Summary
En hög-halt screeningsmetod för identifiering av nya signalering kompetenta transmembranreceptorer beskrivs. Denna metod är mottaglig för storskalig automatisering och medger förutsägelser om
Abstract
Signaltransduktion genom tillväxtfaktorreceptorer är viktigt för celler att bibehålla proliferation och differentiering och kräver strikt kontroll. Signaltransduktion initieras genom bindning av en extern ligand till en transmembran receptor och aktivering av nedströms signalerande kaskader. En viktig regulator av mitogen signalering är Grb2, en modulär protein bestående av en inre SH2 (SRC homologi 2) domän flankerad av två SH3 domäner som saknar enzymatisk aktivitet. Grb2 är konstitutivt associerat med GTPas Son-of-Sevenless (SOS) via dess N-terminala SH3-domän. SH2-domänen av Grb2 binder till receptorer tillväxtfaktorreceptorer vid fosforylerade tyrosinrester sålunda koppling receptoraktivering till SOS-Ras-MAP-kinas signalkaskad. Dessutom har andra roller för Grb2 som en positiv eller negativ regulator av signalering och receptor endocytos beskrivits. Den modulära sammansättningen av Grb2 antyder att det kan docka till en mängd olika receptorer och transduce signalerar längs en mängd olika vägar 1-3.
Beskrivs här är en enkel mikroskopi-analys som övervakar rekrytering av Grb2 till plasmamembranet. Det är anpassad från en analys som mäter förändringar i sub-cellulär lokalisering av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta Grb2 som svar på ett stimulus 4-6. Plasma membranreceptorer som binder Grb2 som aktiverad epidermal tillväxtfaktor (EGFR) rekrytera GFP-Grb2 till plasmamembranet på cDNA uttryck och därefter flytta till endosomala fack i cellen. För att identifiera in vivo protein komplex av Grb2 kan denna teknik användas för att utföra en genomet hela höghaltsscreening utifrån förändringar i Grb2 subcellulär lokalisering. Framställningen av cDNA-expressionskloner, transfektion och bildförvärv beskrivs i detalj nedan. Jämfört med andra genomiska metoder används för att identifiera partner proteininteraktioner, såsom jäst-två-hybrid, tillåter denna teknik visualisering av proteinkomplex i däggdjursceller på en sub-cellulära stället av interaktion med ett enkelt mikroskopi-baserad analys. Därför både kvalitativa egenskaper, såsom mönster för lokalisering kan bedömas, liksom den kvantitativa styrkan av interaktionen.
Protocol
1. Plockning cDNA expressionskloner
- CDNA-biblioteket tillhandahålls som enskilda bakteriekloner i glycerolstamlösningar i en 96-brunnsformat. Använda Rearray kommandot plockaren menyn i Norgen CP7200, plocka bakteriella kloner från källan plattan och inokulera i 1,5 ml LB / amp i en 96-Deepwell (1 ml brunn) platta.
- Försegla Deepwell plattorna med ett gaspermeabelt tätning och inkubera över natten vid 37 ° C i en skakanordning.
2. Framställning av cDNA-expressionsbibliotek
- Snurra Deepwell plattor innehållande bakterierna vid 2.000 rpm under 20 minuter med användning av platta adaptrar i en bordscentrifug.
- Aspirera media från brunnarna, lämnar bakteriella pelleten intakt.
- Konfigurera däck Lab Automation arbetsstationen som visas i figur 2. Lösningar för plasmidberedning fördelas i tråg 1-5 och Deepwell plattan är placerad på däck. En multibrunnsplatta tråg med elueringslösningplaceras intill Deepwell plattan. Tips laddas in i spetsen rack.
- Montera vakuumgrenröret. Plasmiden bindande plattan placeras inuti grenröret och plasmiden filterplattan placeras ovanpå fördelaren.
- Resuspendera pellets med 250 pl lösning 1 (Resuspension buffert) genom pipettering upp och ned.
- Lysera bakterierna genom tillsats av 250 | il lösning 2 (lyseringsbuffert). Plattan förseglas och inverteras för att medge fullständig omblandning.
- Start 2 min timer.
- Tillsätt 350 | il lösning 3 (neutralisering buffert). Täta plattan och vänd 3 gånger.
- Överför bakterielysat till plasmiden filterplattorna.
- Anbringa vakuum under 5 min.
- Avlägsna filterplattan och placera den bindande plattan ovanpå fördelaren. Anbringa vakuum under 1 min.
- Lägg 500 pl ytterligare tvätt (AW) buffert.
- Anbringa vakuum under 2 min.
- Lägg 900 ul tvättbuffertlösning 4. Anbringa vakuum under 2 min.
