Summary
Высоким содержанием метод скрининга для выявления новых сигнализации компетентные трансмембранных рецепторов описаны. Этот метод поддается крупномасштабной автоматизации и позволяет предсказания о
Abstract
Передачи сигнала от рецепторов факторов роста имеет важное значение для клеток для поддержания пролиферации и дифференцировке и требует жесткого контроля. Передачи сигнала инициируется связыванием внешних лигандов к рецептору трансмембранного и активации сигнальных каскадов вниз по течению. Ключевым регулятором митогенных сигнализация Grb2, модульные белок, состоящий из внутреннего SH2 (Src гомологии 2) область в окружении двух SH3-доменов, что не хватает ферментативной активности. Grb2 конститутивно связанные с GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) через его N-концевой домен SH3. SH2 области Grb2 связывается с рецепторами фактора роста в фосфорилированные остатки тирозина позволяет сочетать активации рецепторов к SOS-Ras-MAP киназы каскада сигнализации. Кроме того, другие роли Grb2 в качестве положительного или отрицательного регулятора сигнализации и эндоцитоза были описаны. Модульный состав Grb2 предполагает, что это могут располагаться в различных рецепторов и transducэлектронной сигналов по множеству различных путей 1-3.
Описанная здесь простая анализа микроскопии, которая контролирует набор Grb2 к плазматической мембране. Это взято из анализа, который измеряет изменения в субклеточном локализации зеленого флуоресцентного белка (GFP)-отмеченном Grb2 в ответ на стимул 4-6. Плазменные мембранные рецепторы, которые связываются Grb2 такие как активированный рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) рекрут GFP-Grb2 в плазматическую мембрану на кДНК выражение, а затем переехать в эндосомного отсеки в клетку. В целях выявления в естественных белковых комплексов из Grb2, этот метод может быть использован для выполнения генома высоким содержанием экрана в зависимости от изменений Grb2 субклеточном локализации. Подготовка клонов кДНК выражения, трансфекции и захвата изображений подробно описаны ниже. По сравнению с другими геномных методов, используемых для идентификации белковых взаимодействий партнеров, таких как дрожжи-два-гипБрод, этот метод позволяет визуализации белковых комплексов в клетках млекопитающих на субклеточном сайт взаимодействия с помощью простого микроскопа на основе анализа. Следовательно, оба качественные характеристики, такие как шаблоны локализации могут быть оценены, а также количественные силу взаимодействия.
Protocol
1. Выбор кДНК клонов выражений
- КДНК-библиотеки предоставляется в качестве одного бактериальных клонов в глицерин запасы в 96-луночный формат. Использование Rearray команду в меню выбора Norgen CP7200, выберите бактериальных клонов от пластины источника и прививать в 1,5 LB мл / усилителя в 96-Deepwell (1 мл хорошо) пластины.
- Печать Deepwell пластин с газопроницаемых уплотнения и инкубировать в течение ночи при 37 ° C в шейкере.
2. Получение кДНК библиотеки выражений
- Побочные Deepwell пластин, содержащих бактерии при 2000 оборотов в минуту в течение 20 мин с использованием пластин адаптеров в центрифуге столешницы.
- Аспирируйте средств массовой информации из скважин, оставляя осадок бактериальных нетронутыми.
- Настройка палубе станции автоматизации лаборатории, как показано на рисунке 2. Решения для плазмидной распределены по желобам 1-5 и пластины Deepwell находится на палубе. Корыто многоямного с элюирования решениянаходится рядом с пластиной Deepwell. Советы загружаются в наконечник стойки.
- Сборка вакуумного коллектора. Плазмиды обязательного пластина помещается внутри коллектора и плазмиды фильтр пластина помещается в верхней части коллектора.
- Ресуспендируют окатышей с 250 мкл раствора 1 (Ресуспендирование буфера) с помощью пипетки вверх и вниз.
- Lyse бактерий путем добавления 250 мкл Решение 2 (лизис буфера). Пластина запечатаны и инвертируется для обеспечения полного смешивания.
- Начало 2 мин таймер.
- Добавить 350 мкл Раствор 3 (для нейтрализации буфера). Печать плиты и инвертировать в 3 раза.
- Передача бактериальных лизатов в плазмиду фильтрующих пластин.
- Применение вакуума в течение 5 мин.
- Снимите фильтр пластины и поместить обязательного пластину на верхней части коллектора. Применение вакуума в течение 1 мин.
- Добавить 500 мкл дополнительной стирки (AW) буфера.
- Применение вакуума в течение 2 мин.
- Добавить 900 мкл промывочного буферного раствора 4. Применение вакуума в течение 2 мин.
