Summary
Olfactory signaler förmedlar många olika beteenden hos insekter, och är ofta komplexa blandningar som består av tiotals till hundratals flyktiga föreningar. Användning gaskromatografi med flerkanaligt inspelning i insekten antenn lob, beskriver vi en metod för identifiering av bioaktiva föreningar.
Abstract
Alla organismer lever i en värld full av sensoriska stimuli som avgör deras beteendemässiga och fysiologiska respons på sin omgivning. Olfaction är särskilt viktigt i insekter, som använder sina lukt system att svara på, och diskriminera bland, komplexa lukt stimuli. Dessa lukter framkallar beteenden som förmedlar processer såsom reproduktion och livsmiljö val 1-3. Dessutom kemiska avkänning av insekter förmedlar beteenden som är mycket betydelsefullt för jordbruk och människors hälsa, inbegripet pollinering 4-6, herbivori av livsmedelsgrödor 7, och överföring av sjukdom 8,9. Identifiering av olfaktoriska signaler och deras roll i insekt beteende är därför viktigt för att förstå både ekologiska processer och mänskliga resurser mat och välbefinnande.
Hittills har identifieringen av flyktiga ämnen som driver insekt beteende varit svårt och ofta tråkiga. Aktuella tekniker inkluderargaskromatografi-kopplad electroantennogram inspelning (GC-EAG) och gaskromatografi-kopplade enkla sensillum inspelningar (GC-SSR) 10-12. Dessa tekniker visade sig vara avgörande för identifieringen av bioaktiva föreningar. Vi har utvecklat en metod som använder gaskromatografi kopplad till flerkanaliga elektrofysiologiska inspelningar (kallas "GCMR ') från nervceller i antenn loben (AL, insekten primära lukt centrum) 13,14. Denna state-of-the-art teknik ger oss möjlighet att undersöka hur lukt information representeras i insekten hjärnan. Dessutom, eftersom neurala svar på lukter på denna nivå av luktsinnet behandling är mycket känsliga på grund av graden av konvergens av antennens receptor neuron i AL nervceller kommer AL inspelningar tillåter detektion av aktiva beståndsdelar i naturliga lukter effektivt och med hög känslighet. Här beskriver vi GCMR och ge ett exempel på dess användning.
Flera allmänna steg är involved vid detektering av bioaktiva flyktiga och insekt respons. Flyktiga ämnen måste först hämtas från källor av intresse (i detta exempel använder vi blommor från släktet Mimulus (Phyrmaceae)) och karakteriseras som behövs med vanliga GC-MS teknik 14-16. Insekter är förberedda för studie med minimal dissektion, varefter en inspelning elektrod förs in i antenn lob och flerkanalig neurala inspelningen börjar. Efterbehandling av de neurala uppgifter avslöjar sedan vilka särskilda doftämnen orsaka betydande neurala reaktioner från insekten nervsystemet.
Även om exemplet som vi presenterar här är specifik för pollinering studier kan GCMR utökas till ett brett spektrum av studier organismer och flyktiga källor. Till exempel, kan denna metod användas vid identifiering av doftämnen locka eller repellerande vektor insekter och skadedjur grödor. Dessutom kan GCMR också användas för att identifiera attraherande för nyttiga insekter, såsom pollinators. Tekniken kan utökas till icke-insekter ämnen också.
Protocol
1. Flyktigt Follection
- I det här exemplet använder vi flyktiga prover från M. lewisii blommor - en alpin Wildflower hemma i Kalifornien. Flyktiga samlas använda dynamiska sorptionsdata metoder enligt Riffell et al. 14. Kortfattat använder denna metod ett slutet system slinga svällning där blommorna är inneslutna i en Teflon påse. Användning av en inert vakuumpump, är luften runt blommorna sugs genom en "fälla" som består av en Pasteur-pipett fylld med Porapak Q matris. Returluften från pumpen filtreras genom aktivt kol. Efter en föreskriven tidsperiod, i vårt fall 24 timmar, är Porapak Q matrisen eluerades med en icke-polärt lösningsmedel, typiskt hexan, för att samla det koncentrerade extraktet. Extraktet lagras sedan i -80 ° C tills analys. Om nödvändigt, kan proverna koncentreras före analys under en ström av kvävgas. Såvida provet redan väl karaktäriserade, köra en alikvot av det genom ettgaskromatograf-masspektrometer (GC-MS) för att identifiera flyktiga komponenter före användning av provet.
