Summary
Er is een groeiend aantal aanwijzingen, dat ischemische preconditionering (PC) - een niet-schadelijk ischemische uitdaging voor de hersenen - verleent een tijdelijke bescherming aan een volgende schadelijke ischemische schade. Wij opgericht bilaterale gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader (BCCAO) als voorbehandeling stimulans voor vroege ischemische tolerantie (IT) in C57Bl6 / J muizen aanzetten tot voorbijgaande focale cerebrale ischemie (geïnduceerd door midden cerebrale slagader occlusie, MCAO).
Abstract
Er is een groeiend aantal aanwijzingen dat ischemische preconditionering - een niet-schadelijk ischemische uitdaging voor de hersenen - verleent een tijdelijke bescherming aan een volgende schadelijke ischemische schade. We hebben bilaterale arteria carotis communis occlusie opgericht als een voorbehandeling stimulans voor vroege ischemische tolerantie te induceren om voorbijgaande cerebrale ischemie in C57Bl6 / J muizen. In deze video zullen we de gebruikte methodologie voor deze studie tonen.
Introduction
Ischemische beroerte is een ziekte met een hoog sterftecijfer en een enorme socio-economische last 1. Ondanks intensief experimenteel en klinisch wetenschappelijke inspanningen gedurende de afgelopen decennia, opties voor de behandeling acute ischemische beroerte patiënten blijven zeer beperkt 2. In tegenstelling tot dat, zal toenemen van het percentage ouderen in de ontwikkelde landen drastisch te verhogen incidentie en prevalentie van patiënten met een ischemische beroerte in de komende decennia 3. Daarom is er een dringende behoefte aan nieuwe behandelingsstrategieën bij patiënten met een ischemische beroerte.
Een benadering is om verder inzicht in de mechanismen van endogene aanpassing van de hersenen geconfronteerd met een schadelijke stimulus krijgen. Deze hersenen afgeleide neuroprotectie is ook bekend als ischemische voorconditionering (PC) of ischemische tolerantie (IT) en beschrijft een verschijnsel, waarbij een onschadelijke schadelijke prikkel in de hersenen, veroorzaakt een voorbijgaande weerstandtegen een volgende schadelijke ischemisch insult 4. Het komt voor in twee verschillende tijdvensters: begin IT, die optreedt binnen enkele minuten tot enkele uren na PC en vertraagde IT, die een latentie van een paar uur moet plaatsvinden 4.
Tot dusver heeft het onderzoek naar IT in de hersenen gericht op vertraagde IT. Veel minder is bekend over de mechanismen van de vroege IT. Het doel van deze studie is om de bilaterale gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader (BCCAO) dat is een gevestigde stimulans te induceren vertraagde IT, als een adequate PC stimulans te induceren vestigen vroeg IT om voorbijgaande focale cerebrale ischemie (geïnduceerd door midden cerebrale slagader occlusie, MCAO) in C57Bl6 / J muizen.
Tijdens beide chirurgische procedures (BCCAO en MCAO), monitoring van cerebrale doorbloeding (CBF) met laser Doppler flowmetry (LDF) werd uitgevoerd.
BCCAO werd uitgevoerd in verdoofde muizen en spontane ademhaling. Beide gemeenschappelijke halsslagaders (CCA) werden blootgesteldafgedicht en gedurende 60 seconden gevolgd door 5 min reperfusie. Deze BCCAO / reperfusie sequentie werd tweemaal herhaald. Na de operatie, muizen herstelde zich snel en vertoonde geen tekenen van functionele beperking. Om uit te sluiten, dat de BCCAO protocol hierboven beschreven niet resulteren in vertraagde celdood in de hersenen, hebben we een TdT-gemedieerde dUTP-biotine nick end labeling (TUNEL) kleuring 72 uur na BCCAO (of sham operatie) in een aparte groep.
