Summary
هنا، نحن تصف كيفية تحديد المرحلة من الفئران الإنجابية (مقدمات الوداق، شبق، تلية الوداق، أو هجوع الودق) من خلال جمع بسيطة غير الغازية، وتقييم الخلوي لعينات مسحة المهبل. وصفنا علم الخلايا المهبلية كذلك كيف يعكس تعميم مستويات الهرمونات التي تقوم عليها من خلال الانتقال التناسلي للدورة الفئران.
Abstract
وسيلة سريعة لتقييم الوضع الإنجابية في القوارض مفيد ليس فقط في دراسة الخلل الإنجابي ولكن مطلوب أيضا لإنتاج نماذج جديدة من الماوس المرض والتحقيقات في التنظيم الهرموني للتنكس النسيج (أو التجديد) بعد التحدي المرضية. يتم تقسيم الفئران الإنجابية (أو دقي) دورة في 4 مراحل: مقدمات الوداق، شبق، تلية الوداق، وهجوع الودق. تقلبات في تعميم المعرفة مستويات المنشطات المبيض β-17-استراديول والبروجسترون، وهرمون الجونادوتروبين وتينيزينغ وتحفيز الهرمونات جريب، وموجهة الجسم الأصفر هرمون البرولاكتين الانتقال عبر هذه المراحل إشارة الإنجابية. التغييرات في التصنيف خلية داخل القناة المهبلية على الفئران تعكس هذه الأحداث الغدد الصماء الكامنة. ويمكن استخدام مراجعة يومية لنسبة النسبية للالأنوية الخلايا الظهارية، الخلايا الظهارية الحرشفية متقرن، والكريات البيض موجودة في المهبل مسحات لتحديد دقي الفئرانمراحل. درجة الغزو، ومع ذلك، يعملون في جمع هذه العينات يمكن أن يغير الوضع الإنجابية وتثير استجابة التهابية يمكن أن نخلط تقييم الخلوي من مسحات. هنا، نحن تصف بسيطة، غير الغازية بروتوكول التي يمكن استخدامها لتحديد مرحلة من مراحل دورة دقي على فأرة الحاسوب الإناث دون تغيير دورة حياتها الإنجابية. نحن بالتفصيل كيفية التمييز بين أربع مراحل من دورة دقي من جمع وتحليل الخلية التصنيف السائد في مسحات مهبلية ونحن نبين كيف يمكن تفسير هذه التغييرات فيما يتعلق بمركز الغدد الصماء.
Protocol
1. إعداد الكواشف
- لغسل المهبل معقم، الأوتوكلاف الماء المقطر مزدوجة ([ده 2 O) ومخزن في حاوية مغلقة بإحكام في درجة حرارة الغرفة لحين الحاجة إليها.
- لتقييم الخلوي، إضافة 0.1 غرام من مسحوق الكريستال البنفسجي إلى 100 مل من DDH 2 O. تخلط جيدا. ويمكن تخزين الكريستال البنفسجي وصمة عار (0.1٪) في حاوية مغلقة بإحكام في درجة حرارة الغرفة لحين الحاجة إليها.
2. خلايا المهبل جمع (الغسل المهبلي)
- وضع لمبة اللاتكس على نهاية تلميح 200 ميكرولتر معقمة ووضع ما يقرب من 100 ميكرولتر من معقمة [ده 2 O باستخدام التدرج على الطرف كمبدأ توجيهي الحجم.
- رفع الماوس للخروج من قفص لها ومكانها على النطاط قفص (غطاء) مع نهاية لها هند / الخلف نحو لكم.
- نتشبث الذيل ورفع النهاية الخلفية. سوف الماوس الآن فقط لها الكفوف أمام استيعاب النطاط. في هذه المرحلة قد الماوس التبول. إذا كان الأمر كذلك، انتظر حتى يتوقف التبول. ينبغي أن يكون هناك ترك البول عند مدخل قناة المهبل، قد تحتاج إلى شطف مع افتتاح الزائدة O 2 DDH باستخدام تلميح منفصلة (أي ليس تلميح الخاص بك جمع العينات).
