Summary
En høy-innhold screening metode for identifisering av nye signalering kompetente transmembrane reseptorer er beskrevet. Denne metoden er mottagelig for storskala automatisering og lar spådommer om
Abstract
Signaltransduksjon ved vekstfaktorreseptorer er avgjørende for celler å opprettholde proliferasjon og differensiering og krever streng kontroll. Signaltransduksjon er initiert ved binding av en ekstern ligand til et transmembrant reseptor og aktivering av nedstrøms signalnettverk kaskader. En viktig regulator av mitogen signalering er Grb2, et modulært protein består av en intern SH2 (SRC Homologi 2) domene flankert av to SH3 domener som mangler enzymatisk aktivitet. Grb2 er konstitutivt knyttet til GTPase Son Of Sevenless (SOS) via sin N-terminal SH3 domene. Den SH2 domene Grb2 binder seg til vekstfaktorreseptorer på fosforylerte tyrosinresiduene dermed kopling reseptoraktivering til SOS-Ras-MAP kinase signalisering kaskade. I tillegg har andre roller for Grb2 som en positiv eller negativ regulator av signalering og reseptor endocytose blitt beskrevet. Den modulære sammensetningen av Grb2 tyder på at det kan dokke til en rekke reseptorer og transduce signaler langs en rekke forskjellige baner 1-3.
Beskrevet her er en enkel mikroskopi analysen som overvåker rekruttering av Grb2 til plasmamembranen. Den er tilpasset fra en metode som måler endringer i sub-cellulær lokalisering av grønn-fluorescerende protein (GFP)-merket Grb2 i respons på en stimulus 4-6. Plasma membran reseptorer som binder Grb2 eksempel aktivert Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) rekruttere GFP-Grb2 til plasmamembranen upon cDNA uttrykk og senere omplassering til endosomal oppbevaringsrom i cellen. For å identifisere in vivo protein komplekser av Grb2, kan denne teknikken brukes til å utføre et genom-wide høyt innhold skjermen basert på endringer i Grb2 sub-cellulær lokalisering. Fremstillingen av cDNA-kloner, expression transfeksjon og bildefangst er beskrevet detaljert nedenfor. Sammenlignet med andre genomisk metoder som brukes til å identifisere protein interaksjon partnere, for eksempel gjær-to-hybrid, gjør denne teknikken visualisering av protein komplekser i pattedyrceller på sub-mobilnettet stedet for interaksjon med en enkel mikroskopi-baserte analysen. Derav både kvalitative funksjoner, for eksempel mønstre av lokalisering kan vurderes, samt den kvantitative styrken av interaksjonen.
Protocol
1. Plukke cDNA uttrykk Clones
- CDNA bibliotek er tilgjengelig som enkle bakterielle kloner i glycerol aksjer i en 96-brønns format. Bruke Rearray kommandoen i velgeren menyen i Norgen CP7200, plukke bakterielle kloner fra kilden plate og inokulere inn 1,5 ml LB / amp i en 96-Deepwell (1 ml godt) plate.
- Forsegle Deepwell platene med en gass-gjennomtrengelig tetning og inkuber over natten ved 37 ° C i en shaker.
2. Utarbeidelse av cDNA Expression Library
- Spinne Deepwell plater som inneholder bakterier på 2000 rpm i 20 min ved hjelp av plate adaptere i en bordplate sentrifuge.
- Aspirer medier fra brønnene, forlater bakteriell pellet intakt.
- Konfigurer dekket av Lab automatisering arbeidsstasjonen som vist i figur 2. Løsninger for plasmid forberedelse fordeles inn krybber 1-5 og Deepwell platen er plassert på dekk. En multiwell trau med elueringsoppløsningplasseres tilstøtende til Deepwell plate. Tips er lastet inn i tuppen racks.
- Monter vakuummanifolden. Plasmidet bindingsplate plasseres inne i manifolden og plasmidet filterplaten er plassert på toppen av manifolden.
- Resuspender pellets med 250 pl Løsning 1 (resuspensjon buffer) ved å pipettere opp og ned.
- Lyse bakteriene ved tilsetning av 250 pl Løsning 2 (lysebuffer). Platen er forseglet og invertert for å tillate fullstendig blanding.
- Start 2 minutters timer.
- Legg 350 pl Løsning 3 (Nøytralisering buffer). Forsegle platen og vend 3 ganger.
- Overfør bakterielle lysates til plasmidet filterplater.
- Påfør vakuum i 5 min.
- Fjern filterplaten og plasser bindingsplate på toppen av manifolden. Påfør vakuum i 1 min.
- Legg til 500 ul av ytterligere vask (AW) buffer.
- Påfør vakuum i 2 min.
- Legg 900 pl vaskebuffer Løsning 4. Påfør vakuum i 2 min.