- Upprepa sTEP 2,14. Anbringa vakuum under ytterligare 15 minuter.
- Placera plattan DNA samling inne i grenröret. Tillsätt 100 pl elueringsbuffert till den bindande plattan och inkubera i 2 min.
- Vakuum under 10 minuter.
- Avlägsna uppsamlingsplatta och mäta DNA-koncentrationen med användning av NanoDrop 8000. Typiskt ett utbyte av ~ 100 ng / | il kan förväntas med denna metod.
3. Cellsådd
- HEK293-celler trypsineras och räknas.
- 2 x 10 4 celler dispenseras i varje brunn i en PerkinElmer Viewplate med ThermoFisher 96-brunnars multidropp.
- Cellerna inkuberas över natten vid 37 ° C och 5% COj 2.
4. Transfektion
- Förbered en blandning av 100 ng GFP-Grb2 plasmid-DNA med 100 ng cDNA i 25 pl serumfritt medium per brunn i en rundbottnad 96-brunnsplatta.
- Lägg 25 il serumfritt medium innehållande 0,5 | il Transfectin per brunn.
- Blanda och starta timern FOr 30 minuter.
- Överför 50 ^ cDNA / Transfectin blandning till celler med hjälp av en mild dosering metod. Alternativt kan transfektion blandningen dispenseras först till plattor och sedan celler tillsattes på toppen (omvänd transfektion).
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C och 5% COj 2.
5. Bild Förvärv
- Starta Opera Software. En skärm ögonblicksbild av experimentet visas i Figur 3. Välj "Konfiguration"-fliken och välj 20x objektiv och korrekt plattan typ. Säkerställa "krage" är inställt på rätt värde på målet att möjliggöra fokusering med olika platta typer.
- Välj "mikroskop"-fliken. Definiera exponering 1 som FITC (488 laser) och exponering 2 som UV (365 laser). Aktivera UV-filter på både exponering och tilldela exponering 1 till kameran 1 och exponering 2 till kamera 2. Ställ exponeringstider till 800 msek för exponering 1 och 40 ms för exponering 2.
- Välj "mikroskop"-fliken. Definiera exposure 1 som FITC (488 laser) och exponering 2 som UV (365 laser). Aktivera UV-filter på både exponering och tilldela exponering 1 till kameran 1 och exponering 2 till kamera 2. Ställ exponeringstider till 800 msek för exponering 1 och 40 ms för exponering 2.
- Välj exponering 1. Ställ fokus höjd till 0 um. Välj "Fokus". När fokuserad, exponera kameran 1. Justera fokus höjd för att optimera exponeringen planet och klicka på "Take höjd". Ändra exponeringstider och laser makt att ge en maximal pixel intensitet ~ 3.000. Spara exponeringsparametrar. Upprepa för exponering 2.
- Välj "Experiment Definition"-fliken. Skapa layout och sublayout. Dra och släpp den relevanta layout, exponering, referens bild, skewcrop fil och sublayout. Spara experimentet.
- Välj "Automatisk Experiment"-fliken och hämta bilder.
6. Bildanalys (Baserat på ImageJ 1.46h version.)
- Konvertera egna PerkinElmer. Flex-filer till Tagged Image Format. Tif-fil med hjälp avFlex2Volocity Acapella skript.
- Importera bilder i ImageJ som en bildsekvens, vilket resulterar i en stapel.
- Konvertera bunten i en 2 kanals hyperstack genom att välja Bild / Hyperstack / Stapla till Hyperstack menyn. Antalet skivor bör sättas till hälften av den importerade stapeln.
- Duplicera GFP kanal med bild / Duplicera kommando: kryssa i Duplicera hyperstack kryssrutan och ange kanaler: 1-1. Härefter använda den duplicerade stapeln.
- Välj Process / Förbättra kontrast med 0,01% mättade pixlar, med stack histogram och konvertera till 8 bitar med Image/Type/8-bit.
- Definiera en 15 pixel radie lokala adaptiva segmentering med hjälp av Bernsen algoritmen med kontrast tröskel (parameter 1) q = 30. Kryssa de vita objekt på svart bakgrund kryssrutan i Bild / Adjust / Auto Lokal Threshold menyn.
- Segmentering kvalitetskontroll: skapa segmenterad overlay objekt kontur på de ursprungliga bilderna.
- Feature extraktion genom att analysera partiklar: mätområdet, medelvärde och totala intensiteten för varje organell. Spara resultatet filer.
- Öppna funktioner resultatet filen i R och skapa ett histogram.