- وضع نهاية الطرف DDH O مليئة 2 في افتتاح قناة المهبل مع الحرص على عدم اختراق فتحة المهبل و(وعنق الرحم) التحفيز يمكن أن تحدث في الفئران 1،2 حمل كاذب. التقارير الأخيرة تشير الفئران هي أقل عرضة لهذا الغرض مع ذلك ينبغي الحرص على تقليل درجة الغزو في التحليلات المتكررة 3.
- خفض بلطف لمبة لطرد ما بين ربع إلى نصف حجم الماء (~ 25-50 ميكرولتر) في افتتاح قناة المهبل. وهذه السوائل نضح تلقائيا في القناة دون الإدراج الإكراميات. الافراج ببطء الضغوط التي تمارس على لمبة. فإن السائل الانسحاب الى داخل الحافة. تجنب الضغط الإفراج بسرعة كبيرة جدا لمنع تطلع السوائلفي لمبة. وهناك معلومات قد تكون مفيدة تمت تصفيتها لهذا الغرض.
- كرر الخطوة السابقة مرة 4-5 باستخدام نفس الطرف، لمبة، والسائل للحصول على عدد كاف من الخلايا في عينة واحدة.
- ضع السائل على شريحة زجاجية، والسماح للتشويه حتى يجف تماما في درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة جافة، يمكن ملطخة هذه المسحات ودقي على الفور أو تخزينها وملطخة في وقت لاحق.
3. تلوين الخلوي باستخدام كريستال بنفسجي * 4
- ضع الشريحة الجافة في وعاء coplin (أو غيرها من السفن تلطيخ مقارنة) التي تحتوي على الكريستال البنفسجي وصمة عار لمدة 1 دقيقة.
- إزالة لجرة coplin ثانية تحتوي على DDH 2 O. غسل الشريحة مع DDH 2 O لمدة 1 دقيقة. تكرار.
- إزالة الزائدة DDH 2 O من حواف الشريحة مع الأنسجة منديل الخفيف واجب، وتجنب الاتصال مع مسحة الملون.
- ماصة ما يقرب من 15 ميكرولتر من الجلسرين على رأس تشويه والغطاءزلة. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام الكواشف الأخرى النسيجية تصاعد للحصول على أكثر ديمومة، وعدم نشرها وصمة عار.
* والتلوين بطريقة وصفها هنا هو أبسط الإجراءات التي يمكن القيام بها في أي مختبر. أساليب أخرى يمكن تقديم تفاصيل إضافية. على سبيل المثال، وذلك باستخدام تلطيخ بابانيكولاو، يمكن التمييز بين نضج الخلايا الظهارية خلايا الأنوية مع أقل نضجا الملون خلايا ناضجة الفيروز وأكثر الوردي أو البرتقالي الملون. ويمكن استخدام هذه الاختلافات لتنظيم مقدمات الوداق وقت مبكر أو متأخر .. 4
4. علم الخلايا المهبلية
- دراسة مسحة تحت المجهر ضوء لتحديد أنواع الخلايا الحالية. وينبغي أن يتم الفحص المجهري مباشرة بعد تلطيخ كما البنفسجي الكريستال ونشر من الخلايا مع مرور الوقت عند استخدام الجلسرين لcoverslipping. وينبغي اتخاذ Photomicrographs في وقت لتوثيق تحليل الخلايا.
- تبدأ من خلال النظر في entirتشويه الإلكتروني على أقل التكبير. تحديد منطقة ممثل والانتقال إلى أعلى التكبير. سترى الخلايا الظهارية الحرشفية متقرن، الكريات البيض، و / أو الخلايا الظهارية الأنوية (النتائج ممثل، الشكل 1A-C). ونسبة الخلايا الحالية تسمح لك لتحديد المرحلة دقي من الماوس في وقت جمع العينات (النتائج ممثل، الشكل 1D-G) وضعها على الفور الهرمونية (المناقشة، الشكل 2).