2. Elektrofysiologiska Förberedelser
- Klipp ungefär 1 cm från änden av en 1.000 il pipettspets. Placera en humla (Bombus Impatiens) i botten av pipettspetsen och tryck försiktigt mot den motsatta änden av spetsen tills bara huvudet utsätts för.
- Smält dentalvax och forma den runt den exponerade huvudet, och se till att vaxet fastnar på sammansatta ögon för säkerhet och för att göra bee huvud helt orörlig. Var noga med att inte få någon vax på antenn biet.
- När huvudet är säker, gör en fyrkant, fönster-liknande, snitt i huvudet kapseln med ett rakblad brytare eller lämplig storlek skalpell för att skära nagelbanden. Använda blad-brytaren, börja från den dorsala sidan av huvudet kapseln, omedelbart bakom antennen och intill en av de sammansatta ögon. Klippen rak linje, från en förening öga till den kontralaterala föreningen ögat. Efter att skära en rak linje till den motsatta föreningen ögat, börja göra ett snitt dorsalt tills kurvorna huvudet kapsel och slutar nära sin bröstkorg. Vid denna punkt, börjar skära mot den motsatta änden av huvudet kapseln. Slutligen, när en linje har skurits till den motsatta änden, skär en linje tillbaka till utgångsläget för den första snittet. Det är viktigt att avlägsna hinnan som är intill antennen, eftersom detta kommer att hindra införandet av elektroden.
- När nagelbanden skärs, använd en pincett för att ta bort biet nagelband, som sedan skulle utsätta bee hjärna och, än viktigare, de antenn loberna. Omedelbart börjar superfusing hjärnan med insekter koksaltlösning, så att hjärnan inte blir torkad. Efter hjärnan exponeras försiktigt använda ett par av mycket fin pincett för att avlägsna perineural höljet omedelbart ovanför antenn loberna. Var mycket noga med att intepunktera bee hjärna med pincett.
3. Gaskromatografi med Multichannel-inspelning
- Biet "preparat" - fast i ett rör vars exponerade hjärnan - är nu klar för elektrofysiologiska inspelning. Placera biet i en klämma, fast till en magnetisk bas som ligger på en luft bord.
- Arrangera en IV-påse, flödesregulator och slang (fylld med insekter koksaltlösning), så att saltlösning kontinuerligt superfuses hjärnan.
- Med hjälp av en mikromanipulator, insertareference elektrod, tillverkad av volfram tråd, i biets öga.
- Med hjälp av en separat mikromanipulator sätter flerkanaliga elektrod, såsom en lindad tråd tetrodens, eller kisel flerkanaligt elektrod (Neuronexus Technologies), i de antenn lober biet. Denna elektrod är ansluten till en förförstärkare såsom TDT systemets S-3 Z-serien till Z-bussen bioamp processor TDT systemet. Utdata från Gas krommatogram är detektor via en skärmad kabel BNC kan vara gränssnitt med förstärkare och datainsamlingssystemet så att både neurala och GC signalen synkroniseras.
- Vänta cirka 30-60 minuter för de neurala inspelningar att stabilisera. När den spontana aktiviteten och vågform av enheter i inspelningen kanalerna har blivit konsekvent, använda en lukt spruta för att stimulera biet och observera svaret från inspelningen kanaler till lukten.
- Spela extracellulära spikar från neuroner genom automatisk tröskling de registrerande kanaler genom 3,5 till 5 sigma av signalen på de enskilda kanalerna inspelning. Manuell tröskling kan krävas för vissa kanaler för att undvika kontamination från elektriskt brus. De aktionspotentialer från nervceller visas som spänningsspikar i inspelningen kanalen. När kanalens spänningen överstiger tröskelvärdet, buffrar systemet och sparar några millisekunder före och efter passage av tröskeln, vilket takinga ögonblicksbild av vågformen eller spik.
