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Biology

एक उच्च सामग्री इमेजिंग कार्यप्रवाह अभिव्यक्ति क्लोनिंग द्वारा अध्ययन Grb2 परिसर संकेत

Published: October 30, 2012 doi: 10.3791/4382

Summary

सक्षम transmembrane रिसेप्टर्स संकेत उपन्यास की पहचान के लिए एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग पद्धति में वर्णित है. इस पद्धति का बड़े पैमाने पर स्वचालन करने के लिए उत्तरदायी है और के बारे में भविष्यवाणी की अनुमति देता है

Protocol

1. सीडीएनए अभिव्यक्ति क्लोन उठा

  1. सीडीएनए लाइब्रेरी एकल बैक्टीरिया ग्लिसरॉल शेयरों में एक 96-अच्छी तरह से प्रारूप में क्लोन के रूप में प्रदान की जाती है. पिकर मेनू में Norgen CP7200 Rearray कमांड का प्रयोग, स्रोत थाली और टीका लगाना से 1.5 मिलीग्राम / एक 96 deepwell (1 मिलीलीटर अच्छी तरह से) की थाली में लेग amp में बैक्टीरियल क्लोनों लेने.
  2. एक गैस पारगम्य सील साथ deepwell प्लेटें सील और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन में रातोंरात सेते हैं.

2. सीडीएनए अभिव्यक्ति लाइब्रेरी की तैयारी

  1. Deepwell 2,000 rpm पर 20 मिनट के लिए एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में थाली adapters का उपयोग बैक्टीरिया युक्त प्लेटें स्पिन.
  2. कुओं से मीडिया Aspirate, बैक्टीरियल गोली बरकरार जा.
  3. लैब स्वचालन वर्कस्टेशन के डेक कॉन्फ़िगर के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है. प्लाज्मिड तैयारी के लिए समाधान troughs 1-5 में वितरित कर रहे हैं और deepwell प्लेट डेक पर रखा गया है. क्षालन समाधान के साथ एक multiwell गर्तआसन्न deepwell थाली करने के लिए रखा है. युक्तियाँ टिप रैक में लोड कर रहे हैं.
  4. निर्वात कई गुना इकट्ठा. प्लाज्मिड बाध्यकारी प्लेट कई गुना के अंदर रखा गया है और प्लाज्मिड फिल्टर प्लेट कई गुना के शीर्ष पर रखा गया है.
  5. Pipetting और नीचे 250 μl समाधान 1 (Resuspension बफर) के साथ छर्रों Resuspend.
  6. 250 μl समाधान 2 (lysis बफर) के अलावा द्वारा बैक्टीरिया lyse. प्लेट और सील पूरा मिश्रण की अनुमति उलटा.
  7. 2 मिनट टाइमर शुरू.
  8. 350 μl 3 समाधान (Neutralisation बफर) जोड़ें. थाली सील और 3 बार पलटना.
  9. प्लाज्मिड फ़िल्टर प्लेटों को बैक्टीरियल lysates स्थानांतरण.
  10. 5 मिनट के लिए वैक्यूम लागू.
  11. फ़िल्टर थाली निकालें और कई गुना के शीर्ष पर बाध्यकारी प्लेट जगह है. 1 मिनट के लिए वैक्यूम लागू.
  12. अतिरिक्त (ऐडवर्ड्स) धोने बफर के 500 μl जोड़ें.
  13. 2 मिनट के लिए वैक्यूम लागू.
  14. धोने बफर 4 समाधान के 900 μl जोड़ें. 2 मिनट के लिए वैक्यूम लागू.
  15. दोहराएँ है2.14 tep. एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए वैक्यूम लागू.
  16. डीएनए कई गुना अंदर संग्रह प्लेट रखें. बाध्यकारी प्लेट क्षालन बफर के 100 μl जोड़ें और 2 मिनट के लिए सेते हैं.
  17. 10 मिनट के लिए वैक्यूम.
  18. संग्रह की थाली और उपाय डीएनए एकाग्रता को Nanodrop 8000 प्रयोग निकालें. आमतौर पर ~ की एक उपज 100 एनजी / μl इस विधि के साथ उम्मीद की जा सकती है.