MCAO is een wijd uitgewerkt model voor de inductie van cerebrale ischemie bij knaagdieren 5-7. De chirurgische ingrepen werden uitgevoerd met behulp van gestandaardiseerde operationele procedures (SOP) 8. Na het blootstellen links CCA, werd een siliconen bedekte monofilament geïntroduceerd in de distale CCA, gevorderd via de interne halsslagader (ICA) in de cirkel van Willis totdat de voorste cerebrale slagader (ACA) en daarmee, de oorsprong van de middelste cerebrale slagader ( MCA) werd afgesloten voor een bepaalde periode. In deze studie hebben wegebruik 45 min MCAO, die typisch resulteert in een ischemische laesie op het MCA gebied met striatale en corticale hersengebieden.
In onze studie, analyseerden we de temporele profiel van de vroege IT gebruik BCCAO als de PC stimulus. Onze gegevens blijkt, dat de optimale tijd tussen BCCAO en MCAO vroeg IT is 30 min te induceren.
In deze video zullen we een demonstratie van zowel de chirurgische procedures, dwz BCCAO en MCAO geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in dit artikel beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van het Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlijn, Duitsland.
Pre-chirurgische procedures
1. Bereiding van Monofilamenten
- Voor de bereiding van intraluminale filamenten werden 8-0 nylon monofilament hechtdraden gebruikt en werden tot een lengte van elk 13 mm gesneden.
- Voor bekleding van de monofilamenten werd Xantopren M mucosa, (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Duitsland) gebruikt geactiveerd door toevoeging van een druppel activator-oplossing (Activator Universal plus Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Duitsland).
- Het monofilament werd langzaam getrokken door de silicone tot deze volledig was bedekt met haar. Hierdoor zou de monofilament gelijkmatig bedekt met silicone. Vermijd te lang wachten omdat de geactiveerde bekledingsmateriaal zal stevig en snel droog geworden.
- Voor de silicone begint te stollen, Is het raadzaam om te strippen van bovenmatige siliconen van het filament door meer dan een vel papier te trekken. Door dit te doen, kan de siliconenlaag worden uitgedund om een benaderende dikte van 200 micrometer.
- De basis van de siliconen bedekte monofilament zat vast in boetseerklei om te laten het 's nachts drogen.
Commentaar: Idealiter alleen gesteriliseerd althans ontsmet monofilamenten worden gebruikt om steriliteit van de operatiewond. In de praktijk, sterilisatie of desinfectie van de handgemaakte monofilamenten is erg moeilijk, omdat de kwaliteit van de monofilamenten kunnen verergeren 9. Daarom zou het de voorkeur verdienen om in de handel verkrijgbare steriele monofilamenten te gebruiken.
2. Voorbereiding van chirurgische instrumenten en van de Dieren
- Alle chirurgische instrumenten werden in 70% ethylalcohol gehouden. Bovendien, vóór elke nieuwe chirurgische procedure, alle chirurgische instrumenten werden zorgvuldig schoongemaakt eennd gedesinfecteerd met 70% ethylalcohol.
- De chirurgische gebied werd grondig gedesinfecteerd met 70% ethylalcohol in alle dieren voordat doorsnijding. De gedesinfecteerde locaties mochten volledig drogen voordat u de incisies. Aanvullende knippen van de vacht werd niet uitgevoerd omdat dit kan microabrasions en daaropvolgende huidontsteking 9 veroorzaken.
Chirurgische procedures
3. Positionering van de LDF Probe en LDF Monitoring
- Voor anesthesie, werden muizen blootgesteld aan een gasmengsel bestaande uit 30% zuurstof, 70% N 2 O en 2,5% isofluraan met een verdamper. Voor onderhoud van de anesthesie, werd isofluraan concentratie gereduceerd tot 1.5%. Muizen werden spontaan ademende via ademhalingsmasker gedurende de chirurgische procedure.