- Gjenta step 2.14. Påfør vakuum for ytterligere 15 minutter.
- Plasser DNA samling plate inne i manifolden. Legg 100 pl elueringsbuffer til bindingsplate og inkuber i 2 min.
- Vakuum i 10 min.
- Fjern samling plate og måle DNA-konsentrasjon ved hjelp av NanoDrop 8000. Vanligvis en yield på ca 100 ng / ul kan forventes med denne metoden.
3. Cell Seeding
- HEK293 celler trypsinert og telles.
- 2 x 10 4 celler dispensert i hver brønn av en PerkinElmer Viewplate bruker ThermoFisher 96-brønns multidrop.
- Celler blir inkubert natten over ved 37 ° C og 5% CO 2.
4. Transfeksjon
- Forbered en blanding av 100 ng GFP-Grb2 plasmid DNA med 100 ng av cDNA i 25 pl serumfritt medium per brønn i en rundbundet 96-brønns plate.
- Legg 25 pl serum-frie medier som inneholder 0,5 ul Transfectin per brønn.
- Bland og starte tidtakeren for 30 min.
- Overfør 50 ul cDNA / Transfectin blanding til celler ved hjelp av en mild dispensering metode. Alternativt kan transfeksjon mix utleveres først inn platene og deretter cellene lagt på toppen (revers transfeksjon).
- Inkuber cellene over natten ved 37 ° C og 5% CO 2.
5. Image Acquisition
- Starter Opera Software. Et skjermbilde øyeblikksbilde av eksperimentet oppsettet er vist i figur 3.. Velg "Configuration"-fanen og velg 20x objektiv og riktig platetype. Sikre "krage" er satt til riktig verdi på målet for å tillate fokus med forskjellige plate typer.
- Velg "Microscope"-kategorien. Definer eksponering 1 som FITC (488 laser) og eksponering 2 som UV (365 laser). Aktiver UV filter på begge eksponeringene og tildele eksponering 1 til kamera 1 og eksponering 2 til kamera 2. Still eksponeringstider til 800 msek for eksponering 1 og 40 msek for eksponering 2.
- Velg "Microscope"-kategorien. Definer exposure 1 som FITC (488 laser) og eksponering 2 som UV (365 laser). Aktiver UV filter på begge eksponeringene og tildele eksponering 1 til kamera 1 og eksponering 2 til kamera 2. Still eksponeringstider til 800 msek for eksponering 1 og 40 msek for eksponering 2.
- Velg eksponering 1. Sett fokus høyde til 0 mikrometer. Velg "Focus". Når fokusert, utsett kameraet en. Juster fokus høyden for å optimalisere eksponeringen flyet og klikk på "Take høyde". Endre eksponeringstider og laser makt for å gi en maksimal pikselintensiteten av ~ 3000. Lagre eksponeringsparametre. Gjenta for eksponering 2.
- Velg "Experiment Definition"-kategorien. Lag layout og sublayout. Dra og slipp den aktuelle layout, eksponering, referansebilde, skewcrop fil og sublayout. Lagre eksperiment.
- Velg "Automatic Experiment"-fanen og hente bilder.
6. Bildeanalyse (Basert på ImageJ 1.46h versjon.)
- Konverter proprietære PerkinElmer. Flex filer til Tagged Image Format. TIF-fil ved hjelp avFlex2Volocity Acapella script.
- Importere bilder i ImageJ som en bildesekvens, noe som resulterer i en stabel.
- Konverter bunken inn en 2 kanals hyperstack ved å velge Image / Hyperstack / Stack til Hyperstack menyvalget. Antallet skiver må være satt til halvparten av den importerte stabelen.
- Duplisere GFP kanal med Image / kommandoen Dupliser: kryss Dupliser hyperstack boksen og angi Kanaler: 1-1. Heretter bruke duplisert stabelen.
- Velg Prosess / forbedre kontrasten med 0,01% mettet piksler, med stack histogram og konvertere til 8 bit med Image/Type/8-bit.
- Definer en 15 pixel radius lokale adaptive segmentering bruker Bernsen algoritmen med kontrast terskel (Parameter 1) q = 30. Kryss av hvite objekter på svart bakgrunn boksen i Image / Tilpass / Auto Local Threshold menyen.
- Segmentering kvalitetskontroll: generere segmentert objekt contour overlegg på de opprinnelige bildene.
- Feature ekstraksjon ved å analysere partikler: måling område, betyr og totale intensiteten av hver organeller. Lagre resultat filer.
- Åpne funksjoner resultatet filen i R og generere et histogram.