- Повторите сТЭП 2,14. Применение вакуума в течение дополнительных 15 мин.
- Поместите ДНК коллекции пластины внутри коллектора. Добавить 100 мкл буфера элюирования с обязательным пластины и инкубировать в течение 2 мин.
- Вакуумные течение 10 мин.
- Удалите пластину сбору и концентрации мера ДНК с использованием NanoDrop 8000. Обычно выход ~ 100 нг / мкл можно ожидать с этим методом.
3. Сотовые Сеялки
- HEK293 клетки трипсином и подсчитывали.
- 2 х 10 4 клеток разливают в каждую лунку Viewplate PerkinElmer помощью ThermoFisher 96-и многоточечных.
- Клетки инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° C и 5% CO 2.
4. Трансфекция
- Подготовьте смесь 100 нг GFP-Grb2 плазмидной ДНК с 100 нг кДНК в 25 мкл бессывороточной среды на лунку в круглым дном 96-луночный планшет.
- Добавить 25 мкл сыворотки среде, содержащей 0,5 мкл Transfectin на лунку.
- Перемешать и начать таймер лR 30 мин.
- Передача 50 мкл кДНК / Transfectin смеси для клеток, используя щадящий метод дозирования. Кроме того, трансфекции смесь можно обойтись сначала в пластинах, а затем клетки добавил сверху (обратная трансфекции).
- Инкубировать клетки в течение ночи при 37 ° C и 5% CO 2.
5. Image Acquisition
- Начало Opera Software. Снимок экрана эксперимента установки показана на рисунке 3. Выберите «Настройки» и выберите вкладку 20x объективного и правильного типа пластины. Убедитесь, «воротник» установлен в правильное значение на цель, чтобы обеспечить фокусировку с различными типами пластин.
- Выберите "Микроскоп" на вкладке. Определение экспозиции 1, FITC (488 лазер) и экспозиции 2, УФ (365 лазер). Активировать УФ-фильтр с обеих экспозиций и назначить экспозиции от 1 до камеры 1 и 2 к экспозиции камеры 2. Установка времени экспозиции до 800 мс для экспозиции 1 и 40 мс для экспозиции 2.
- Выберите "Микроскоп" на вкладке. Определить электроннойXposure 1, FITC (488 лазер) и экспозиции 2, УФ (365 лазер). Активировать УФ-фильтр с обеих экспозиций и назначить экспозиции от 1 до камеры 1 и 2 к экспозиции камеры 2. Установка времени экспозиции до 800 мс для экспозиции 1 и 40 мс для экспозиции 2.
- Выберите экспозиции 1. Установить фокус высотой до 0 мкм. Выберите "Фокус". Как только внимание, подвергать камеру 1. Настройте фокус высоты для оптимизации воздействия плоскость и нажмите на кнопку "Take высоте". Изменение времени экспозиции и мощности лазера для получения максимальной интенсивности пикселя ~ 3000. Сохранить параметры экспозиции. Повторите эти действия для экспозиции 2.
- Выберите "Эксперимент Определение" на вкладке. Создание макета и sublayout. Перетащите и отпустите соответствующую макета, экспозиции, эталонное изображение, файл skewcrop и sublayout. Сохранить эксперимент.
- Выберите "Автоматический эксперимент" на вкладке и получать изображения.
6. Анализ изображений (по версии ImageJ 1.46h).
- Преобразование собственности PerkinElmer. Flex файлы меткой формат изображения. TIF файл с помощьюFlex2Volocity Acapella сценарий.
- Импорт фотографий в ImageJ в виде последовательности изображений, в результате чего в стеке.
- Преобразование стека в 2-канальном HyperStack, выбрав Image / HyperStack / Стек для пункта меню HyperStack. Количество срезов должны быть установлены на половину импортных стека.
- Дублируйте GFP канала с помощью Image / повторяющиеся команды: отметьте флажок Повторяется HyperStack и указать каналы: 1-1. Далее использовать дублируется стека.
- Выберите процесса / Повышение контрастности с 0,01% насыщенных пикселей, используя стек гистограммы и конвертировать в 8 бит с Image/Type/8-bit.
- Определить в 15 пикселя радиуса местных адаптивной сегментации с использованием алгоритма Бернсен с контрастным порога (параметр 1) Q = 30. Отметьте Белые предметы на черном фоне флажок в Image / Adjust / Auto местного меню Threshold.
- Сегментация контроля качества: создание сегментированных наложение контуров объектов на исходной фотографии.
- Featuповторного извлечения путем анализа частиц: измерительный области, средняя и общая интенсивность каждой органеллы. Сохранить результат файлов.
- Откройте файл особенностей результата в R и генерировать гистограммы.