- Een rectale temperatuur sonde werd ingebracht en muizen werden vastgesteld aan de stereotactische frame van het blootstellen van de pariëtale hoofd. Tijdens de operatie werden muizen die op eenthermostaat verwarming pad, zorgen voor een constante kerntemperatuur van 37,0 ± 0,5 ° C. Een sagittale middellijn incisie (~ 1 cm lengte) werd uitgevoerd om de pariëtale schedel bloot.
- De linkerkant van de schedel werd zorgvuldig ontleed en een vezeloptische sonde werd direct bevestigd aan de schedel 2 mm caudaal en 5 mm lateraal van bregma met secondenlijm. Daarna werden wondranden zorgvuldig aangepast hersenen hypothermie en infecties te voorkomen.
- De muis werd omgedraaid naar de ventrale zijde van de hals bloot. De vezeloptische sonde werd aangesloten op het apparaat LDF (PeriFLUX System 5000, Perimed, Järfälla, Zweden) via verbinding probe adapter (Master Probe 418-1, Perimed, Järfälla, Zweden).
Commentaar: Tijdens het draaien van de muis, moet de vezeloptische sonde gebogen worden met zorg om te voorkomen dat het breekt af van de schedel.
- De LDF inrichting werd aangesloten op een laptop computer. Continue registratie van LDF waarden werd gestart middels PeriSoft voor Windows (Version 2.50, Järfälla, Zweden). Figuur 1 toont de gemiddelde CBF cursus verkregen tien LDF opnamen tijdens BCCAO en reperfusie.
4. Bilaterale Gemeenschappelijke occlusie van de halsslagader
- Anesthesie werd gehandhaafd, zoals beschreven in 3.1. Muis werd op zijn rug gelegd. Staart en poten van het dier werden vastgesteld aan de verwarming pad met plakband. Een sagittale ventrale middellijn incisie (~ 1 cm lengte) werd uitgevoerd.
- Beide speekselklieren werden zorgvuldig gescheiden en gemobiliseerd om te visualiseren de onderliggende CCA's.
- Beide CCA's werden zorgvuldig gescheiden van de respectievelijke vagale zenuwen en bijbehorende aders zonder nadelige gevolgen voor deze structuren. Manipulaties van de vagale zenuwen kan leiden tot tijdelijke of permanente dysfunctie van het parasympathische zenuwstelsel, die het potentieel voor het optreden van significante cardiale arr heefthythmia of zelfs onomkeerbare hartstilstand. Daarom is het cruciaal om alle manipulaties van de vagale zenuwen te voorkomen. Een losse 5-0 zijden hechtdraad lus werd gemaakt rond elke CCA.
- Een kleine siliconenslang (diameter 2 mm) werd tussen de CCA en zijden hechtdraden aan weerszijden geplaatst. Deze buis werd gebruikt als spalken van de CCA, teneinde beschadiging van de arteriële wanden te vermijden wanneer de hechtingen zijn aangescherpt (figuur 4).
- Beide CCA's werden afgesloten gedurende een minuut door het aandraaien van de zijde hechtingen. Alleen muizen, waarbij de LDF signaal werd verminderd tot <10% van de basislijn signaal werden opgenomen in de studie. Na heropening van beide CCA's, werd een minuten reperfusie periode van vijf geïnitieerd. Door LDF werd een complete reperfusie gezorgd. Dieren met onvolledige reperfusie (dwz <90% terugwinning van CBF vergeleken met de uitgangswaarde CBF) werden uitgesloten. Een opeenvolging van een minuut van BCCAO en vijf minuten van reperfusie werd tweemaal herhaald voor een totaal BCCAO duratiop 3 min. Figuur 1 toont de gemiddelde CBF cursus verkregen tien LDF opnamen tijdens BCCAO en reperfusie. Tijdens de procedure, is het raadzaam om te houden van de nek wond nat met een fysiologische zoutoplossing.