7. Representant Resultater
Under normale forhold Grb2 er lokalisert gjennom hele cellen. Ved stimulering av en vekstfaktorreseptor translocates det til plasmamembranen og er senere internalisert inn endosomes som vist i figur 4. Uttrykket for en celle overflate reseptor stand til å binde Grb2 er tilstrekkelig til å indusere denne translokasjon. I en typisk screening eksperiment, er ingen endring i GFP-Grb2 lokalisering observert. Imidlertid, når et protein er uttrykt som rekrutterer Grb2 til en sub-cellulær området, er det en endring i lokalisering som kan være lett visualisert ved fluorescens mikroskopi. For eksempel uttrykk for EGFR resulterer i relocalization av GFP-Grb2 til endosome-lignende strukturer (figur4). Således, ved anvendelse et genom-wide biblioteket, kan det forventes at romanen Grb2-bindende celleoverflaten proteiner kan identifiseres.
Denne metoden er ikke begrenset til påvisning av celle overflateproteiner. For eksempel induserer Dynamin2 en endring i sub-cellulær lokalisering av GFP-Grb2 viser endosome-lignende rekruttering (figur 5). Dynamin2 bindes til den C-terminale domene av SH3 Grb2 og er involvert i endocytose av dette komplekse 9,10. Således muliggjør denne tilnærmingen identifisering av generelle proteinbindende komplekser og er ikke begrenset til identifisering av interaksjon partnere for SH2 domenet.
Flere forskjellige typer av translokasjon kan forventes som lokalisering til plasmamembranen, til endosomer, andre cytoplasmiske vesicula strukturer eller til kjernen. Derfor anbefales det at alle bilder er også kontrollert av øyet. Men når screening store sett av cDNA'ene en automatisertbildeanalyse algoritmen er mer praktisk. I dette tilfellet, er en kombinasjon av algoritmer ønskelig, for eksempel for å identifisere spot deteksjon endosomes, cytoplasma / nucleus deteksjon å identifisere kjernefysiske shuttling og generell morfologiske algoritmer for å identifisere cellulære form endringer. Bruken av disse forskjellige fenotypiske påvisningsmetoder har vært diskutert i mer detalj et annet sted 11.
Figur 1. Generell ordning av eksperimentet. Eksperimentet detaljer en komplett høyt innhold screening arbeidsflyt starter med forsterkning og forberedelse av cDNA bibliotek, transfeksjon av cDNA vektorer pluss reporter konstruerer, bildefangst og bildeanalyse ved hjelp av gratis open programvare IMAGEJ.
Figur 2. Konfigurasjon av Tecan Deck. (1) På venstre side, fem 100 ml trau må fylles med buffere 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) og A4 (100 ml). Trough A4 må etterfylles en gang i løpet av prosedyren. (2) The vakuummanifold ligger på posisjon 14 i dette eksemplet. (3) Den Deepwell plate med bakterielle pellets ligger på posisjon 30, ved siden av elueringsbuffer trau med 25 ml elueringsbuffer. (4) Engangs tips for 8-kanals hode må legges i spissen racks på venstre side og tips for flerkanals hodet må fylles på posisjon 40. Den Tecan FreedomEvo flytende handler som brukes i dette eksperimentet er utstyrt med 500 ul sprøyter. Klikk her for å se større figur .
Figur3. Automatisering av bildeopptak på Opera LX. A) Velg kategorien Konfigurasjon (1). Aktivere laseren linjer som kreves for eksperimentet (2). Velg kameraene for bildeopptak (3). Velg platetype og objektiv for forsøket (4). B) Velg mikroskop kategorien (1). Definer lyskilden og eksponeringstid for eksponering en (2,3). Fokusere på ett godt og ta høyde (4). C) Velg Experiment Definition kategorien (1). Dra og slipp eksponering, skewcrop, referanse, layout og sublayout filer (2). Dra og slipp forsøket filen (3). D) Velg Automatisk Experiment (1). Dra og slipp eksperiment fil (2). Tildele passende strekkode (3). Starte bildeopptak ved å klikke på Start-knappen (4). Klikk her for å se større figur .
Figur 5. Eksempel på cDNA-indusert translokasjon av GFP-Grb2. Den GTPase Dynamin2, som er involvert i Grb2 endocytose, flytter GFP-Grb2 til endosome-lignende strukturer (innringet). I dette eksperimentet, ble GFP-Grb2 ko-transfektert med DNM2 inn HEK293T celler. Celler ble farget med Hoechst 33342 etter 24 timer og bilder ble kjøpt på Opera LX. En synsfelt på den grønne (GFP) kanal og UV (blå, Hoechst 33342) vises.
Discussion
Expression kloning er et kraftig verktøy som har vært brukt i fortiden for å identifisere nye cellulære komponenter som virus reseptorer og blodceller antigener 12. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å lette identifisering av nye formodede signaltransduksjon reseptorer som bindes til Grb2.