3. सेल सीडिंग

  1. HEK293 कोशिकाओं और trypsinized गिना रहे हैं.
  2. 2 x 10 4 कोशिकाओं एक PerkinElmer ThermoFisher 96-अच्छी तरह multidrop का उपयोग Viewplate प्रत्येक कुएं में तिरस्कृत कर रहे हैं.
  3. कोशिकाओं 37 पर रातोंरात incubated हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.

4. अभिकर्मक

  1. 25 μl सीरम मुक्त मध्यम में प्रति अच्छी तरह से एक दौर 96 अच्छी तरह से थाली नीचे में 100 सीडीएनए एनजी के साथ 100 एनजी GFP-Grb2 प्लास्मिड डीएनए के एक मिश्रण तैयार करें.
  2. 25 μl सीरम मुक्त अच्छी तरह से प्रति 0.5 μl Transfectin वाले मीडिया जोड़ें.
  3. मिश्रण और टाइमर के लिए शुरूr 30 मिनट.
  4. एक सौम्य वितरण पद्धति का उपयोग करके कोशिकाओं सीडीएनए / Transfectin मिश्रण के 50 μl स्थानांतरण. वैकल्पिक रूप से, अभिकर्मक मिश्रण प्लेटों में 1 तिरस्कृत कर सकते हैं और फिर कोशिकाओं शीर्ष पर जोड़ा (रिवर्स अभिकर्मक).
  5. 37 पर रातोंरात कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.

5. छवि अधिग्रहण

  1. ओपेरा सॉफ्टवेयर शुरू करो. प्रयोग की स्थापना के एक स्क्रीन स्नैपशॉट चित्रा 3 में दिखाया गया है. "विन्यास" टैब का चयन करें और 20x उद्देश्य और सही थाली प्रकार का चयन करें. "कॉलर" उद्देश्य पर सही मूल्य सुनिश्चित करने के लिए सेट कर दिया जाता है लिए अलग थाली प्रकार के साथ ध्यान केंद्रित करने के लिए अनुमति देने के लिए.
  2. "माइक्रोस्कोप" टैब चुनें. FITC (488 लेजर) और 2 जोखिम के रूप में परिभाषित 1 जोखिम यूवी (365 लेजर). दोनों जोखिम पर यूवी फिल्टर सक्रिय और जोखिम 1 1 कैमरा और 2 कैमरा 2 जोखिम आवंटित. 800 मिसे 1 जोखिम और 2 प्रदर्शन के लिए 40 मिसे के लिए जोखिम बार सेट.
  3. "माइक्रोस्कोप" टैब चुनें. ई परिभाषित करें(488 लेजर) FITC और यूवी (365 लेजर) के रूप में 2 जोखिम के रूप में 1 xposure. दोनों जोखिम पर यूवी फिल्टर सक्रिय और जोखिम 1 1 कैमरा और 2 कैमरा 2 जोखिम आवंटित. 800 मिसे 1 जोखिम और 2 प्रदर्शन के लिए 40 मिसे के लिए जोखिम बार सेट.
  4. 1 जोखिम का चयन करें. सेट 0 सुक्ष्ममापी ऊंचाई ध्यान केंद्रित. "ध्यान" का चयन करें. एक बार ध्यान केंद्रित, 1 कैमरे का पर्दाफाश. ध्यान ऊंचाई को समायोजित करने के लिए जोखिम विमान अनुकूलन और "लो ऊंचाई पर क्लिक करें. जोखिम बार और लेजर शक्ति बदलें ~ 3000 की एक अधिकतम पिक्सेल तीव्रता दे. जोखिम मापदंडों को बचाओ. प्रदर्शन के लिए 2 दोहराएँ.
  5. "प्रयोग परिभाषा" टैब का चयन करें. लेआउट और sublayout बनाएँ. खींचें और प्रासंगिक लेआउट, जोखिम, संदर्भ छवि skewcrop फ़ाइल और sublayout ड्रॉप. प्रयोग सहेजें.
  6. "स्वचालित प्रयोग" टैब का चयन करें और छवियों को प्राप्त है.