- Na de laatste reperfusie werden alle buizen en hechtdraden en de vezeloptische sonde die aan de schedel verwijderd, de wonden werden gehecht en lidocaïne zalf (Xylocain 2%, AstraZeneca GmbH, Wedel, Duitsland) herhaaldelijk aangebracht op de wonden zoals nodig voor analgetische management.
- Muizen werden overgebracht naar een voorverwarmde (30 ° C) herstel doos (MediHEAT. PecoServives Ltd Brough, Cumbria, UK) tot ze volledig bewustzijn herwonnen had. Daarna werden muizen teruggebracht naar hun kooien voor dieren.
5. Midden cerebrale slagader Occlusie
- Muizen werden opnieuw verdoofd, werd een rectale temperatuur sonde en muizen werden geplaatst op een verwarmingselement aan de ventrale zijde van de hals bloot. Nadien moeten ze were vast zoals beschreven in de sectie BCCAO.
- Een permanente ligatuur met lange 7-0 zijden hechtdraad werd om de linker proximale CCA en de draad werd voorzichtig caudaal getrokken middels een mug klem (figuur 4).
- Andere duurzame ligatuur werd om de linker externe halsslagader (ECA) en de draad werd getrokken naar de rechterzijde van het dier (Figuur 4).
- Bindweefsel rondom de linker ICA werd zorgvuldig gemobiliseerd en de hypoglossuszenuw werd voorzichtig opgetild tot een goed overzicht van de distale loop van ICA krijgen. De linker ICA bochten naar links terwijl de pterygopalatine slagader (PPA) volgt het verloop van de proximale ICA naar rechts (fig. 4).
Commentaar: Er is nog een slagader te identificeren die overgaat naar rechts in caudaal. Dit is de occipitale slagader, die variabel is afkomstig hetzij van de CCA bifurcatie of uit de proximal deel van de Europese Rekenkamer (figuur 4).
- Een losse hechtdraadlus werd gemaakt rond de proximale ICA met een 5-0 zijden draad.
- Met behulp van een kleine microvasculaire klem, werd de ICA tijdelijk distaal afgesloten om de 5-0 losse hechtdraadlus (figuur 4).
- Een kleine incisie gemaakt in het distale deel van CCA CCA net voor de splitsing met microvasculaire schaar (figuur 4).
- Een voorgeselecteerde silicone bedekte monofilament werd in de CCA via de kleine incisie en geduwd in de ICA totdat gestopt bij de microvasculaire klem (figuur 4).
- De microclamp werd voorzichtig van de ICA, terwijl het monofilament werd dieper voortbewogen in de ICA totdat gestopt (figuur 4). Commentaar: Op dit punt, draai de tang in de linkerhand, zodat u niet in het bezit het als een pen. Dit helpt om het filament met de tang gemakkelijker grijpen.De vasculaire klem-applicator moet worden gehouden in de rechterhand. Het kan nodig zijn om bijna draai de losse 5-0 hechtdraad rond de ICA, om bloedingen te voorkomen dat de incisie kant.
- De exacte locatie van het monofilament tip werd geïdentificeerd om te controleren of het was gevorderd in de ICA en niet in de PPA. Als de tip monofilament werd in het proximale PPA werd het filament voorzichtig teruggetrokken net voor de ICA / PPA bifurcatie. Er werd geprobeerd om het monofilament in de ICA weer vooruit, terwijl zachtjes te trekken van de proximale ICA een beetje naar de rechterkant. Door dit te doen, de natuurlijke loop van de distale ICA werd gesimuleerd waardoor het makkelijker wordt om toegang te krijgen tot de ICA.
- Nadat de monofilament werd voortbewogen in de ICA bijna volledig werd de losse 5-0 hechtdraad lus rond het proximale ICA aangescherpt om het filament zijn plaats te houden. Daarna werden alle zijden draden ingekort en de huid wond werd gehecht.
- Het vochtverlies tijdens de operatie werd aanvultished door het injecteren van 1,0 ml fysiologische zoutoplossing ip Daarna werd de muis naar de voorverwarmde recovery box totdat deze weer volledig bewustzijn.