7. Представитель Результаты
При нормальных условиях Grb2 локализован по всей клетке. При стимуляции рецепторов фактора роста, перемещает к плазматической мембране и впоследствии усвоены в эндосомы, как показано на рисунке 4. Выражение рецепторов на поверхности клеток, способных связывать Grb2 достаточно, чтобы вызвать эту транслокации. В типичном эксперименте скрининга, никаких изменений в GFP-Grb2 локализации не наблюдается. Однако, когда белок высказано мнение, что новобранцы Grb2 на субклеточном сайте, есть изменения в локализации, которые могут быть легко визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии. Например, выражение EGFR приводит к перелокализация GFP-Grb2 в ядрышко-подобных структур (рис.4). Таким образом, при применении генома библиотеке, можно ожидать, что роман Grb2-связывающих белков клеточной поверхности, могут быть идентифицированы.
Этот метод не только для обнаружения белков клеточной поверхности. Например, Dynamin2 вызывает изменения в суб-клеточной локализации GFP-Grb2 отображения ядрышко типа набора (рис. 5). Dynamin2 связывается с С-концевыми SH3 домен Grb2 и участвует в эндоцитоза этой сложной 9,10. Таким образом, этот подход позволяет выявить общие связывания с белками комплексы и не ограничивается выявление взаимодействия партнеров для SH2 домена.
Несколько различных типов транслокации можно ожидать таких как локализация на мембране плазмы, эндосомы, другие цитоплазматические структуры везикулярного или ядра. Таким образом, рекомендуется, чтобы все изображения также проверять на глаз. Однако, когда скрининга больших наборов кДНК автоматизированныхАлгоритм анализа изображений является более практичным. В этом случае сочетание алгоритмов желательно, такие, как место обнаружения для определения эндосомы, цитоплазма / ядро обнаружения для определения ядерной челночные и общие морфологические алгоритмы для выявления клеточных изменений формы. Использование этих различных фенотипические методы обнаружения была обсуждена более подробно в другом месте 11.
Рисунок 1. Общая схема эксперимента. Эксперимент подробности полную высоким содержанием скрининга рабочий процесс, начиная с усиления и подготовки библиотеки кДНК, трансфекции кДНК векторы плюс репортер конструкций, получения изображений и анализа изображений с помощью бесплатного программного обеспечения с открытым ImageJ.
ФаРисунок 2. Конфигурация палубе Tecan. (1) На левой стороне, пять 100 мл желоба должны быть заполнены с буферами 1 (40 мл), 2 (40 мл), 3 (50 мл), AW (60 мл) и А4 (100 мл). Желоб A4 нужно будет повторно заполнить один раз во время процедуры. (2) вакуумного коллектора расположен на позиции 14 в этом примере. (3) пластина Deepwell с бактериальными гранул расположен на позиции 30, рядом с корыто буфера элюирования с 25-буфера элюирования мл. (4) Одноразовые наконечники для 8-канального головы должны быть загружены в наконечник стойки на левой стороне и советы для многоканальных головы должны быть заполнены на позицию 40. Жидкость Tecan FreedomEvo обработчик, который используется в данном эксперименте оснащен 500 мкл шприца. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок3. Автоматизация получения изображения на опере LX. A) Выберите вкладку Конфигурация (1). Включите лазерный линий, необходимых для эксперимента (2). Выберите камеры для получения изображений (3). Выберите тип пластины и объектив для эксперимента (4). B) Выберите вкладку микроскоп (1). Определите источник света и времени экспозиции для экспозиции 1 (2,3). Сосредоточьтесь на одной скважины и взять высоту (4). C) Выберите вкладку Эксперимент Определение (1). Перетащите экспозиции, skewcrop, ссылки, макет и sublayout файлы (2). Перетащите и отпустите эксперимент файл (3). D) Выберите Автоматическая эксперимент (1). Перетащите эксперимент файла (2). Выделите соответствующий штрих-код (3). Начало захвата изображения, нажав на кнопку пуска (4). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 5. Пример кДНК, вызванных перемещением GFP-Grb2. GTPase Dynamin2, которая участвует в Grb2-опосредованного эндоцитоза, перемещает GFP-Grb2 в ядрышко-подобных структур (в кружке). В этом эксперименте GFP-Grb2 был котрансфицируют с DNM2 в HEK293T клеток. Клетки окрашивали Hoechst 33342 после 24 часов и изображения были приобретены на OpeРА LX. Один в поле зрения зеленого (GFP) канала и УФ (синий; Hoechst 33342) отображаются.
Discussion
Выражение клонирования является мощным инструментом, который был использован в прошлом для выявления новых клеточных компонентов, таких как вирусные рецепторы и клетки крови антигенов 12. Здесь мы опишем метод, способствующие установлению новых предполагаемой передачи сигнала рецепторов, которые связываются с Grb2.
