Summary
Här beskriver vi hur du identifierar skede av murina reproduktiva (proestrus brunst, metestrus eller diestrus) genom enkel, icke-invasiv insamling och cytologisk bedömning av vaginala smear prover. Vi beskriver vidare hur vaginal cytologi speglar cirkulerande hormonella nivåer som ligger övergång genom murina reproduktiva cykeln.
Abstract
En snabb sätt att bedöma reproduktiv status hos gnagare är användbar inte bara i studier av reproduktiv dysfunktion men också för produktion av nya musmodeller av sjukdomen och utredningar i den hormonella regleringen av vävnad degeneration (eller regenerering) efter patologisk utmaning. Den murina reproduktiv (eller estrous) cykel är indelad i 4 steg: proestrus estrus, metestrus och diestrus. Definierade fluktuationer i cirkulerande nivåer av ovariesteroider 17-β-östradiol och progesteron, gonadotropinerna luteiniserande och follikelstimulerande hormoner, och luteotropic hormonet prolaktin signalövergång genom dessa reproduktiva stadier. Förändringar i cell typologi inom murina vaginala kanalen återspeglar dessa underliggande endokrina händelser. Daglig bedömning av det relativa förhållandet mellan kärnförsedda epitelceller, förhornade skvamösa epitelceller och leukocyter närvarande i vaginala utstryk kan användas för att identifiera murin östrusstadier. Graden av invasivitet dock anställd samla in dessa prover kan förändra reproduktiva status och framkalla en inflammatorisk reaktion som kan förbrylla cytologisk bedömning av utstryk. Här beskriver vi en enkel, icke-invasiv protokoll som kan användas för att bestämma stadium av Östrogencykeln för en kvinnlig mus utan att ändra sin reproduktiva cykel. Vi detalj hur att skilja mellan de fyra stegen i estrous cykeln genom insamling och analys av dominerande celler typologi i vaginala utstryk och vi visar hur dessa förändringar kan tolkas med avseende på endokrina status.
Protocol
1. Förbereda Reagens
- För steril vaginal lavage, autoklavera dubbeldestillerat vatten (DDH 2 O) och förvara i en väl tillsluten behållare i rumstemperatur tills det behövs.
- För cytologisk utvärdering, tillsätt 0,1 g kristallviolett pulver till 100 ml av Ddh 2 O. Blanda väl. Kristallviolett färgning (0,1%) kan lagras i en tätt försluten behållare vid rumstemperatur tills den behövs.
2. Samla vaginal celler (Vaginal Lavage)
- Placera en latex glödlampa på änden av en steril 200 pl spets och upprätta cirka 100 pl sterilt DDH 2 O med användning av graderingarna på spetsen som en volym riktlinje.
- Lyft musen ut ur buren och placera henne på buren tratten (lock) med sin hind / bak mot dig.
- Ta tag i svansen och lyfta den bakre änden. Musen har nu bara hennes framben greppa behållaren. Vid denna punkt musen kan urinera. Om så, Vänta tills urinering stannar. Ska det finnas urin kvar vid ingången till den vaginala kanalen kan du skölja öppningen med överskott DDH 2 O med en separat spets (dvs inte din provtagning tips).
- Placera änden av DDH 2 O-fyllda spets vid öppnandet av den vaginala kanalen noga med att inte tränga öppningen som vaginal (och livmoderhalscancer) stimulering kan inducera pseudodräktighet hos råttor 1,2. Aktuella rapporter visar möss är mindre känsliga för denna effekt ändå försiktighet bör vidtas för att minimera graden av invasivt i upprepade analyser 3.
- Tryck försiktigt lampan att utvisa fjärdedel till hälften av den volym vatten (~ 25-50 ul) vid öppnandet av vaginala kanalen. Vätskan kommer spontant Aspirera i kanalen utan spets insättning. Långsamt frigöra trycket som utövas på glödlampan. Fluiden kommer att dra tillbaka tillbaka in i spetsen. Undvik släppa trycket för snabbt för att förhindra aspiration av vätskai glödlampan. En filtrerad spets kan vara användbara för detta ändamål.
- Upprepa föregående steg 4-5 gånger med samma spets, glödlampa, och vätska för att erhålla ett tillräckligt antal celler i ett enda prov.
- Placera vätskan på glasskivan, och låta utstryket torka fullständigt vid rumstemperatur. När torr, kan dessa estrous utstryk färgas omedelbart eller lagras och färgades vid en senare tidpunkt.
3. Cytologisk färgning med kristallviolett * 4
- Placera den torra objektglaset i ett Coplin-kärl (eller annan jämförbar färgning kärl) innehållande kristallviolett färgning för 1 minut.
- Ta en andra Coplin burk innehåller DDH 2 O. Tvätta objektglaset med DDH 2 O under 1 minut. Upprepa.
- Avlägsna överskottet DDH 2 O från kanterna av bilden med en lätta vävnad torkare, undvik kontakt med det färgade utstryket.
- Pipettera cirka 15 pl glycerol ovanpå utstryk och locketslip. Alternativt kan andra histologiska montering reagenser användas för att få en mer permanent, icke sprida fläcken.