- Voor reperfusie, muizen werden opnieuw verdoofd en het monofilament werd na zorgvuldig losmaken van de 5-0 zijden hechtdraad rond de proximale ICA verwijderd. Daarna werd het 5-0 hechtdraad weer zorgvuldig aangescherpt om bloedingen te voorkomen.
- Na bevestiging van de volledige hemostase, werd de nek wond gehecht.
- Lidocaïne zalf werd herhaaldelijk plaatselijk aangebracht op de huid als nodig voor pijnbestrijding en de muis werd overgebracht naar de voorverwarmde (30 ° C) fouten controleren totdat weer volledig bewustzijn.
- Als een eerste aanwijzing voor een succesvolle MCAO procedure, een klok omcirkelen van de dieren waargenomen. De ernst van de functionele tekort werd gekwantificeerd met behulp van de Bederson score aangepast voor muizen 10. Volgens deze gewijzigde Bederson score, neurologische scores were als volgt beoordeeld: 0 (normale motorische functie), 1 (flexie van de romp en de contralaterale voorpoot toen muis werd opgetild door de staart), 2 (omcirkelen aan de contralaterale zijde wanneer de muis werd gehouden door de staart op een vlakke ondergrond, maar normaal houding in rust), 3 (leunt aan de contralaterale zijde in rust) en 4 (geen spontane motorische activiteit of dood).
6. BCCAO Sham Chirurgie
Voor BCCAO sham procedures, muizen werden verdoofd voor de duur van een echte BCCAO PC procedure werden de speekselvloed klieren gemobiliseerd en de CCA's werden blootgesteld. Het is cruciaal dat de directe manipulaties aan de halsslagaders of vagale zenuwen worden vermeden tijdens schijnvertoning procedure. Manipulaties van de CCA de endotheliale laag beschadigd, wat kan resulteren in het vrijkomen van vasoactieve verbindingen uit endotheel of induceren plaatselijke trombose in het arteriële lumen. Als gevolg daarvan zou kunnen trombo-embolische gebeurtenissen plaatsvinden na veinzerijchirurgie. Dit zou een belangrijke confounder van th wordene procedure. Aan de andere kant kan manipulaties van de vagale zenuwen tot tijdelijke of permanente dysfunctie van het parasympathische zenuwstelsel, dat het potentieel voor het optreden van significante cardiale aritmie of onomkeerbare hartstilstand heeft. Daarom is het cruciaal om alle manipulaties van de vagale zenuwen tijdens BCCAO voorkomen.
Post-operatieve procedures
7. Infarctvolume Metingen
Voor de beoordeling van de infarct grootte, muizen overleefden 72 uur na MCAO. Daarna dieren waren diep verdoofd, hersenen werden verwijderd, snap-bevroren in methylbutan, coupes en gekleurd met hematoxyline (met behulp van protocol Papanicolau's) voor het infarct volume metingen. Brain secties werden verzameld bij 600 urn intervallen en infarct volumes werden bepaald met behulp van een beeldanalysator (MCID kern 7.0 Rev.2.0, GE Healthcare Niagara Inc) en gecorrigeerd voor oedeem volgens de werkwijze van Lin et al.. 7,11
8. Inclusion Criteria
We begrepen alleen dieren die een LDF-gemeten CBF-reductie van meer dan 90% in elk van de drie BCCAO afleveringen gehad. Idealiter LDF monitoring uitgevoerd tijdens beide hersenhelften BCCAO. Voor praktische voerden we LDF bewaking alleen in de linker hemisfeer, die worden onderworpen aan later MCAO. Deze benadering is beschreven 6,12. Reperfusie na elke BCCAO episode was nodig om volledig te zijn (dwz terug naar de uitgangswaarden). Om redenen van vermindering tijdsduur muizen werden onder narcose gehouden, hadden we geen CBF bewaken tijdens MCAO operatie. In een pilot-studie met een aparte groep dieren we echter bewaakt CBF door LDF tijdens MCAO operatie. In