6. छवि विश्लेषण (ImageJ 1.46h संस्करण पर आधारित है.)

  1. कन्वर्ट मालिकाना PerkinElmer फ्लेक्स फ़ाइलें. टैग्ड इमेज फार्मैट tif फ़ाइल का उपयोग करते हुएFlex2Volocity Acapella स्क्रिप्ट.
    1. एक छवि अनुक्रम के रूप में ImageJ में छवियाँ आयात करने के लिए, एक ढेर में जिसके परिणामस्वरूप.
    2. एक 2 चैनल hyperstack में छवि / Hyperstack / Hyperstack मेनू आइटम के लिए ढेर का चयन करके ढेर में परिवर्तित. स्लाइस के संख्या आयातित ढेर के आधे के लिए सेट किया जाना चाहिए.
    3. GFP छवि / डुप्लिकेट आदेश का उपयोग चैनल डुप्लिकेट: डुप्लिकेट hyperstack चेकबॉक्स टिक और चैनल निर्दिष्ट करें: 1-1. इसके बाद दोहराया ढेर का उपयोग करें.
  2. प्रक्रिया / 0.01% संतृप्त पिक्सल के साथ कंट्रास्ट बढ़ाने का चयन करें, ढेर हिस्टोग्राम का उपयोग और Image/Type/8-bit साथ 8 बिट के साथ परिवर्तित.
  3. एक 15 पिक्सेल त्रिज्या स्थानीय अनुकूली विपरीत (1 पैरामीटर) सीमा q = 30 साथ Bernsen एल्गोरिथ्म का उपयोग कर विभाजन परिभाषित करें. काले रंग की पृष्ठभूमि चेकबॉक्स पर छवि समायोजित / ऑटो / स्थानिय थ्रेसहोल्ड मेनू में व्हाइट वस्तुओं टिक.
  4. विभाजन गुणवत्ता नियंत्रण: मूल छवियों पर खंडों वस्तु समोच्च उपरिशायी उत्पन्न करते हैं.
  5. Featuकणों का विश्लेषण करके निकासी: मापने क्षेत्र का मतलब है, और प्रत्येक organelle की कुल तीव्रता. परिणाम फ़ाइलें सहेजें.
  6. आर में सुविधाओं परिणाम फ़ाइल खोलें और एक हिस्टोग्राम उत्पन्न.

7. प्रतिनिधि परिणाम

सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत Grb2 पूरे सेल भर स्थानीयकृत है. एक वृद्धि कारक रिसेप्टर की उत्तेजना होने पर यह प्लाज्मा झिल्ली translocates है और बाद में endosomes में भली भाँति के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है. बाध्यकारी Grb2 में सक्षम एक कोशिका की सतह रिसेप्टर की अभिव्यक्ति इस स्थानान्तरण के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है. एक ठेठ स्क्रीनिंग प्रयोग में, GFP-Grb2 स्थानीयकरण में कोई परिवर्तन नहीं मनाया जाता है. हालांकि, जब एक प्रोटीन व्यक्त की है कि एक उप सेलुलर साइट रंगरूटों Grb2, वहाँ स्थानीयकरण में एक परिवर्तन है कि आसानी से कल्पना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के द्वारा किया जा सकता है. Endosome संरचनाओं की तरह GFP-Grb2 के relocalization में EGFR परिणामों की अभिव्यक्ति है, उदाहरण के लिए (चित्रा) 4. इस प्रकार, जब एक जीनोम चौड़ा पुस्तकालय आवेदन, यह उम्मीद की जा Grb2 बाध्यकारी है कि उपन्यास कोशिका की सतह प्रोटीन की पहचान की जा सकती है.