Det er noen kritiske trinn i protokollen.
- For automatisert plasmid forberedelse er det helt avgjørende å ha full oppvirvling av den bakterielle pellet. Noen ganger er det nødvendig å inkludere en streng risting trinn eller ytterligere blanding med pipetter.
- Ved tilsetning av løsning 2 og 3, fullstendig blanding er avgjørende, og vi har funnet ut at manuelt invertere forseglede plate er mer effektiv enn ved bruk av en automatisert shaker. Pipettering bør unngås på dette trinnet som det ville føre til skjæring av DNA.
- I alle vakuum trinnene, har man å sikre at væsken er helt utladetfra platen. Ellers lave avlinger er å være forventet.
- Ved eluering er det ganske vanlig at eluatet synker skjemaet nederst av plasmidet bindingsplate. Disse dråpene må hentes i elueringen plate, så det anbefales at plasmidet bindingsplate løftes forsiktig, og eventuelle gjenværende dråper nederst er nøye overført til eluatet plate.
- Under transfeksjon, er tidspunktet for kompleksdannelse kritisk. Vi vanligvis holder seg til 20-30 min. Lengre ganger opptil en time er fint uten reduksjon i utbytte, mens kortere tid anbefales ikke.
- For mikroskopi, er valget av forstørrelse viktig. På Opera LX-systemet som brukes her, er oppløsningen på 20x nok til å få bilder av høy kvalitet. Hvis høyere oppløsning er nødvendig, målet kan endres, men for å få statistisk signifikante antall celler, et høyere antall felt og høyere oppkjøpet ganger nødvendig. Generelt, ønsker viå få minst 100 celler per brønn fotografert.
Den Grb2 translokasjon analysen har blitt brukt av andre gruppe for å identifisere små molekyl inhibitorer av EGFR kinase aktivering 6. I så tilfelle er det EGFR spesifikt aktivert med ligand forårsaker rekruttering av Grb2 til plasmamembranen. Forstyrrelse av denne interaksjonen kan deretter bli undersøkt ved hjelp av små molekyl forbindelser. Likeledes kan det tenkes at siRNA skjermer kan anvendes for å identifisere endogene gener involvert i EGFR-Grb2 signalisering eller andre Grb2-bindende vekstfaktor reseptorer slik som c-kit eller erytropoietinreseptoren. Dermed er det flere mulige bruksområder for denne teknikken. En tilsvarende tilnærming kan brukes til GFP-merket reporter systemer for andre adapter molekyler som SHC, Gab eller skattemyndighetene.
En stor fordel med å bruke denne cellebasert assay i pattedyrceller er at det muliggjør identifisering av fysiologisk relevant interaksjoner. Analysen er en avlesning for protein kompleks dannelse, men enda viktigere, de relevante interaksjoner overvåkes riktig sub-cellulære område. I denne forbindelse, overvinner denne teknikken gjenstander fra andre protein-protein interaksjon metoder som gjær-to-hybrid eller in vitro-analyser. Det bør bemerkes imidlertid at indirekte interaksjoner kan også resultere i Grb2 rekruttering. Tilsvarende kan den transkripsjonelle oppregulering av bindingspartnere bli indusert av cDNA uttrykk. For å skille mellom disse muligheter, er det nødvendig å utføre de hensiktsmessige sekundære analyser for å skille mellom direkte og indirekte bindingseffektene.
I konklusjonen, lover GFP-adapter molekyl translokasjon analysen stort potensial for genom-wide screening og drug discovery programmer.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Medical Research Council og Marie-Curie International Reintegration Grant ordningen (til JKV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cDNA library | Origene | ||
| LB+amp | |||
| Gas-permeable seals | ThermoScientific | AB-0718 | |
| Nucleospin 96 Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740625.4 | |
| Transfectin | BioRad | 170-3351 | |
| H–chst33342 | Molecular Probes | H3570 | |
| Viewplate 96 F TC | PerkinElmer | 6005182 | |
| RapidPick | Hudson | Norgren CP7200 | |
| Freedom Evo | Tecan | With vacuum manifold | |
| Multidrop 384 | Thermo | ||
| Opera LX | PerkinElmer |
References
- Sastry, L., Cao, T., King, C. R. Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells. Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).
- Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling. Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).
- Bisson, N. Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor. Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).
- Ketteler, R. The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays. J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).
- Yamazaki, T. Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization. J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).
- Antczak, A. Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators. in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).
- Su, J., Batzer, A., Sap, J. Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2. J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).
- Hertog, J. den, Tracy, S., Hunter, T. Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo. Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).
- Miki, H. Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain. J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).
- Seedorf, K. Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2. J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).
- Carpenter, A. E. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Seed, B. Developments in expression cloning. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).