- Omedelbart intill luftbordet är GC. Innan du injicerar den blommiga extraktet i GC, se till att metoden för temperatur ramp GC körningen är korrekt. I vårt exempel, använder vi en temperatur metod börjar vid 50 ° C under 4 minuter följt av en ökning av temperaturen med en hastighet av 10 ° C / minut. till 220 ° C, vid vilken tidpunkt vi håller GC under ytterligare 6 minuter. Vi använder en DB-5 GC-kolonn (J & W Scientific, Folsom, CA, USA), med helium som bärargas. Inloppet är splitless, med en temperatur inställd på 200 ° C. Flamjoniseringsdetektorn temperatur är inställd på 230 ° C.
- Injicera extraktet prov av blommor headspace i den uppvärmda injektionsport av GC för att frigöra de adsorberade flyktiga i GC-kolonnen. Utflödet från kolonnen delas 1:1 mellan flamjonisationsdetektor (FID) och biet antennen med ett glas "Y"-kontakt (J & W Scientific). Börja recOrding från elektroden när du injicera ett prov i GC.
- Efter GC körningen är klar, låt förberedelserna vila 5 till 15 minuter. Då antingen injicera ytterligare prov i GC eller stimulerar preparatet med enkla flyktiga föreningar eller blandningar av föreningar. I denna senare metod för att stimulera preparatet, är pulser av luft från en konstant luftström avleds genom en glasspruta innehållande en bit filterpapper som föreningarna har deponerats. Den lukt stimulus pulserades med hjälp av en solenoid-aktiverad ventil styrs av mjukvaran.
- Om enhet aktivitet plötsligt stannar eller förändringar, kontrollera saltlösning dropp och låt förberedelse vila under 15 min. Om den spontana aktiviteten inte återfå sin tidigare nivå då preparatet skall kasseras och en annan bee används om möjligt.
- Efter experimentet, fixera hjärnan med 5% formalin under 20 minuter med sonden fortfarande i vävnaden. Därefter punktskatt hjärnanoch placera den i 2% glutaraldehyd under 4 timmar och därefter göra en graderad serie etanol uttorkning och rensa hjärnan med metylsalicylat. Baserat på fastställande och clearing av vävnaden, de platser i AL där elektroderna punkterade vävnaden bör tydligt urskiljbar genom konfokalmikroskopi.
4. Dataanalys
- Analysera insamlade data efter experimentet att avskilja och identifiera de inspelade neurala enheter. Använda typiska program (Offline Sorter, MClust och SClust) att separera vågformer, eller "spikar", baserad på spik former som topp eller dal amplitud, topp halv-bredd, mm eller minskade åtgärder (huvudkomponenter) 17 , 18 (figur 2). Använd endast de kluster av spikar som separerade i tre-dimensionell rymd (PC1-PC3) och är statistiskt skilda från varandra (multivariat ANOVA, p <0,05) (Figur 2) för vidare analys. SeCitation # s 17-19 för fullständig beskrivning av tetrodens inspelning och spik-sortering metoder.
- Tidsstämpel spikar i varje kluster och exportera dessa data för analys med hjälp av MATLAB eller Neuroexplorer (Nex Technologies, Winston-Salem, NC) för att skapa raster tomter och bränning svar ränta (figur 2, 3a).
- Identifiera retentionstid flyktiga använder samtidigt registrerade GC data. Använd retentionstiderna för flyktiga, bestäms av toppen av toppen i kromatogrammet, att undersöka enhet svar på dessa tidpunkter.
- För att undersöka enskilda enheten svar via GC körningen, bin antalet spikar i 100 ms intervall och undersöka tidsförloppet för eldhastighet svar med hänvisning till retentionstiden för eluering flyktiga ämnen. Den binning av spikar i 100 ms intervall ger tillräckligt detaljerad, eller signal, om tidsförloppet för den neuronala svar på en eluerande luktämne från GC.