7. Representativa resultat
Under normala förhållanden Grb2 är lokaliserad hela cellen. Vid stimulering av en tillväxtfaktor-receptor den translokerar till plasmamembranet och därefter internaliseras i endosomer som visas i figur 4. Expressionen av en cellytreceptor kan binda Grb2 är tillräcklig för att inducera denna translokation. I ett typiskt screening experiment har inga förändringar i GFP-Grb2 lokalisering observerats. Emellertid, när ett protein uttrycks som rekryterar Grb2 till en sub-cellulär plats, finns det en förändring i lokalisering som lätt kan visualiseras genom fluorescensmikroskopi. Till exempel uttrycket av EGFR leder relocalization av GFP-Grb2 till endosome-liknande strukturer (Figur4). Så när tillämpning av en genomet hela bibliotek, kan man förvänta sig att nya Grb2-bindande cellyteproteiner kan identifieras.
Denna metod är inte begränsad till detektering av cellytproteiner. Till exempel, inducerar Dynamin2 en förändring i sub-cellulär lokalisering av GFP-Grb2 visar endosomen-liknande rekrytering (figur 5). Dynamin2 binder till den C-terminala SH3-domänen av Grb2 och är involverad i endocytos av denna komplexa 9,10. Således möjliggör detta tillvägagångssätt att identifiera generella proteinbindande komplex och är inte begränsad till identifiering av interaktion partner för SH2-domänen.
Flera olika typer av translokation kan förväntas såsom lokalisering till plasmamembranet, till endosomer, andra cytoplasmiska vesikulära strukturer eller till kärnan. Därför rekommenderas det att alla bilder också kontrolleras med ögat. Men när screening av stora uppsättningar av cDNA en automatiseradbildanalys algoritmen är mer praktiskt. I detta fall är en kombination av algoritmer önskvärd, såsom spot detektering att identifiera endosomer, cytoplasman / kärna upptäckt att identifiera nukleära shuttling och allmänna morfologiska algoritmer för att identifiera cellulära formförändringar. Användningen av dessa olika fenotypiska detektionsmetoder har diskuterats mer i detalj på annat ställe 11.
Figur 1. Systematik av experimentet. Experimentet detaljer en komplett hög halt screening arbetsflödet börjar med förstärkning och beredning av cDNA-bibliotek, transfektion av cDNA vektorer plus konstruktioner reporter, bildtagning och bildanalys med hjälp av gratis öppen programvara ImageJ.
Figure 2. Konfiguration av Tecan Deck. (1) På vänster sida, fem 100 ml rännor behöver fyllas med buffertar 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) och A4 (100 ml). Trough A4 måste återfyllas en gång under förfarandet. (2) Den vakuumgrenrör ligger på position 14 i detta exempel. (3) Den Deepwell plattan med bakteriella pellets ligger på position 30, intill elueringsbufferten tråget med 25 ml elueringsbuffert. (4) Disponibel tips för 8-kanals huvud måste lastas i spetsen rack på vänster sida och tips för flerkanaliga huvudet måste fyllas på position 40. Den Tecan FreedomEvo flytande hanterare som används i detta experiment är utrustad med 500 ul sprutor. Klicka här för att se större bild .
Figur3. Automatisering av bild förvärv på Operan LX. A) Välj fliken Konfiguration (1). Aktivera lasern linjer erfordrade för experimentet (2). Välj de kameror för bildtagning (3). Välj plattyp och objektivlins för experimentet (4). B) Välj mikroskop fliken (1). Definiera ljuskällan och exponeringstid för exponering 1 (2,3). Fokus på en bra och ta höjd (4). C) Välj fliken Experiment Definition (1). Dra och släpp exponering, skewcrop, referens, layout och filer sublayout (2). Dra och släpp experimentet filen (3). D) Välj Automatisk Experiment (1). Dra och släpp experiment fil (2). Fördela lämplig streckkod (3). Starta bild förvärv genom att klicka på startknappen (4). Klicka här för att se större bild .
Figur 5. Exempel av cDNA-inducerad translokering av GFP-Grb2. Den GTPas Dynamin2, som är involverat i Grb2 endocytos, flyttar GFP-Grb2 till endosome-liknande strukturer (inringad). I detta experiment, var GFP-Grb2 samtransfekterades med DNM2 in HEK293T celler. Celler färgades med Hoechst 33342 efter 24 timmar och bilder förvärvades på Opera LX. En synfält av gröna (GFP) kanal och UV (blå, Hoechst 33342) visas.
Discussion
Expressionskloning är ett kraftfullt verktyg som har använts tidigare för att identifiera nya cellulära komponenter såsom virus receptorer och blod antigener cell 12. Här beskriver vi en metod för att underlätta identifieringen av nya förmodade receptorer signalväg som binder till Grb2.
