Summary
يوصف أسلوب الفرز الفائق المحتوى لتحديد مستقبلات عبر الغشاء الرواية يشير المختصة. هذا الأسلوب هو قابل للتشغيل الآلي على نطاق واسع ويسمح التنبؤات حول
Abstract
نقل الإشارة من قبل مستقبلات عامل النمو أمر ضروري لخلايا للحفاظ على الانتشار والتمايز ويتطلب رقابة مشددة. يبدأ نقل الإشارة من قبل ملزم ليجند الخارجية إلى مستقبلات عبر الغشاء وتفعيل أجهزة الطرد المركزي يشير المصب. A المنظم الرئيسي للإشارة مولد للتفتل هو Grb2، وهو بروتين وحدات تتألف من المجال الداخلي (SRC التماثل 2) SH2 يحيط بها اثنان SH3 المجالات التي تفتقر النشاط الأنزيمي. ويرتبط جوهري Grb2 مع الابن GTPase-OF-Sevenless (SOS) عبر المجال الخاص به SH3 N-الطرفية. المجال SH2 من Grb2 يربط لمستقبلات عامل النمو في بقايا التيروزين فسفرته اقتران بالتالي تنشيط مستقبلات لسلسلة SOS-MAP-رأس إشارات كيناز. وبالإضافة إلى ذلك، وقد وصفت الأدوار الأخرى للGrb2 كمنظم الإيجابية أو السلبية لمستقبلات الإشارات والإلتقام. تكوين وحدات من Grb2 يشير إلى أنه يمكن إرساء لمجموعة متنوعة من المستقبلات وtransducه يشير إلى جانب عدد وافر من مسارات مختلفة 1-3.
الموصوفة هنا هو الفحص المجهري بسيطة التي تراقب تجنيد Grb2 إلى غشاء البلازما. أنها مقتبسة من الفحص الذي يقيس التغيرات في شبه الخلوية توطين الفلورية الخضراء البروتين (GFP)-الموسومة Grb2 ردا على التحفيز 4-6. مستقبلات غشاء البلازما التي تربط Grb2 مثل تنشيط البشرة مستقبلات عوامل النمو (EGFR) تجنيد GFP-Grb2 إلى غشاء البلازما على التعبير [كدنا] والانتقال بعد ذلك إلى حجرات endosomal في الخلية. من أجل تحديد البروتين في الجسم الحي من المجمعات Grb2، يمكن استخدام هذه التقنية لإجراء الجينوم على نطاق عالية محتوى الشاشة يعتمد على التغيرات في توطين الفرعي الخلوية Grb2. موصوفة إعداد استنساخ [كدنا] التعبير، والحصول على الصور ترنسفكأيشن بالتفصيل أدناه. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى المستخدمة لالجينومية تحديد الشركاء التفاعل البروتين، مثل الخميرة HY اثنينbrid، وهذا الأسلوب يسمح التصور من مجمعات البروتين في خلايا الثدييات في الموقع الفرعي الخلوية من التفاعل من قبل الفحص المجهري على أساس بسيط. يمكن بالتالي يتم تقييم كل من الميزات النوعية، مثل أنماط الترجمة، فضلا عن قوة الكمي للتفاعل.
Protocol
1. اختيار النسخ التعبير [كدنا]
- وتقدم مكتبة [كدنا] واستنساخ البكتيرية واحد في مخزونات الجلسرين في شكل 96-أيضا. باستخدام الأمر Rearray في القائمة المنتقى من CP7200 Norgen، واختيار الحيوانات المستنسخة من لوحة البكتيرية المصدر وتطعيم 1.5 مل في LB / AMP في deepwell-96 (1 مل أيضا) لوحة.
- ختم لوحات deepwell مع ختم الغاز نفاذية واحتضان بين عشية وضحاها في C ° 37 في شاكر.
2. إعداد مكتبة التعبير [كدنا]
- تدور لوحات deepwell تحتوي على البكتيريا في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة باستخدام محولات لوحة أجهزة الطرد المركزي في جدول القمة.
- نضح وسائل الاعلام من الآبار، وترك بيليه البكتيرية سليمة.
- تكوين سطح مختبر أتمتة محطة العمل كما هو مبين في الشكل 2. يتم توزيع حلول لإعداد البلازميد في أحواض 1-5 ويتم وضع لوحة deepwell على سطح السفينة. A الحوض الصغير multiwell مع الحل شطفيتم وضع لوحة بجوار deepwell. يتم تحميل نصائح في رفوف الإكراميات.
- تجميع متعددة فراغ. يتم وضع لوحة بلازميد متعددة داخل ملزمة ويتم وضع لوحة البلازميد مرشح على رأس متعددة.