5. ممثل النتائج
علم الخلايا: يمكن الكشف عن ثلاثة أنواع الخلايا الأولية في عينات مسحة مهبلية: (1) الخلايا الظهارية الأنوية (الشكل 1A)، (2) الخلايا الظهارية الحرشفية متقرن (1B الشكل)، و (3) الكريات البيض (الشكل 1C). الخلايا الظهارية الأنوية لها السيتوبلازم الملون طفيفة، قتامة غشاء البلازما الملون، ونواة بيضاوية (
التدريج: يمكن استخدام نسبة النسبية للأنواع الخلايا التي لوحظت في مسحات لتحديد مرحلة من مراحل دورة دقي على الفأرة في يوم جمع العينات (الشكل 1D-G). خلال مقدمات الوداق، الخلايا بشكل حصري تقريبامجموعات من الجولة، جيد الإنشاء الأنوية الخلايا الظهارية (1D الشكل، ممثل الخلية المشار إليها بواسطة السهم الأبيض). خلال الدورة النزوية، ومتقرن الغالب الخلايا الحرشفية الخلايا الظهارية والحاضر في مجموعات المزدحمة بالسكان (الشكل 1E، ممثل الخلية المشار إليها بواسطة السهم). خلال تلية الوداق، الكريات البيض الملون الصغيرة على نحو مظلم تسود (الشكل 1F، ممثل الخلية المشار إليها بواسطة السهم الأسود). ويمكن ملاحظة الخلايا الظهارية الحرشفية متقرن، وغالبا في شظايا، (الشكل 1F، ممثل الخلية المشار إليها بواسطة السهم الأسود). خلال هجوع الودق، متقرن الحرشفية الخلايا الظهارية نادرة قد تكون لا تزال موجودة (الشكل 1G، ممثل الخلية المشار إليها بواسطة السهم الأسود)، ومع ذلك لا تزال تسود الكريات البيض (الشكل 1G، ممثل الخلية المشار إليها بواسطة السهم الأسود). ويمكن تمييز تلية الوداق من هجوع الودق بظهور الخلايا الظهارية الأنوية في هجوع الودق (
الشكل 1. ويمكن استخدام الخلوي من تقييم مسحات مهبلية لتحديد المرحلة دقي ثلاثة أنواع الخلايا الرئيسية في عينات تم الكشف عن تشويه المهبلية: (A) الخلايا الظهارية الأنوية، (B) الخلايا الظهارية الحرشفية متقرن، والكريات البيضاء (C). ويمكن استخدام نسبة من هذه أنواع الخلايا الموجودة في تشويه لتحديد الفئران في (D) مقدمات الوداق، (E) شبق، (F) تلية الوداق، أو هجوع الودق (G) كما هو موضح في نتائج ممثلة. الأسود في رؤوس سهام E، F ونقطة G لالخلايا الحرشفية الظهارية ممثل متقرن. أسود الأسهم في C، F G نقطة وممثل لleykocytes. الأنوية السهام البيضاء في D وممثل G تسليط الضوء على الخلايا الظهارية.
. JPG "بديل =" الشكل 2 "/>
الشكل 2. علم الخلايا المهبلية تشويه يعكس الأحداث الغدد الصماء الكامنة. كما يتم توفير التفاصيل في المناقشة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 3. قد تكون بلورات حمض اليوريك الحالي البنفسجي الكريستال التالية تلطيخ البول العينات الملوثة. (A) بلورات شفافة ويمكن أن تكون مختلفة الأحجام (الأسهم والمنطقة محاصر في تضخيم (B)). لا خلايا موجودة في هذا المجال. يجب اليوريك التلوث داخل الكريستال حمض الحقول المستخدمة لتلوين الخلوي تكون موجودة، فإنه قد يكون من الصعب تحديد بدقة أنواع الخلايا الحالية ويجب التخلص من التشويه. على نطاق والحانات = 50 ميكرومتر.