Det finns några viktiga steg i protokollet.
- För automatiserad plasmidberedning är det absolut nödvändigt att ha fullständig återsuspension av den bakteriella pelleten. Ibland är det nödvändigt att inkludera en rigorös skakning steg eller ytterligare blandning med pipetter.
- Efter tillsats av lösning 2 och 3, fullständig blandning är väsentlig och vi har funnit att manuellt vända den förseglade plattan är mer effektivt än att använda en automatiserad skakapparat. Pipettering bör undvikas i detta steg, eftersom det skulle leda till skjuvning av DNA.
- I alla steg vakuum, måste man se till att vätskan är helt dränerasfrån plattan. Annars låga utbyten är att vänta.
- Vid eluering är det ganska vanligt att eluat sjunker formuläret längst ned på plasmiden bindande plattan. Dessa droppar måste samlas i elueringen plattan, så det rekommenderas att plasmiden bindande plattan lyfts noggrant och eventuella kvarvarande droppar vid botten är överfördes försiktigt till eluatet plattan.
- Under transfektion, är tiden för komplexbildning kritisk. Vi följer vanligtvis 20-30 minuter. Längre tider upp till 1 timme är bra utan minskad avkastning, medan kortare tider rekommenderas inte.
- För mikroskopi, är valet av förstoring viktig. På Operan LX-systemet används här, är upplösning på 20x är tillräcklig för att få högkvalitativa bilder. Om högre upplösning krävs målet kan ändras, men för att få statistiskt signifikanta antal celler, ett större antal områden och högre tider förvärv krävs. I allmänhet vill viatt få minst 100 celler avbildas per brunn.
Grb2 translokation analys har använts av andra grupper för att identifiera små molekylinhibitorer av EGFR kinasaktivering 6. I detta fall, är EGFR aktiveras specifikt med ligand orsakar rekrytering av Grb2 till plasmamembranet. Störning av denna interaktion kan sedan undersökas med användning av små molekyler. Likaså kan man tänka sig att siRNA skärmar kan användas för att identifiera endogena gener involverade i EGFR-Grb2 signalering eller andra Grb2-bindande tillväxtfaktorreceptorer såsom c-KIT eller erytropoietinreceptorn. Således, det finns flera potentiella tillämpningar för denna teknik. En liknande metod skulle kunna tillämpas på GFP-märkta rapporteringssystem för andra adaptormolekyler som Shc, Gab eller IRS.
En stor fördel med att använda denna cell-baserad analys i däggdjursceller är att den möjliggör identifiering av fysiologiskt relvanta interaktioner. Analysen är en avläsning för protein komplexbildning, men ännu viktigare är de relevanta interaktioner övervakas på rätt sub-cellulära plats. I detta avseende, övervinner denna teknik artefakter från andra protein-proteininteraktion metoder såsom jäst-två-hybrid-eller in vitro-analyser. Det bör dock noteras, att indirekta interaktioner även kan resultera i Grb2 rekrytering. På liknande sätt kan den transkriptionella uppreglering av bindningspartners induceras genom cDNA-uttryck. För att särskilja mellan dessa möjligheter, är det nödvändigt att utföra de lämpliga sekundära analyser för att skilja mellan direkta och indirekta effekter bindande.
Sammanfattningsvis lovar GFP-adaptormolekyl translokation analys hög potential för genomet hela screening och tillämpningar i läkemedelsforskningsprocessen.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Medical Research Council och Marie Curie International återintegreringsbidrag system (till JKV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cDNA library | Origene | ||
| LB+amp | |||
| Gas-permeable seals | ThermoScientific | AB-0718 | |
| Nucleospin 96 Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740625.4 | |
| Transfectin | BioRad | 170-3351 | |
| H–chst33342 | Molecular Probes | H3570 | |
| Viewplate 96 F TC | PerkinElmer | 6005182 | |
| RapidPick | Hudson | Norgren CP7200 | |
| Freedom Evo | Tecan | With vacuum manifold | |
| Multidrop 384 | Thermo | ||
| Opera LX | PerkinElmer |
References
- Sastry, L., Cao, T., King, C. R. Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells. Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).
- Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling. Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).
- Bisson, N. Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor. Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).
- Ketteler, R. The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays. J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).
- Yamazaki, T. Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization. J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).
- Antczak, A. Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators. in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).
- Su, J., Batzer, A., Sap, J. Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2. J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).
- Hertog, J. den, Tracy, S., Hunter, T. Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo. Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).
- Miki, H. Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain. J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).
- Seedorf, K. Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2. J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).
- Carpenter, A. E. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Seed, B. Developments in expression cloning. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).