- إعادة تعليق الكريات مع 250 ميكرولتر الحل 1 (العازلة إعادة تعليق) بواسطة pipetting صعودا وهبوطا.
- ليز على البكتيريا عن طريق إضافة محلول من 250 ميكرولتر 2 (العازلة يزيس). وختم وحة ومقلوب للسماح كاملة الاختلاط.
- ستارت 2 توقيت دقيقة.
- إضافة 350 ميكرولتر الحل 3 (العازلة الإبطال). ختم لوحة وعكس 3 مرات.
- نقل لست] البكتيرية لوحات تصفية البلازميد.
- تطبيق فراغ لمدة 5 دقائق.
- إزالة لوحة تصفية ووضع لوحة ملزم على رأس متعددة. تطبيق فراغ لمدة 1 دقيقة.
- إضافة 500 ميكرولتر من غسل إضافية (AW) العازلة.
- تطبيق فراغ لمدة 2 دقيقة.
- إضافة 900 ميكرولتر من محلول منظم غسيل 4. تطبيق فراغ لمدة 2 دقيقة.
- كرر قTEP 2.14. تطبيق فراغ ل15 دقيقة إضافية.
- وضع لوحة DNA داخل مجموعة متعددة. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة شطف لوحة ملزمة واحتضان لمدة 2 دقيقة.
- فراغ لمدة 10 دقيقة.
- إزالة لوحة جمع وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام Nanodrop 8000. وعادة ما يمكن أن محصول ~ 100 نانوغرام / ميكرولتر من المتوقع مع هذا الأسلوب.
3. خلية البذر
- وtrypsinized HEK293 الخلايا وفرزها.
- والاستغناء عن 2 × 10 4 خلايا في كل بئر من Viewplate PerkinElmer باستخدام ThermoFisher 96-multidrop جيدا.
- يتم تحضين الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
4. ترنسفكأيشن
- إعداد مزيج من 100 GFP-DNA البلازميد Grb2 نانوغرام مع 100 نانوغرام من [كدنا] في 25 المتوسطة المصل خالية ميكرولتر لكل بئر في أسفل الجولة 96-وحة جيدا.
- إضافة 25 ميكرولتر مصل خالية سائل الإعلام التي تحتوي على 0،5 ميكرولتر لكل بئر Transfectin.
- خلط وبدء الموقت FOص 30 دقيقة.
- نقل 50 ميكرولتر من [كدنا] / Transfectin مزيج إلى الخلايا باستخدام طريقة صرفها لطيف. وبدلا من ذلك، يمكن الاستغناء عن مزيج ترنسفكأيشن لأول مرة في لوحات خلايا ثم أضاف على رأس (ترنسفكأيشن العكسي).
- احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
5. الصورة اكتساب
- بدء أوبرا البرمجيات. ويرد لقطة شاشة الإعداد التجربة في الشكل 3. حدد "تكوين" علامة التبويب وحدد الهدف 20X ونوع لوحة الصحيح. ضمان "طوق" تم تعيين إلى القيمة الصحيحة على هدف للسماح للتركيز مع أنواع مختلفة وحة.
- حدد "ميكروسكوب" علامة التبويب. تحديد التعرض (1)، FITC (488 ليزر) والتعرض للأشعة فوق البنفسجية (2)، (365 ليزر). تفعيل فلتر الأشعة فوق البنفسجية على كل من التعرض وتعيين التعرض 1 إلى كاميرا 1 و 2 إلى التعرض كاميرا 2. تعيين أوقات التعرض إلى 800 ميللي ثانية للتعرض 1 و 40 ميللي ثانية للتعرض 2.
- حدد "ميكروسكوب" علامة التبويب. تعريف هxposure (1)، FITC (488 ليزر) والتعرض للأشعة فوق البنفسجية (2)، (365 ليزر). تفعيل فلتر الأشعة فوق البنفسجية على كل من التعرض وتعيين التعرض 1 إلى كاميرا 1 و 2 إلى التعرض كاميرا 2. تعيين أوقات التعرض إلى 800 ميللي ثانية للتعرض 1 و 40 ميللي ثانية للتعرض 2.
- حدد التعرض 1. تعيين التركيز إلى 0 ارتفاع ميكرون. حدد "التركيز". ركز مرة واحدة، تعرض الكاميرا 1. ضبط ارتفاع التركيز لتحسين الطائرة التعرض وانقر على "ارتفاع اتخاذ". تغيير أوقات التعرض وقوة الليزر لإعطاء كثافة بكسل الحد الأقصى ل~ 3،000. حفظ المعلمات التعرض. تكرار التعرض ل2.