Есть несколько важных шагов в протоколе.
- Для автоматизированного плазмидной это абсолютно необходимо иметь полную ресуспендирования бактериальных гранул. Иногда бывает необходимо включить строгий встряхивания шаг или дальнейшее смешивание с пипетки.
- После добавления раствора 2 и 3, полное перемешивание является необходимым и мы обнаружили, что вручную обращения запечатанном пластина является более эффективным, чем использование автоматизированных шейкере. Пипетирование следует избегать этот шаг как это приведет к сдвигу ДНК.
- Во всех вакуумных шаги, нужно убедиться, что жидкость полностью слитаот пластины. В противном случае низких урожаев следует ожидать.
- После элюирования, это довольно часто, что элюата падает форму в нижней части плазмидой обязательные пластины. Эти капли должны быть собраны в элюирования пластины, поэтому его рекомендуется плазмиды обязательного пластина поднимается тщательно и любые остаточные капли на дне тщательно переданы элюата пластины.
- Во время трансфекции, время сложное образование имеет решающее значение. Мы обычно придерживаются 20-30 мин. Более раза до 1 часа прекрасно без снижения урожайности, в то время как более короткое время не рекомендуется.
- Для микроскопии, выбор увеличении важно. О системе Опера LX, используемые здесь, разрешение на 20x является достаточным для получения изображений высокого качества. Если выше разрешение изображения не требуется, цель может быть изменен, но для того, чтобы получить статистически значимые количества клеток, большее число полей и более длительное время приобретения не требуется. В общем, мы стремимсяполучить по крайней мере 100 клеток отображаемого на лунку.
Анализ Grb2 транслокация была использована другими группами для определения низкомолекулярных ингибиторов EGFR-киназы из активации 6. В этом случае, EGFR специально активированных лигандом вызывает набор Grb2 к плазматической мембране. Нарушение этого взаимодействия могут быть исследованы с помощью небольшого соединения молекул. Кроме того, он может быть предусмотрено, что миРНК экраны могут быть использованы для выявления эндогенных генов, участвующих в EGFR-Grb2 сигнализации или других Grb2-связывающих рецепторов факторов роста, таких как C-KIT или рецепторов эритропоэтина. Таким образом, существует несколько возможных применений для этой техники. Аналогичный подход может быть применен к GFP с метками систем репортер для других молекул, таких как адаптер Shc, Gab или IRS.
Одним из основных преимуществ использования этой ячейки на основе анализа в клетках млекопитающих является то, что она позволяет выявить физиологически отнЕВАНТ взаимодействия. Анализа является отсчета для формирования белкового комплекса, но что еще более важно, соответствующих взаимодействий контролируются при правильном субклеточном сайта. В связи с этим, эта техника преодолевает артефактов из других белок-белковых взаимодействий методы, такие как дрожжи-два-гибридные или в пробирке анализы. Следует отметить, однако, что косвенное взаимодействие может также привести к набору Grb2. Кроме того, до транскрипционной регуляции связывающих партнеров может быть вызвано кДНК выражение. Чтобы различать эти возможности, необходимо выполнить соответствующие вторичные анализы проводить различие между прямым и косвенным обязательным эффектов.
В заключение GFP-адаптер молекулы транслокации анализа обещает высокий потенциал для генома скрининга и приложения лекарственных препаратов.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Совет по медицинским исследованиям и Марии Кюри Международный реинтеграции Грант схеме (в JKV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cDNA library | Origene | ||
| LB+amp | |||
| Gas-permeable seals | ThermoScientific | AB-0718 | |
| Nucleospin 96 Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740625.4 | |
| Transfectin | BioRad | 170-3351 | |
| H–chst33342 | Molecular Probes | H3570 | |
| Viewplate 96 F TC | PerkinElmer | 6005182 | |
| RapidPick | Hudson | Norgren CP7200 | |
| Freedom Evo | Tecan | With vacuum manifold | |
| Multidrop 384 | Thermo | ||
| Opera LX | PerkinElmer |
References
- Sastry, L., Cao, T., King, C. R. Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells. Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).
- Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling. Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).
- Bisson, N. Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor. Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).
- Ketteler, R. The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays. J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).
- Yamazaki, T. Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization. J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).
- Antczak, A. Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators. in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).
- Su, J., Batzer, A., Sap, J. Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2. J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).
- Hertog, J. den, Tracy, S., Hunter, T. Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo. Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).
- Miki, H. Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain. J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).
- Seedorf, K. Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2. J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).
- Carpenter, A. E. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Seed, B. Developments in expression cloning. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).