इस विधि कोशिका की सतह प्रोटीन का पता लगाने के लिए सीमित नहीं है. उदाहरण के लिए, Dynamin2 उप सेलुलर GFP-Grb2 endosome की तरह भर्ती (5 चित्रा) प्रदर्शित करने के स्थानीयकरण में परिवर्तन लाती है. सी टर्मिनल Grb2 SH3 डोमेन के लिए Dynamin2 बांध और इस जटिल 9,10 के endocytosis में शामिल है. इस प्रकार, इस दृष्टिकोण सामान्य प्रोटीन बाध्यकारी परिसरों की पहचान के लिए सक्षम बनाता है और SH2 डोमेन के लिए बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए सीमित नहीं है.

स्थानान्तरण के कई अलग अलग प्रकार के लिए endosomes जैसे प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण के रूप में उम्मीद की जा सकती है, अन्य cytoplasmic vesicular संरचना या नाभिक. इसलिए, यह सिफारिश की है कि सभी छवियों को भी आंखों से निरीक्षण कर रहे हैं. हालांकि, जब बड़े सेट स्क्रीनिंग एक स्वचालित cDNAsछवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म अधिक व्यावहारिक है. इस मामले में, एल्गोरिदम का एक संयोजन वांछनीय हाजिर करने के लिए endosomes, cytoplasm / नाभिक का पता लगाने की पहचान करने के लिए परमाणु चक्कर और सामान्य morphological एल्गोरिदम की पहचान करने के लिए सेलुलर आकार में परिवर्तन की पहचान का पता लगाने के रूप में है, जैसे. इन विभिन्न प्ररूपी तरीकों का पता लगाने का उपयोग 11 कहीं अधिक विस्तार से चर्चा की गई है.

चित्रा 1
चित्रा 1 प्रयोग की समग्र योजना. प्रयोग पूरी तरह से उच्च सामग्री स्क्रीनिंग कार्यप्रवाह प्रवर्धन और सीडीएनए लाइब्रेरी की तैयारी सीडीएनए वैक्टर प्लस संवाददाता constructs, छवि अधिग्रहण और छवि विश्लेषण का उपयोग कर मुक्त खुला सॉफ्टवेयर IMAGEJ अभिकर्मक के साथ शुरू विवरण.

चित्रा 2
एफigure 2 Tecan डेक का विन्यास. (1) बाईं ओर, पांच 100 मिलीलीटर troughs 1 buffers (40 मिलीग्राम), 2 (40 मिलीग्राम), 3 (50 मिलीग्राम), (60 मिलीग्राम) ऐडवर्ड्स और A4 (100 मिलीलीटर) के साथ भरा जाना चाहिए. गर्त A4 प्रक्रिया के दौरान एक बार फिर से भरा आवश्यकता होगी. (2) निर्वात कई गुना इस उदाहरण में 14 स्थान पर स्थित है. (3) जीवाणु छर्रों के के साथ deepwell प्लेट 30 स्थिति, क्षालन बफर गर्त में 25 मिलीलीटर क्षालन बफर के साथ बगल में स्थित है. (4) 8-चैनल सिर के लिए डिस्पोजेबल युक्तियाँ बाईं ओर और सुझावों पर टिप रैक के में multichannel सिर के लिए लोड किया जा की जरूरत के लिए 40 स्थान पर भरा जाना चाहिए. Tecan FreedomEvo तरल हैंडलर है कि इस प्रयोग में प्रयोग किया जाता है 500 μl सीरिंज के साथ सुसज्जित है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा3. ओपेरा LX पर छवि अधिग्रहण स्वचालन. ए) विन्यास टैब (1) का चयन करें. लेजर प्रयोग (2) के लिए आवश्यक लाइनों को सक्रिय करें. छवि अधिग्रहण (3) के लिए कैमरों का चयन करें. प्लेट और प्रयोग (4) के लिए उद्देश्य लेंस प्रकार का चयन करें. बी) खुर्दबीन टैब (1) का चयन करें. प्रकाश स्रोत और जोखिम 1 (2,3) के लिए जोखिम समय को परिभाषित करें. अच्छी तरह से एक पर ध्यान दें और ऊंचाई (4) ले लो. सी) प्रयोग परिभाषा टैब (1) का चयन करें. खींचें और ड्रॉप जोखिम, skewcrop, संदर्भ, लेआउट, और sublayout फ़ाइलें (2). खींचें और ड्रॉप प्रयोग फ़ाइल (3). डी) स्वचालित प्रयोग (1) का चयन करें. खींचें और ड्रॉप प्रयोग फ़ाइल (2). उपयुक्त बारकोड (3) का आवंटन. प्रारंभ बटन (4) पर क्लिक करके छवि अधिग्रहण शुरू बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4