- حدد "التجربة تعريف" علامة التبويب. إنشاء تخطيط وsublayout. سحب وإسقاط ذات الصلة تخطيط، والتعرض الصورة المرجعية،، ملف skewcrop وsublayout. حفظ التجربة.
- حدد "تلقائي التجربة" علامة التبويب والحصول على صور.
6. تحليل الصور (استنادا إلى الإصدار 1.46h يماغيج.)
- تحويل الملكية PerkinElmer. الملفات المرن لمقاسات الصورة ذات الكلمات الدلالية ملف TIF. باستخدامFlex2Volocity Acapella النصي.
- استيراد الصور في تسلسل كما يماغيج الصورة، مما أدى إلى المكدس.
- تحويل المكدس في hyperstack القناة 2 عن طريق اختيار صورة / Hyperstack / كومة إلى عنصر القائمة Hyperstack. يجب تعيين عدد من شرائح لنصف كومة المستوردة.
- تكرار قناة GFP باستخدام صورة الأمر / مكرر: وضع علامة في خانة الاختيار hyperstack مكررة وتحديد القنوات: 1-1. استخدام الآخرة المكدس المكررة.
- حدد عملية تحسين / التباين مع بكسل المشبعة 0.01٪، وذلك باستخدام الرسم البياني كومة وتحويل إلى 8 بت مع Image/Type/8-bit.
- تحديد دائرة نصف قطرها 15 بكسل تجزئة التكيف المحلي باستخدام خوارزمية Bernsen مع عتبة النقيض (معلمة 1) س = 30. وضع علامة في خانة الاختيار كائنات الابيض يوم خلفية سوداء في القائمة صورة / ضبط / سيارات عتبة المحلية.
- تجزئة مراقبة الجودة: توليد مجزأة تراكب كفاف الكائن على الصور الأصلية.
- Featuإعادة استخراج جزيئات من خلال تحليل: منطقة القياس، يعني وكثافة الإجمالية لكل عضية. حفظ الملفات النتيجة.
- فتح الملف في ذلك ميزات R وإنشاء المدرج التكراري.
7. ممثل النتائج
في ظل الظروف العادية يتم ترجمة Grb2 في جميع أنحاء الخلية بأكملها. على التحفيز لمستقبلات عوامل النمو من translocates إلى غشاء البلازما والمنضوية في وقت لاحق في الإندوسومات كما هو موضح في الشكل 4. التعبير عن مستقبلات سطح خلية قادرة على Grb2 ملزمة كافية لإحداث هذا النبات. في تجربة نموذجية الفرز، ويلاحظ أي تغيير في GFP-Grb2 الترجمة. ومع ذلك، عندما يتم التعبير عن البروتين الذي المجندين Grb2 إلى موقع الفرعي الخلوية، هناك تغيير في الترجمة التي يمكن تصور بسهولة عن طريق الفحص المجهري مضان. للتعبير، مثلا من نتائج EGFR في إعادة المركزية من GFP-Grb2 لدخلول؛ جسيم داخلي مثل الهياكل (الشكل4). وهكذا، عند تطبيق مكتبة الجينوم على نطاق، يمكن توقع أن الرواية يمكن تحديد سطح الخلية Grb2 ملزم البروتينات.
لا يقتصر هذا الأسلوب لاكتشاف البروتينات سطح الخلية. على سبيل المثال، يؤدي الى تغيير Dynamin2 في شبه الخلوية توطين GFP-Grb2 عرض دخلول؛ جسيم داخلي مثل التوظيف (الشكل 5). Dynamin2 يربط إلى المجال SH3 C-محطة من Grb2 وتشارك في هذا الإلتقام 9،10 المعقدة. وبالتالي، فإن هذا النهج يتيح تحديد مجمعات البروتين عامة ملزمة وعلى سبيل المثال لا تحديد الشركاء التفاعل للمجال SH2.
ويمكن توقع عدة أنواع مختلفة من النبات مثل الترجمة إلى غشاء البلازما، لالإندوسومات، غيرها من الهياكل حويصلي أو حشوية إلى النواة. ولذلك، فمن المستحسن أن يتم تفتيشها أيضا جميع الصور عن طريق العين. ومع ذلك، عندما فحص مجموعات كبيرة من cDNAs الآليالصورة خوارزمية التحليل هو أكثر عملية. في هذه الحالة، وهو مزيج من خوارزميات أمر مرغوب فيه، مثل الكشف عن المكان لتحديد الإندوسومات، السيتوبلازم / نواة الكشف لتحديد خوارزميات المورفولوجية النووية مكوكية وعامة لتحديد شكل التغييرات الخلوية. وقد سبق بيان استخدام طرق الكشف هذه المظهرية مختلفة بمزيد من التفصيل في مكان آخر 11.