deze groep muizen, we consequent gemeten CBF een vermindering met 90% vergeleken met de uitgangswaarde vóór CCA occlusie. Bovendien, na verwijdering van monofilamenten CBF hersteld tot> 90% van de betreffendeuitgangswaarden na CCA occlusie. Deze LDF criteria zijn vastgesteld in de literatuur en resulteren in consistente infarct volumes 7. We begrepen alleen dieren die een Bederson score van ten minste van 1 na herstel van de narcose na MCAO gehad. Bovendien kunnen alleen dieren die na MCAO en die overleefden 72 uur vertoonde geen tekenen van intracraniële bloeding werden opgenomen in de studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze BCCAO protocol resulteerde in een onmiddellijke en diepgaande (> 90%) CBF kortingen wanneer beide CCA's werden afgesloten (figuur 1). Heropening van de CCA's tot reperfusie voltooien wordt bewaakt door LDF (figuur 1). Na PC, dieren vertoonden geen tekenen van functionele invaliditeit. Bovendien was er geen mortaliteit. TUNEL kleuring uitgevoerd 72 uur na BCCAO in een afzonderlijke groep dieren vertoonden geen tekenen van vertraagde celdood in de hersenen na BCCAO (gegevens niet getoond).
Bij het analyseren van het tijdsverloop van de optimale tijd tussen BCCAO en MCAO voor vroege IT (figuur 2), vonden we een significante reductie van de infarct volumes (vermindering met 65%, n = 10), vergeleken met placebo (n = 10) toen BCCAO werd uitgevoerd 30 min vóór MCAO. Bovendien werden infarct volumes verminderd wanneer BCCAO werd toegepast 2 uur en 24 uur voor MCAO (n = 10). 24 uur vertegenwoordigt de tweede (uitgestelde) tijdvenster van IT 6. >
Derhalve kan worden geconcludeerd dat de optimale tijdsvenster voor de vroege IT BCCAO gebruik als PC stimulus 30 minuten vóór inductie van tijdelijke focale cerebrale ischemie (MCAO).
Figuur 1. Loop van gemiddelde CBF waarden gemeten door LDF tijdens BCCAO en reperfusie (n = 10).
Figuur 2. Temporele profiel van infarct volumes op verschillende tijdstippen vertragingen van MCAO na BCCAO n = 10/groep, grafieken geven gemiddelde ± standaarddeviatie, * p <0,05 uit sham, ** p <0,01 ten opzichte van sham (One-way ANOVA met Bonferroni's posthoc test).
3 "src =" / files/ftp_upload/4387/4387fig3.jpg "fo: content-width =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/4387/4387fig3highres.jpg "/>
Figuur 3. Vertegenwoordiger hematoxyline-gekleurde hersensecties afgeleid van een BCCAO-gepreconditioneerde (A) en een schijn-geopereerde dieren (B), die werden onderworpen aan 45 min MCAO 30 min na BCCAO / schijnvertoning. Hersenen werden verwijderd en verwerkt 72 uur na MCAO.
Figuur 4. Regeling van vasculaire anatomie van de linker halsslagader's waaronder de procedures uitgevoerd voor BCCAO en MCAO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In onze studie hebben we aangetoond dat drie reeksen BCCAO van telkens een minuut, gevolgd door reperfusie gedurende vijf minuten, een toereikend ischemische PC stimulus vroeg IT induceren.
Verder hebben we aangetoond dat de voorbehandeling protocol is een veilige en kleine invasieve procedure zonder noemenswaardige postoperatieve morbiditeit, geen tekenen van apoptose in hersenen en geen mortaliteit. Verschillende voorconditionering protocollen zijn eerder beschreven 6-7,12. Anderen hebben gebruikt 6 min van BCCAO als voorbehandeling stimulans 13-14. Vanwege het feit dat een minuut BCCAO drie keer tot een beschermend effect bij het begin tijdsinterval van IT zonder meetbare ischemische hersenschade, besloten we dit protocol.