Discussion
هذه التغييرات في التصنيف خلية تدل على الأحداث الغدد الصماء الكامنة. مقدمات الوداق المرحلة من دورة دقي يتوافق مع المرحلة الجرابية الإنسان من الدورة الشهرية (5) ويعرف بزيادة ما قبل التبويض في تعميم β-17-استراديول مستويات 6، فضلا عن زيادة صغيرة في البرولاكتين 7 (الشكل 2، مقدمات الوداق، اللوحة اليمنى). الزيادة في استراديول-17-β يحفز بشكل غير مباشر بين الافراج عن الخلايا العصبية موجهة الغدد التناسلية الهرمون في منطقة ما تحت المهاد والحاجز الذي، بدوره، في تنشيط خلايا تستجيب الغدة النخامية الأمامية لاطلاق سراح الهرمون وهرمون المنبه للجريب إلى الدورة الدموية 8،9 (الشكل 2 ، مقدمات الوداق، اللوحة اليمنى). في مسحات مهبلية مأخوذة من الحيوانات في مقدمات الوداق، تكاد تكون الخلايا بيضاوية حصرا الخلايا الظهارية الأنوية (1D الشكل، الشكل 2، مقدمات الوداق، اللوحة اليمنى). في ذروة المنبه للجريب horm1 الإباضة مستويات الإشارات ودخولها حيز شبق 10،11. خلال الدورة النزوية، β-17-استراديول مستويات البرولاكتين وانخفاض مستويات الذروة 6،7 (الشكل 2، شبق، اللوحة اليمنى). مسحات مهبلية وتتميز من خلال الكشف الحصري تقريبا من الخلايا غير طبيعية الشكل متقرن الظهارية الحرشفية في كثير من الأحيان في كتل (الشكل 1E، الشكل 2، شبق، اللوحة اليمنى). دخول تلية الوداق يتزامن مع الارتفاع المستمر في مستويات هرمون البروجسترون 6 و يتوافق مع بداية مرحلة الجسم الأصفر الإنسان 12 (الشكل 2، تلية الوداق، اللوحة اليمنى). مستويات البروجسترون ويبدأ في الارتفاع، وهناك زيادة صغيرة في β-17-استراديول مستويات استجابة لتفعيل الجسم الأصفر 6،13،14 (الشكل 2، تلية الوداق، اللوحة اليمنى). أنواع الخلايا الموجودة في المهبل مسحات خلال هذه المرحلة هي، مجزأة متقرن الخلايا الظهارية والكريات البيض الملون أصغر قتامة (الارقام ..ه 1F، الشكل 2، تلية الوداق، اللوحة اليمنى). وأخيرا، الدخول إلى هجوع الودق يحدث في الفئران وتعميم مستويات البروجسترون الذروة 6، المقابلة لمرحلة الجسم الأصفر أواخر الإنسان 12. الانحدار من الجسم الأصفر يؤدي إلى انخفاض حاد في مستويات البروجسترون اللاحقة 15،16 (الشكل 2، هجوع الودق، اللوحة اليمنى). الكريات البيض تسود في مسحات خلال هجوع الودق. يتم تقليل وتيرة الخلايا الظهارية والخلايا الظهارية متقرن الأنوية تبدأ يتم الكشف عن فقط قبل الانتقال إلى مقدمات الوداق (الشكل 1G، الشكل 2، هجوع الودق، اللوحة اليمنى).