- Till EXAbryta befolkningen svaren på de olika eluerande flyktiga, integrera de eldhastighet svaren på enskilda enheter över en 3 sek samplingsfönster, 1,5 sekunder innan, och 1,5 sek efter, retentionstiden för den flyktiga (figur 3). Denna tidsperiod är typiskt för den tid en eluerande flyktiga från GC. Vi visar eldhastighet svar enheterna genom färgkodning dem (rött är en hög eldhastighet svar, blått är en låg respons) och arrangera dem som en verksamhet matris med varje rad representerar ensemblen svar på GC utflödet (kolumner) ( Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I GCMR analys med användning av M. lewisii blommig doft, injicera vi 3 ul av extraktet i GC. Det totala antalet flyktiga eluerande genom GC är typiskt 60-70 flyktiga. Doften av M. lewisii är övervägande sammansatt av monoterpenoids, inklusive β-myrcen (acykliska) och α-pinen, varvid återstoden av doften består av sex-kol flyktiga, såsom 2-hexanol, och sesquiterpenoids som innefattar <1% av det övre utrymmet.
GCMR utnyttjar känsligheten hos antenn lob neuroner liksom neuronala bearbetning av biologiskt viktiga flyktiga. Men flerkanaliga inspelningar av detta slag, i själva verket ta ett slumpmässigt urval av nervceller i antenn lob. Detta beror på att små förändringar i läget av sondens läge mellan olika preparat kan orsaka inspelningen arrayen att prova olika neuroner. Dessutom de exakta positioner och morphologies av de registrerade neuronerna är okänd, eftersom inspelningen är extracellulära. För att tillgodose för dessa effekter, kör vi vanligtvis GCMR experiment med 8 till 16 preparat, med 8 till 18 neurala enheter i varje preparat. För illustrationsändamål, kommer vi emellertid att använda data från endast en beredning (8 enheter).
Från GCMR experiment har vi funnit att enheter är överraskande selektiva i sitt svar på flyktiga, såsom visas i figur 3A. Den nedre kurvan (i svart) betecknar jonkromatogram, där varje topp motsvarar ett givet flyktig som anländer till detektorn över tiden. Den övre kurvan (blå) visar eldhastighet svar en enhet. Enhet svar beräknades genom binning antalet spikar som produceras i en 100 ms intervall, och dividera med den tidsramen för att producera hastigheten. I exemplet, är den neurala enheten selektivt gensvar till D-limonen. Notera att i denna enhet, den spontana firing ränta kan fortfarande vara rörlig och föremål för slumpmässiga variationer. Ändå var svar på D-limonen väl över 95% konfidensintervall, som beräknas av variansen i eldhastighet svaren genom tiden.
Inte alla enheter, emellertid, svarade på de flyktiga elueras från GC. I själva verket, i genomsnitt cirka 50% av inspelade enheter i varje ensemble var svarar (figur 3B). Detta är förvånande med tanke på mångfalden av flyktiga föreningar i den blommiga headspace som eluerar från GC. Dock är andelen icke-responsiva enheter i en ensemble förvånansvärt konsekvent mellan preparat, som återfinns i tidigare studier 13,14.