Om consistente resultaten, duur van anesthesie en chirurgische procedures alsmede andere variabelen zoals diergewichten, hersentemperaturentijdens de operatie, moet postsurgical vocht aanvullen, postoperatieve pijnbestrijding alsmede pre-en postoperatieve kooi verrijking worden gestandaardiseerd 15. Bijzondere aandacht vergt het onderhoud van normotherme voorwaarden van de muizen gedurende de volledige periode van de anesthesie omdat onderkoeling zelf heeft een voorbehandeling effect en kan dus interfereren met de BCCAO effect 16. In wakker en vrij bewegende knaagdieren, kern temperaturen tussen ongeveer 0,5 en 1 graden Celsius boven het desbetreffende hersentemperaturen 17. Rusten hersenen temperaturen in wakker en vrij bewegende knaagdieren zijn ongeveer 36,5 graden Celsius 18. Omdat we niet de hersenen temperaturen in onze experimenten te meten, hebben we aangepast muizen 'core temperaturen tot 37,0 ± 0,5 graad Celsius aan hersenen temperaturen waarop de bovengenoemde rust hersenen temperaturen lijken te bereiken.
Theoretisch gebruik van vluchtige anesthetica hetzelf kan een extra confounder zijn, omdat is aangetoond dat isoflurane zelf IT kan induceren. Echter, isofluraan anesthesie wordt een relevante stimulus PC wanneer herhaaldelijk toegediend gedurende enkele uren wat niet het geval in de in de huidige studie was 19-21 beschreven procedures. Verder hebben we ook geanalyseerd Sham-geopereerde dieren te controleren voor de mogelijke verstorende effect van isofluraan anesthesie.
De grootte en vorm van het monofilament voor inductie van MCAO speelt een cruciale rol. Gelijkmatig siliconen bedekt filamenten verbeteren van de slaagkans van MCAO en verminderen de kans op complicaties zoals subarachnoïdale bloedingen en moet daarom de voorkeur in vergelijking met afgestompte filamenten verwarmen 22. Een ander cruciaal punt is het filament lengte. Optimale filamentlengtes tussen 9-11 mm gerapporteerd 15. Vanwege het feit dat onze insnijdingen proximaal van de CCA bifurcatie werden, gebruikten we een monofilament length van 13 mm en een dikte van ongeveer 200 urn.
Samengevat, het type en de kwaliteit van de coating monofilament en de lengte cruciaal voldoende occlusie van de MCA en om aanzienlijke crossflow via anterieure communicerende slagader voorkomen. Aanzienlijke crossflow op de rechterkant van de Cirkel van Willis resulteert in een ongewenste afname van de infarct volume en verhoogt daardoor de variabiliteit van de resultaten 23. Aanvullende procedurele normeringen met de bedoeling een verdere verlaging resultaat variabiliteit omvatten LDF-based CBF bewaking tijdens MCAO en reperfusie en het gebruik van commercieel beschikbare industriële gemaakt gestandaardiseerde monofilamenten. Door het gebruik van commercieel beschikbare monofilamenten ook hun steriliteit kan worden gewaarborgd.
Bovendien hoeft dieren die niet over een> 90% CBF verlaging gedurende BCCAO of MCAO, of die niet een> 90% reperfusie hebben na heropening van de slagaders should van de studie uitgesloten. Dit zal ertoe variabiliteit in infarct volume, dat voornamelijk als gevolg van nature voorkomende varianten in cerebrale collaterale circulatie verder te verminderen.