चित्रा 5
चित्रा 5. सीडीएनए प्रेरित GFP-Grb2 के स्थानान्तरण के उदाहरण. GTPase Dynamin2, जो endocytosis Grb2 की मध्यस्थता में शामिल है endosome संरचनाओं की तरह (परिक्रमा) GFP-Grb2 relocates. इस प्रयोग में, GFP-Grb2 किया गया था DNM2 HEK293T कोशिकाओं में साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट. कोशिकाओं Hoechst 33342 के साथ दाग थे 24 घंटे के बाद और छवियों Ope पर हासिल किया गयाra LX. ग्रीन चैनल (GFP) के दृश्य का एक क्षेत्र और पराबैंगनी (नीला, Hoechst 33342) प्रदर्शित होता है.

Discussion

अभिव्यक्ति क्लोनिंग एक शक्तिशाली उपकरण है कि अतीत में इस्तेमाल किया गया है वायरस रिसेप्टर्स और रक्त सेल प्रतिजनों 12 के रूप में इस तरह के उपन्यास सेलुलर घटकों की पहचान है. यहाँ, हम उपन्यास ख्यात संकेत पारगमन रिसेप्टर्स कि Grb2 करने के लिए बाध्य की पहचान की सुविधा के लिए एक विधि का वर्णन है.

प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं.

  1. स्वचालित प्लाज्मिड तैयारी के लिए यह बिल्कुल जरूरी है बैक्टीरियल गोली का पूरा resuspension है. कभी कभी, यह एक कठोर मिलाते कदम या आगे pipettes साथ मिश्रण शामिल करने के लिए आवश्यक है.
  2. समाधान 2 और 3 के अलावा होने पर, मिश्रण पूरा आवश्यक है और हमने पाया है कि मैन्युअल inverting सील प्लेट एक स्वचालित हिलनेवाला के उपयोग की तुलना में कुशल है. Pipetting इस कदम पर बचा जाना चाहिए क्योंकि यह डीएनए के कर्तन के लिए नेतृत्व करेंगे.
  3. सभी वैक्यूम चरणों में, एक करने के लिए सुनिश्चित करें कि तरल पूरी तरह से सूखा हैथाली से. अन्यथा कम पैदावार के लिए उम्मीद की जा रही है.
  4. क्षालन पर, यह काफी आम है कि प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक प्लाज्मिड बाध्यकारी प्लेट के नीचे रूप बूँदें. इन बूंदों क्षालन थाली में एकत्र होने की जरूरत है, इसलिए यह सिफारिश की है कि प्लाज्मिड बाध्यकारी थाली ध्यान से उठाया है और तल पर किसी भी अवशिष्ट बूँदें ध्यान प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक प्लेट के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं.
  5. अभिकर्मक के दौरान, जटिल गठन के समय महत्वपूर्ण है. हम आम तौर पर 20-30 मिनट के लिए पालन. 1 घंटे के लिए अब बार उपज में कमी के बिना ठीक कर रहे हैं, जबकि छोटे समय सिफारिश नहीं कर रहे.
  6. माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ाई के चुनाव महत्वपूर्ण है. ओपेरा LX यहाँ प्रणाली का इस्तेमाल किया, 20x पर संकल्प करने के लिए उच्च गुणवत्ता के चित्र मिल पर्याप्त है. यदि उच्च संकल्प छवियों के लिए आवश्यक हैं, उद्देश्य, बदला जा सकता है लेकिन क्रम में कोशिकाओं के सांख्यिकीय महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त करने के लिए, खेतों और उच्च अधिग्रहण बार के एक उच्च संख्या के लिए आवश्यक हैं. सामान्य में, हम उद्देश्यकम से कम 100 कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रति imaged मिलता है.