Utöver svaren av enskilda enheter möjliggör GCMR systemet också en analys av befolkningen nivå svar på luktämnen elueras från GC. I det här exemplet finns det en stark ensemble selektivitet för en grupp av flera luktämnen (
Figur 1. Skiss av gasutrymmet sorptions och GCMR systemet. (A) I den schematiska, är en blomma innesluten i en Teflon påse, och användning av en vakuumpump, är luften från påsen sugs genom en flyktig fälla (Porapak Q) för att koncentrera avges flyktiga. Luften filtreras och returneras till den bifogade blomman. (B) Extraktet prov av blommor gasutrymmet är injiceraed i GC och utflödet från kolonnen delas så att hälften av flödet inträder antingen GC detektorn flamjonisering, och den andra hälften av utflödet bärs av en uppvärmd överföringsledning och anländer samtidigt vid biets antennen. Aktionspotentialer från Al neurala ensemblen kontinuerligt registreras extracellulärt under 20 min av lukt leverans via GC. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Sortering av enheter som spelats in med flerkanals inspelning array (MR) i binas AL. De två skänklar är åtskilda så att matrisen omfattar en stor volym av AL. (A) vågformen karakteristiska (t.ex. förstärkare litude, dal) för varje "spik" i tetrodens inspelningen kan ritas i tre-dimensionell rymd. I exemplet som visas här, är höjden av varje topp i 3 av de 4 inspelningskanaler plottades i 3-D. Eftersom varje enhet har sin egen spik form, kommer spikarna från en given enhet kluster tillsammans, varigenom enheterna kan identifieras och sorteras från varandra. Sorterade enheter visade tydliga skillnader i bränning svar (B, raster tomt) och vågform (C) Placering av de fyra kanalerna på varje skaft som inspelning av breda zoner inom bearbetning glomeruli och neuropil. Neural aktivitet spelades in på var och en av de fyra kanalerna, avsatta i 3-dimensionell rymd (som visas i A) och sorteras enligt vågformen egenskaper. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. (A) eldhastighet histogram av enheten svarar på de eluerande föreningarna från M. lewisii headspace extrakt (3 ul injektion) (bottenspår, svart). Vissa doftämnen (t.ex. D-limonen, röd pil) framkallade signifikanta svar i enheter (B) Svar på alla enheter som spelades in från MR till varje luktämne eluerat från GC.. Ytan Tomten är färgkodade enligt normaliserade eldhastighet svaren från de enskilda enheterna. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insect lukt-medierade beteenden driver många olika processer, inklusive reproduktion, värd-plats urval och identifiering av lämpliga livsmedel resurser. Studiet av dessa processer kräver förmåga att identifiera de flyktiga avges från källan, liksom förmågan att identifiera de föreningar som förmedlar de beteenden. Komplicerande ärenden är att lukt består av tiotals till hundratals enskilda föreningar som tillsammans skapar en unik doft som uppfattas annorlunda än de enskilda beståndsdelarna 6,7,13,19,20. Forskning, som ursprungligen genomfördes under sexualferomon systemet 12, och mer nyligen i livsmedels-och äggläggning-relaterade lukt 13,20, har visat att beteende effektivitet blandningen ligger som en funktion av ett fåtal, viktiga flyktiga i blandningen, och att blandningarna framkallar betydligt större beteendemässiga svar än de enskilda beståndsdelarna. Identifiera de centralabeståndsdelar är därför en viktig del i dagens kemisk ekologi samt lukt neurobiologi.
En mängd olika tekniker har uppstått under de senaste 50 åren för identifiering av bioaktiva föreningar som driver beteende i insekter. Den primära tekniken för detektering av flyktiga från insekten antennen är gaskromatografi-electroantennography (GC-EAG). EAG utvecklades ursprungligen av Schneider 21, som antecknade små spänningsvariationer i allmänhet antas vara orsakade av elektriska depolarisations av många lukt neuroner mellan spetsen och basen av en insekt antenn under stimulering. EAG senare integreras med GC för exakt identifiering av de headspace flyktiga som framkallar antenn svar 12,22. Dessutom var registrering av enskilda receptor neuroner från insekten antennen senare utvecklade 11,23 och kopplas med GC för att tillhandahålla enkel-sensillum inspelningar, eller GC-SSR. ENven GC-SSR är mer tidskrävande och svårare än GC-EAG inspelningarna ger information om de enskilda cellsvar via aktionspotentialer som svar på GC-utsläpp, och möjliggör identifiering av de receptorer som är specialiserade på särskilda föreningar som kan missas med GC-EAG 24.