الشكل 1. الخطة الشاملة للتجربة. تفاصيل التجربة كاملة سير العمل الفرز الفائق المحتوى بدءا من التضخيم وإعداد مكتبة [كدنا]، [كدنا] ترنسفكأيشن من ناقلات بالإضافة إلى بنيات مراسل، الحصول على الصور وتحليل الصور باستخدام برامج مجانية مفتوحة يماغيج.
Figure 2. تكوين من سطح السفينة TECAN. (1) على الجانب الأيسر، وخمسة أحواض 100 مل يلزم سدها مع مخازن 1 (40 مل)، 2 (40 مل)، 3 (50 مل)، AW (60 مل) وA4 (100 مل). سوف A4 الحوض الصغير بحاجة إلى إعادة ملء مرة أثناء العملية. (2) يقع على موقف فراغ مشعب 14 في هذا المثال. (3) يقع وحة deepwell مع حبيبات البكتيرية على موقف 30، بجوار حوض شطف العازلة مع 25 مل العازلة شطف. (4) نصائح القابل للتصرف لرئيس القناة 8-يلزم تحميله في رفوف تلميح على الجانب الأيسر ونصائح لرئيس الأقنية يلزم سدها على الموقف 40. وقد تم تجهيز السائل FreedomEvo TECAN معالج يستخدم في هذه التجربة مع 500 ميكرولتر الحقن. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الرقم3. أتمتة الحصول على الصور على LX أوبرا. A) حدد علامة التبويب تكوين (1). تفعيل خطوط ليزر اللازمة لتجربة (2). حدد الكاميرات لالتقاط صور (3). حدد نوع العدسة والهدف وحة للتجربة (4). B) حدد علامة التبويب المجهر (1). تحديد مصدر الضوء وزمن التعرض للتعرض 1 (2،3). التركيز على واحد جيد واتخاذ ارتفاع (4). C) حدد علامة التبويب تعريف التجربة (1). سحب وإسقاط التعرض، skewcrop، والإشارة، وتخطيط الملفات sublayout (2). سحب وإسقاط ملف التجربة (3). D) الاختيار التلقائي التجربة (1). سحب وإسقاط ملف التجربة (2). تخصيص الباركود المناسب (3). بدء الحصول على الصور من خلال النقر على زر البداية (4). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 5. مثال [كدنا] الناجم عن إزفاء من GFP-Grb2. وDynamin2 GTPase، التي تشارك في Grb2 بوساطة الإلتقام، يعيد GFP-Grb2 لدخلول؛ جسيم داخلي مثل الهياكل (دائري). في هذه التجربة، وGFP-Grb2 شارك في transfected مع DNM2 إلى خلايا HEK293T. كانت ملطخة الخلايا مع هويشت 33342 تم الحصول عليها بعد 24 ساعة والصور على مكتب مستشار رئيس الوزراءرا LX. يتم عرض؛ حقل واحد من عرض من قناة (GFP) والأشعة فوق البنفسجية والخضراء (هويشت 33342 الأزرق).
Discussion
الاستنساخ التعبير هو أداة قوية التي استخدمت في الماضي لتحديد المكونات الخلوية رواية مثل مستقبلات مستضدات الفيروسات وخلايا الدم 12. هنا، نحن تصف طريقة لتسهيل التعرف على الرواية المفترضة مستقبلات نقل الإشارة التي تربط لGrb2.
هناك بضع خطوات حاسمة في البروتوكول.
- لإعداد البلازميد الآلي فإنه من الضروري للغاية أن يكون إعادة تعليق بيليه كاملة من البكتيريا. في بعض الأحيان، فمن الضروري أن تدرج خطوة صارمة أو تهز مزيد من خلط مع ماصات.
- إضافة إلى حل 2 و 3، واستكمال خلط أمر ضروري، ونحن قد وجدت أن قلب يدويا لوحة مختومة هو أكثر كفاءة من استخدام وسيلة شاكر الآلي. وينبغي تجنب Pipetting في هذه الخطوة لأنه يؤدي إلى قص من الحمض النووي.
- في جميع الخطوات فراغ، على المرء أن تأكد من أن يتم تصريف السائل تمامامن لوحة. العائدات المنخفضة على خلاف ذلك وينتظر أن تتم.
