORAPAK Q），从包装袋中的空气被吸入到集中发出的挥发性物质。空气被过滤并返回到封闭的花，（B）的提取物样品的花香顶空注入GC中，从柱的流出物被分成这样，有一半的流量进入GC的火焰电离检测器，并通过一个加热的传输线进行的流出物的另一半，并同时在到达蜜蜂的天线。 AL神经合奏的动作电位持续记录的方法，在20分钟的气味传递通过GC。 点击此处查看大图 。
图2。单位排序记录的多声道录音阵列（MR）在蜜蜂的AL。两个柄隔开，使得该阵列包括一个大体积的AL（A）的波形的特性（ 例如安培 litude，谷）的每个“秒杀”的四极记录可以被绘制在三维空间。在这里所示的例子中，3 4记录通道中每个尖峰的高度是在3-D作图。由于每个单元将具有其自己的尖峰形状，从一个给定单元的尖峰将聚集在一起，从而使单位进行识别和排序条件彼此。排序单位在射击反应表现出明显的差异（B光栅图）和波形（C）定位的四个通道每一个柄上记录的大区域内处理肾小球和神经纤维。神经活动被记录在每一个四通道，在三维空间中绘制的（ 中的A所示），并根据波形特征排序。 点击此处查看大图 。
图3。 （A）发射率直方图单位的反应，以洗脱化合物的M. lewisii顶空提取物（3微升注射液）（底部的迹线，黑色）。某些气味分子（ 例如，D-柠檬烯，红色箭头）引起显着反应（B）为单位。响应MR每个气味洗脱从GC的所有单位，录得。曲面图的颜色编码，以个人为单位的归一化发射率响应。 点击此处查看大图 。
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Discussion
昆虫的嗅觉介导的行为驱动许多不同的流程，包括复制，主机选址，并确定适当的食物资源。这些过程的研究需要从源头抓起，以及识别能力，调解行为的化合物，这些化合物的挥发物排放的识别能力。复杂的问题是，气味是由几十到几百，共同创造一个独特的气味，被认为比单个的成分6,7,13,19,20不同的单个化合物。 ，最初研究中的性信息素系统12进行的，最近更是在食品和产卵有关的气味13,20中 ，已经表明，该混合物的行为有效性驻留作为的函数的几个，关键在该混合物中的挥发物，并该混合物引起的行为反应比单个的成分。识别这些关键成分是现代的化学生态学以及嗅觉神经生物学的一个重要组成部分。
各种技术已经出现在过去的五十年驾驶行为在昆虫的生物活性化合物的鉴定。由昆虫天线检测的挥发物的主要技术是气相色谱 - electroantennography（GC-EAG）。 EAG最初是由施耐德21岁的小的电压波动，一般认为是造成头和底座的的昆虫天线在刺激的许多嗅觉神经元之间的电去极化的。东亚运动会之后的GC引起的顶空挥发物的触角反应12,22精确识别。此外，从昆虫天线的个人受体神经元的记录后11,23和与GC，提供单感器录音，或GC-SSR。一虽然GC-SSR是比GC-EAG更多的时间密集的和困难的，在录音提供的信息通过动作电位上的单个细胞的反应响应到GC-废水，并允许识别那些特别的化合物，是专门的受体可能会错过EAG GC-24。
GC-EAG和GC-SSR技术提供识别这些挥发物引起的反应的边缘，因此，参与的气味接收。更多最近的技术已经开始研究在中枢神经系统的哺乳动物和昆虫的响应，并因此涉及的加臭剂的感知。这些技术都属于两大类：成像方法称为GC-I（气相层析成像）和直接的电生理方法（ 例如 GCMR）。 GC-I和GCMR提供几个优点，因为突起，或输出的收敛性的感觉神经元，神经元的AL，以及这些方法允许的决心气味分子是如何在昆虫的大脑表示。此外，类似的方法正在被用于在哺乳动物大脑25。
尽管有这些优势，GCMR和GC-I提供的缺点。数据分析可以是耗时的，并在箱子的GCMR，肾小球的记录神经元的突起是未知的由于是细胞外的录音。此外，昆虫AL支配由几个不同的神经元类型，包括投射神经元（PN）的和本地的interneurons（逻辑节点），从而使所记录的单位难以识别。然而，在蛾，M.天蛾 ，最近的研究已经证明，，，PN和淋巴结可识别的扣球行为的神经元，从而使识别这些类型的神经元的自发活动26。尽管如此，GCMR和GC-I允许的加臭剂的识别ACTIVATË专门的受体神经元，可能不会引起强烈的EAG反应，以及确定如何在人口的神经元在大脑中的挥发。比较这些不同的方法的研究尚未进行，虽然我们的初步数据表明，GCMR可能更适合于东亚运动会的GC-的那些化合物，是生物活性的，但是在提取物中的痕量水平（Riffell未发表结果）。未来的工作可能检查的敏感性具有生物活性的气味分子检测与分析时间的不同方法之间的权衡。
虽然我们在这里集中详细介绍了试验的方法，我们使用的B.凤仙蜜蜂的气味从M. lewisii，提取和使用的昆虫种类是可以改变的，如果某些修改。昆虫种类，可以根据它们的大小的不同的吸头（10至200μl）放入。较大的品种，如蛾，烟草天蛾，可以放入6 mL样品瓶。以这样一种方式，该制剂是维持生命从而允许稳定的记录持续时间的几个小时。
两者合计，分离的化合物的分析方法与电生理记录昆虫的大脑，具有强大的生物活性化合物的鉴定工具，并串联使用时，行为学实验，可能会出现一种手段，以确定食品相关的重要挥发物昆虫13的行为，以及那些涉及在主机站点2中 ，和血液主机相关的行为27，是重要的农业害虫和疾病的载体。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国家科学基金会资助IOS 1121692，和大学的华盛顿研究基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Porapak Type Q 80-100 mesh | Waters | WAT027060 | |
| Reynolds Oven Bags | Reynolds | ||
| GC | Agilent | 7820A | |
| GC column | J&W Scientific, Folsom, CA, USA | DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm) | |
| Analytical helium carrier gas | Praxair | HE K | 1 cc/min |
| 16-channel silicon electrode | Neuronexus Technologies | a4x4-3mm50-177 | |
| Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) | Sandvik Kanthal HP Reid | PX000004 | For making custom tetrodes and stereotrodes |
| Pre-amplifier | Tucker-Davis System | PZ-2 | |
| Amplifier | Tucker-Davis System | RZ-2 | |
| Data acquisition system - OpenEx suite | Tucker-Davis System | ||
| Online spike-sorting software - SpikePac | Tucker-Davis System | ||
| Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox | David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota | Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html | MATLAB toolbox |
References
- Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
- Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
- Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
- Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
- De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
- Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
- Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
- Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
- Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.
- Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
- Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
- Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098 (2009).
- Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282 (2011).
- Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
- Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
- Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
- Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
- Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
- Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
- Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
- Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
- Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).