GC-EAG och GC-SSR tekniker erbjuder identifiering av de flyktiga ämnen som framkallar svar på periferin, och är sålunda involverade i luktämne mottagning. Nyare tekniker har börjat undersöka svar i det centrala nervsystemet hos både däggdjur och insekter, och är sålunda involverade i luktämne uppfattning. Dessa tekniker delas in i två huvudkategorier: avbildningsmetoder 25 kallas GC-I (gaskromatografi-avbildning) och direkta elektrofysiologiska metoder (t.ex. GCMR). GC-I och GCMR erbjuder flera fördelar på grund av konvergensen av de sensoriska nervceller i projektionen, eller produktion, nervceller iAL, liksom att dessa metoder tillåter bestämning av hur doftämnen representeras i insekten hjärnan. Dessutom är liknande metoder används nu i däggdjurshjärnan 25.
Trots dessa fördelar GCMR och GC-Jag erbjuder nackdelar också. Dataanalys kan vara tidskrävande, och i fallet med GCMR, glomerulära projektioner av de inspelade neurala enheterna är okända på grund av inspelningarna är extracellulär. Dessutom insekten AL innerveras av flera olika neuronala typer inklusive utsprång neuroner (PNS) och lokala interneuroner (LNS) sålunda gör identifiering av de registrerade enheterna svår. Emellertid, i mal, M. sexta har senare arbete visat att PN och LNS kan identifieras genom spetsning beteende nervceller, vilket gör det möjligt att identifiera dessa neuron typer av deras spontana aktivitet 26. Ändå tillåter GCMR och GC-I identifieringen av luktämnen som activate specialiserade receptor neuron som kanske inte framkalla starka EAG svar, samt avgör hur befolkningen av nervceller i hjärnan process flyktiga. En studie som jämför de olika metoder har ännu inte genomförts, även om vår preliminära data tyder på att GCMR vara mer lämplig än den GC-EAG för de föreningar som är bioaktiva men i spårmängder i extraktet (Riffell opublicerade resultat). Framtida arbete kan undersöka avvägningen i känslighet upptäcka bioaktiva luktämnen med analysen tiden mellan de olika metoderna.
Även om vi har fokuserat här på en beskrivning av de analysmetoder vi använder för B. impatiens bin och doften från M. lewisii, extraktet och insekter använda arter kan ändras om vissa ändringar görs. Insektsarter kan placeras i olika pipettspetsar (10 till 200 pl) beroende på deras storlek. Större arter, såsom mal, Manducasexta, kan placeras i 6 ml provflaskor. På ett sådant sätt är beredningen hålls vid liv varigenom stabila inspelningar flera timmar i varaktighet.
Sammantaget analysmetoder för isolering av föreningar tillsammans med elektrofysiologiska inspelningar i insekter hjärnan nuvarande kraftfulla verktyg för identifiering av bioaktiva föreningar, och när den används tillsammans med beteende experiment, kan utgöra ett medel för att bestämma viktiga flyktiga för livsmedel-relaterade beteenden hos insekter 13, samt de inblandade i värd-plats 2, och blod-värd beteenden 27 som är viktiga för jordbruks skadedjur och vektorer för sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF bidrag IOS 1121692 och av University of Washington Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Porapak Type Q 80-100 mesh | Waters | WAT027060 | |
| Reynolds Oven Bags | Reynolds | ||
| GC | Agilent | 7820A | |
| GC column | J&W Scientific, Folsom, CA, USA | DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm) | |
| Analytical helium carrier gas | Praxair | HE K | 1 cc/min |
| 16-channel silicon electrode | Neuronexus Technologies | a4x4-3mm50-177 | |
| Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) | Sandvik Kanthal HP Reid | PX000004 | For making custom tetrodes and stereotrodes |
| Pre-amplifier | Tucker-Davis System | PZ-2 | |
| Amplifier | Tucker-Davis System | RZ-2 | |
| Data acquisition system - OpenEx suite | Tucker-Davis System | ||
| Online spike-sorting software - SpikePac | Tucker-Davis System | ||
| Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox | David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota | Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html | MATLAB toolbox |
References
- Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
- Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
- Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
- Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
- De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
- Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
- Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
- Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
- Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.
- Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
- Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
- Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098 (2009).
- Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282 (2011).
- Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
- Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
- Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
- Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
- Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
- Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
- Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
- Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
- Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).