- على شطف، فمن الشائع جدا أن يسقط شطافة شكل في الجزء السفلي من لوحة الربط البلازميد. هذه القطرات تحتاج إلى جمعها في لوحة شطف، لذلك فمن المستحسن أن يتم رفع لوحة البلازميد ملزم بعناية ويتم نقل أي بعناية قطرات متبقية في أسفل لوحة شطافة.
- خلال ترنسفكأيشن، وقت تشكيل المعقدة أمر بالغ الأهمية. نتمسك عادة إلى 20-30 دقيقة. أوقات أطول تصل إلى 1 ساعة على ما يرام دون انخفاض في العائد، في حين لا ينصح أقصر الأوقات.
- لالمجهري، واختيار التكبير هو المهم. على النظام LX أوبرا المستخدمة هنا، القرار في 20X كافية للحصول على صور عالية الجودة. إذا كانت هناك حاجة الصور دقة أعلى، يمكن تغيير الهدف، ولكن من أجل الحصول على أرقام ذات دلالة إحصائية من الخلايا، هناك حاجة لعدد أكبر من المجالات واكتساب أضعاف. بشكل عام، ونحن نهدفللحصول على ما لا يقل عن 100 خلية لكل بئر تصويرها.
وقد استخدم الفحص إزفاء Grb2 من قبل مجموعات أخرى لتحديد جزيء صغير مثبطات كيناز تفعيل EGFR 6. في هذه الحالة، يتم تنشيط EGFR على وجه التحديد مع يجند تسبب تجنيد Grb2 إلى غشاء البلازما. ويمكن بعد ذلك تعطيل هذا التفاعل يتم التحقيق باستخدام مركبات جزيء صغير. وبالمثل، فإنه يمكن تصور أن يمكن استخدام شاشات سيرنا الذاتية لتحديد الجينات المشاركة في EGFR-Grb2 إشارات أو غيرها من عامل النمو Grb2 ملزم المستقبلات مثل C-KIT أو مستقبلات إرثروبويتين. وبالتالي، هناك العديد من التطبيقات المحتملة لهذه التقنية. ويمكن تطبيق نهج مماثل لأنظمة مراسل GFP الموسومة لجزيئات أخرى مثل محول حالات العسر الشديد، أو جاب IRS.
واحد الميزة الرئيسية لاستخدام هذا الفحص خلية القاعدة في خلايا الثدييات هو أنه يمكن تحديد الرطوبة من الناحية الفسيولوجيةالتفاعلات evant. الفحص هو قراءات لتشكيل البروتين معقدة، ولكن الأهم من ذلك، يتم رصد التفاعلات ذات الصلة في موقع شبه الخلوية الصحيح. وفي هذا الصدد، يتغلب على هذه التقنية الفنية من غيرها من وسائل التفاعل البروتين البروتين مثل الخميرة الهجين اثنين أو في المقايسات المختبر. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن التفاعلات غير مباشرة قد يؤدي أيضا إلى تجنيد Grb2. وبالمثل، قد يكون ذلك حافزا ليصل النسخي تنظيم الشركاء ملزمة التعبير [كدنا]. للتمييز بين هذه الاحتمالات، فمن الضروري لتنفيذ المقايسات المناسبة الثانوي للتمييز بين الآثار المباشرة وغير المباشرة ملزمة.
في الختام، إزفاء جزيء GFP-محول فحص وعود قدرة عالية على فحص الجينوم على نطاق والتطبيقات اكتشاف المخدرات.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية وماري كوري الدولية مخطط المنح إعادة الإدماج (لJKV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cDNA library | Origene | ||
| LB+amp | |||
| Gas-permeable seals | ThermoScientific | AB-0718 | |
| Nucleospin 96 Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740625.4 | |
| Transfectin | BioRad | 170-3351 | |
| H–chst33342 | Molecular Probes | H3570 | |
| Viewplate 96 F TC | PerkinElmer | 6005182 | |
| RapidPick | Hudson | Norgren CP7200 | |
| Freedom Evo | Tecan | With vacuum manifold | |
| Multidrop 384 | Thermo | ||
| Opera LX | PerkinElmer |
References
- Sastry, L., Cao, T., King, C. R. Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells. Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).
- Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling. Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).
- Bisson, N. Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor. Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).
- Ketteler, R. The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays. J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).
- Yamazaki, T. Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization. J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).
- Antczak, A. Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators. in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).
- Su, J., Batzer, A., Sap, J. Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2. J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).
- Hertog, J. den, Tracy, S., Hunter, T. Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo. Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).
- Miki, H. Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain. J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).
- Seedorf, K. Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2. J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).
- Carpenter, A. E. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Seed, B. Developments in expression cloning. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).