Samengevat BCCAO is een gevestigde en gemakkelijk toepasbare model om effecten van IT onderzoeken vroege en vertraagde tijdvensters. Bestuderen van het fenomeen van IT helpt om een beter begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan endogene bescherming in de hersenen te krijgen. In perspectief, kan dit helpen om alternatieve behandelingsmogelijkheden voor patiënten met een acute ischemische beroerte te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Light source for microscope | Zeiss | SteREO CL 1500 ECO | |
| Heating pad with rectal probe | FST | 21061-10 | |
| Stereotactic frame | David Kopf | Model 930 | |
| Scissors | FST | 91460-11 | |
| Dumont forceps #5 | FST | 11251-10 | |
| Dumont forceps #7 | FST | 11271-30 | |
| Mircovascular clamp | FST | 00398-02 | |
| Clamp applicator | FST | 00072-14 | |
| Springscissors | FST | 15372-62 | |
| Needle holder | FST | 12010-14 | |
| Needles | Feuerstein, Suprama | BER 562-20 | |
| 5-0 silk suture | Feuerstein, Suprama | ||
| 7-0 silk suture | Feuerstein,Suprama | ||
| 8-0 silk suture | Feuerstein, Suprama |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Khaja, A. M., Grotta, J. C. Established treatments for acute ischaemic stroke. Lancet. 369, 319-330 (2007).
- Foerch, C., Sitzer, M., Steinmetz, H., Neumann-Haefelin, T. Future demographic trends decrease the proportion of ischemic stroke patients receiving thrombolytic therapy: a call to set-up therapeutic studies in the very old. Stroke. 40, 1900-1902 (2009).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat. Rev. Neurosci. 7, 437-448 (2006).
- Atochin, D. N., Clark, J., Demchenko, I. T., Moskowitz, M. A., Huang, P. L. Rapid cerebral ischemic preconditioning in mice deficient in endothelial and neuronal nitric oxide synthases. Stroke. 34, 1299-1303 (2003).
- Cho, S., et al. Obligatory role of inducible nitric oxide synthase in ischemic preconditioning. J. Cereb. Blood. Flow Metab. 25, 493-501 (2005).
- Kunz, A., et al. Neurovascular protection by ischemic tolerance: role of nitric oxide and reactive oxygen species. J. Neurosci. 27, 7083-7093 (2007).
- Dirnagl, U., et al. Standard operating procedures (SOP) in experimental stroke research: SOP for middle cerebral artery occlusion in the mouse. Nature Precedings. , (2010).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J. Vis. Exp. (47), e2423 (2011).
- Bederson, J. B., et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
- Kawano, T., et al. iNOS-derived NO and nox2-derived superoxide confer tolerance to excitotoxic brain injury through peroxynitrite. J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1453-1462 (2007).
- Qi, S., et al. Sublethal cerebral ischemia inhibits caspase-3 activation induced by subsequent prolonged ischemia in the C57Black/Crj6 strain mouse. Neurosci. Lett. 315, 133-136 (2001).
- Wu, C., et al. A forebrain ischemic preconditioning model established in C57Black/Crj6 mice. J. Neurosci. Methods. 107, 101-106 (2001).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for Preclinical Stroke Trials (1st Edition). J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Nishio, S., et al. Hypothermia-induced ischemic tolerance. Ann. N.Y. Acad. Sci. 890, 26-41 (1999).
- DeBow, S., Colbourne, F. Brain temperature measurement and regulation in awake and freely moving rodents. Methods. 30, 167-171 (2003).
- Colbourne, F., Sutherland, G. R., Auer, R. N. An automated system for regulating brain temperature in awake and freely moving rodents. J. Neurosci. Methods. 67, 185-190 (1996).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
- Li, L., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning improves short-term and long-term neurological outcome after focal brain ischemia in adult rats. Neuroscience. 164, 497-506 (2009).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesth. Analg. 96, 233-237 (2003).
- Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J. Neurosci. Methods. 155, 285-290 (2006).
- Zarow, G. J., Karibe, H., States, B. A., Graham, S. H., Weinstein, P. R. Endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in rats: effect of suture insertion distance on cerebral blood flow, infarct distribution and infarct volume. Neurol. Res. 19, 409-416 (1997).