وباختصار، يمكن استخدام هذه بسيطة، والبروتوكول الروتينية لتقدير التقلبات الهرمونية اليومية وإنشاء المرحلة التجريبية في الفئران ودقي دون تغيير الوضع الإنجابية إذا اتخذت الاحتياطات التالية. يجب أن يتم تنفيذ أخذ العينات لا يزيد عن مرة واحدة يوميا باستخدام بروتوكول غير الغازية تنازلياribed هنا مقارنة الاختراق المتكرر لقناة المهبل، والطموح، والانفعالات. هذا يمكن أن يسبب تهيج المهبل مما أدى إلى استجابة التهابية 17 مما أدى إلى الكريات البيض وغيرها من أنواع الخلايا أن يكون حاضرا في مسحات التي قد نخلط تقييم الخلوي. وعلاوة على ذلك، حتى في مستعمرة الإناث، يضم، فمن الطبيعي أن نرى هجوع الودق الممتدة ومراحل مختلفة في الفئران شبق والحث جيدا من 18 اودقية وهذا التحديد يكون مفيدا في تفسير تأثير الهرمونات الإنجابية في والجنس والمرض والدراسات. وقدم أيضا التباين في الطول مع تقدم العمر ودورة من خلال أوجه الاختلاف السكن داخل المستعمرات (فرد أو مجموعة السكن) من الإناث 7،19-21. يمكن الإناث الموجودة في المستعمرات الإناث فقط وقف ركوب الدراجات وأدخل حالة من هجوع الودق لفترات طويلة بالرغم من أنه يمكن 18،22،23 الدراجات إعادة نصبها من قبل أقفاص سابقة التجهيز التعرض لمع البول الذكور للحصول الدراجات 24،25. وهكذا، لإنشاء individuaأطوال دورة لتر بالنسبة للماوس معين، فمن المستحسن أن يتم تنفيذ عمليات تقييم غير الغازية وصفها هنا يوميا، مع الرعاية، حتى لوحظ دورتين كاملتين.
Disclosures
الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح. أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الصارمة واللوائح المنصوص عليها من قبل جامعة أوتاوا رعاية الحيوان اللجنة والمجلس الكندي للرعاية الحيوان.
Acknowledgments
نود أن نشكر مارك ليونارد من وسائل الإعلام ستوديو كارلتون غامرة للحصول على المساعدة من الخبراء التقنيين في إنتاج وتحرير الفيديو والدكتور مارتن برتراند غامرة من وسائل الإعلام كارلتون مختبر التجديد استوديو / العصبية للمساعدة نموذج البصرية. الكتاب الامتنان على مشورة الخبراء من الدكتور مارلين Keaney وجميع العاملين معها مخصص في جامعة أوتاوا رعاية الحيوان والخدمات البيطرية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR، MOP 62826) لSALB، ومعهد CIHR من الشيخوخة ومبادرة استراتيجية التدريب في البحوث الصحية / برنامج تدريبي في CIHR Lipidomics الاعصاب (96121 TGF) لSALB وSF، المؤسسة الكندية للإبداع لSF، أونتاريو الابتكار الاستئماني لSF، و Autodesk البحوث إلى SF. ACM يتلقى بانتينغ CIHR وجائزة أفضل الدكتوراه. NV يتلقى زمالة ما بعد المهنية من معهد الشيخوخة وCIHR برنامج التدريب في Lipidomics الاعصاب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile 200 μl pipette tips | Diamed | E340901 | |
| Latex bulb (1 ml) | Fisher | 03-488-21 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Crystal Violet stain (25 g) | Fisher | C581-25 | |
| Light-duty Tissue Wipers | VWR | 82003-820 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Microscope Cover Glass (22x30) | Fisher | 12-544A |
References
- Adler, N. T., Zoloth, S. R. Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats. Science. 168, 1480-1482 (1970).
- Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation. Physiology. 5, 1003-1007 (1970).
- Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse. Journal of. 21, 30-39 (2009).
- Hong, H. Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer. Cancer research. 70, 221-228 (2010).
- Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. The menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).
- Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone. Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).
- Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle. Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).
- Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats. Nature. 264, 461-463 (1976).
- Rajendren, G., Gibson, M. J. A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen. Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).
- Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature. 15, 201-204 (1997).
- Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice. Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).
- Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. The normal menstrual cycle in women. Animal reproduction science. , 124-229 (2011).
- Appelgren, L. E. Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis. Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).
- Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice. Reproduction. 138, 571-579 (2009).
- Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).
- Rudolph, M. Induction of overt menstruation in intact mice. PLoS One. 7, e32922 (2012).
- Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).
- Whitten, W. K. Occurrence of anoestrus in mice caged in groups. The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).
- Lamond, D. R. Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice. The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).
- Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification. Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).
- Armaiz-Pena, G. N. Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).
- Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).