Grb2 स्थानान्तरण परख अन्य समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया है EGFR kinase सक्रियण 6 के छोटे अणु inhibitors की पहचान. उस मामले में, EGFR ligand प्लाज्मा झिल्ली Grb2 की भर्ती के कारण के साथ विशेष रूप से सक्रिय है. इस बातचीत का विघटन तो छोटे अणु यौगिकों का उपयोग कर जांच की जा सकता है. इसी तरह, यह माना जा सकता है कि siRNA स्क्रीन अंतर्जात EGFR Grb2 संकेतन या सी किट या erythropoietin रिसेप्टर के रूप में अन्य Grb2 बाध्यकारी वृद्धि कारक रिसेप्टर्स में शामिल जीन की पहचान करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. इस प्रकार, इस तकनीक के लिए कई संभावित आवेदन कर रहे हैं. एक अनुरूप दृष्टिकोण SHC गपशप, या आईआरएस के रूप में अन्य अनुकूलक अणुओं के लिए GFP टैग संवाददाता सिस्टम लागू किया जा सकता है.

स्तनधारी कोशिकाओं में इस सेल आधारित परख का उपयोग करने का एक बड़ा फायदा यह है कि यह physiologically रिलायंस एनर्जी की पहचान सक्षम बनाता हैevant बातचीत. परख प्रोटीन जटिल गठन के लिए एक readout है, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, प्रासंगिक बातचीत सही उप सेलुलर साइट पर निगरानी कर रहे हैं. इस संबंध में, इस तकनीक को अन्य प्रोटीन, प्रोटीन खमीर दो संकर या इन विट्रो assays में के रूप में ऐसी बातचीत के तरीकों से कलाकृतियों काबू. हालांकि यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अप्रत्यक्ष बातचीत भी Grb2 भर्ती में परिणाम हो सकता है. इसी तरह, बाध्यकारी भागीदारों के transcriptional विनियमन सीडीएनए अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. इन संभावनाओं के बीच अंतर है, यह उपयुक्त माध्यमिक assays प्रदर्शन करने के लिए प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से बाध्यकारी प्रभाव के बीच भेद करने के लिए आवश्यक है.

अंत में, GFP अनुकूलक अणु स्थानान्तरण परख जीनोम चौड़ा स्क्रीनिंग और दवाओं की खोज के अनुप्रयोगों के लिए उच्च क्षमता का वादा किया है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम चिकित्सा अनुसंधान परिषद और मैरी क्यूरी अंतर्राष्ट्रीय Reintegration अनुदान योजना (JKV लिए) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cDNA library Origene
LB+amp
Gas-permeable seals ThermoScientific AB-0718
Nucleospin 96 Plasmid Kit Macherey-Nagel 740625.4
Transfectin BioRad 170-3351
H–chst33342 Molecular Probes H3570
Viewplate 96 F TC PerkinElmer 6005182
RapidPick Hudson Norgren CP7200
Freedom Evo Tecan With vacuum manifold
Multidrop 384 Thermo
Opera LX PerkinElmer

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References

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Freeman, J., Kriston-Vizi, J., Seed, More

Freeman, J., Kriston-Vizi, J., Seed, B., Ketteler, R. A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning. J. Vis. Exp. (68), e4382, doi:10.3791/4382 (2012).

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