* Den färgning som beskrivs här är det enklaste förfarandet som kan utföras i alla laboratorier. Andra metoder kan ge ytterligare information. Till exempel använder Papanicolaou färgning, kan löptiden för kärnförsedda epitelceller särskiljas med mindre mogna celler färgade turkos och mer mogna celler rosa-eller orange-färgade. Dessa skillnader kan användas för att iscensätta tidig eller sen proöstrus. 4
4. Vaginal cytologi
- Undersök utstryket under ljusmikroskop för att bestämma celltyper närvarande. Mikroskopisk undersökning ska göras omedelbart efter färgning som kristallviolett kommer att spridas från cellerna med tiden när man använder glycerol för coverslipping. Mikrofotografier bör tas vid tidpunkten för analys för att dokumentera cytologi.
- Börja med att undersöka entire utstryket på en lägre förstoring. Välj en representativ yta och flytta till en högre förstoring. Du kommer att se kornifierade skvamösa epitelceller, leukocyter och / eller kärnförsedda epitelceller (representativa resultat, Figur 1A-C). Förhållandet mellan celler närvarande kan du bestämma estrous stadium musen vid tidpunkten för provtagning (representativa resultat, figur 1D-G) och hennes närmaste hormonella status (diskussion, figur 2).
5. Representativa resultat
Cytologi: Tre primära celltyper kan detekteras i vaginala smear prover: (1) kärnförsedda epitelceller (figur 1A), (2) kornifierade skvamösa epitelceller (figur 1B), och (3) leukocyter (Figur 1C). Kärnförsedda epitelceller har en lätt färgad cytoplasma, mörkare färgade plasmamembranet, och en oval kärna (
Stadieindelning: Det relativa förhållandet mellan celltyper observerats i utstryk kan användas för att identifiera steg i Östrogencykeln för musen på dagen för provtagning (figur 1D-G). Under proestrus cellerna nästan uteslutandekluster av runda, välformade kärnförsedda epitelceller (figur 1D, representativ cell indikeras med vit pil). Under brunst, celler huvudsakligen Cornified skivepitelcancer epitelceller, som finns i tätt packade kluster (Figur 1E, representativ cell som anges av pilspets). Under metestrus, små mörkt färgade leukocyter dominerar (Figur 1F, representativ cell indikeras med svart pil). Förhornade skvamösa epitelceller kan observeras, ofta i fragment, (Figur 1F, representativ cell indikeras med svart pilspets). Under diestrus kan sällsynta förhornade skivepitelcancer epitelceller fortfarande finnas (figur 1G, representativ cell som anges av svart pilspets), men leukocyter dominerar fortfarande (figur 1G, representativ cell indikeras med svart pil). Metestrus kan skiljas från diestrus genom uppkomsten av kärnförsedda epitelceller i diestrus (
Figur 1. Cytologisk bedömning av vaginala utstryk kan användas för att identifiera estrous stadium detekteras i vaginala smear prover Tre huvudsakliga celltyper:. (A) kärnförsedda epitelceller, (B) förhornade skvamösa epitelceller, och (C) leukocyter. Förhållandet mellan dessa celltyper närvarande i utstryk kan användas för att identifiera möss i (D) proestrus (E) östrus, (F) metestrus, eller (G) diestrus såsom beskrivits i representativa resultat. Svarta pilar i E, F och G pekar på representativa förhornade skivepitelcancer epitelceller. Svarta pilar i C, F och G pekar på representativa leykocytes. Vita pilar i D och G markera representant kärnförsedda epitelceller.
. Jpg "alt =" Bild 2 "/>
Figur 2. Vaginal smear cytologi speglar underliggande endokrina händelser. Detaljer också ges i diskussion. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Urinsyra kristaller kan finnas efter kristallviolett färgning av urin-förorenade prover. (A) Kristaller är öppna och kan vara av olika storlekar (pilar och förpackade regionen förstoras i (B)). Inga celler finns i detta område. Bör urinsyra kristall kontaminering inom områden som används för cytologisk färgning vara närvarande, kan det vara svårt att exakt identifiera celltyper närvarande och cellprov ska kasseras. Skala barer = 50 pm.
Discussion
Dessa förändringar i cellens typologi tyder på underliggande endokrina händelser. Den proöstrus fasen av estrous cykel motsvarar den humana follikulära fasen av menstruationscykeln 5 och definieras av en pre-ovulatoriska ökningen cirkulerande 17-β-östradiolnivåer 6, liksom en liten ökning i prolaktin 7 (figur 2, proestrus, vänster panel). Ökningen av 17-β-östradiol stimulerar indirekt gonadotropinfrisättande hormon neuroner i hypotalamus och septum som, i sin tur, aktiverar responsiva celler i den främre hypofysen att frigöra luteiniserande hormon och follikelstimulerande hormon i cirkulationen 8,9 (Figur 2 , proestrus vänstra panelen). I vaginala utstryk tagna från djur i proestrus celler är nästan uteslutande ovala kärnförsedda epitelceller (figur 1D, fig. 2, proestrus, höger panel). Toppen i follikelstimulerande Hormen nivå signaler ägglossning och träder i brunst 10,11. Under östrus, 17-β-estradiol nivåer minska och prolaktinnivåer topp 6,7 (Figur 2, estrus, vänstra panelen). Vaginala utstryk kännetecknas av nästan uteslutande detektion av oregelbundet formade förhornade skvamösa epitelceller ofta i klumpar (Figur 1E, figur 2, estrus, höger panel). Ikraftträdande metestrus sammanfaller med en kontinuerlig ökning av nivåerna progesteron hormon 6 och motsvarar början av människans lutealfas 12 (figur 2, Metestrus, vänstra panelen). Som progesteron nivåer börja stiga och det finns en liten ökning i 17-β-estradiol nivåer som svar på gulkropp aktivering 6,13,14 (figur 2, Metestrus, vänstra panelen). De celltyper som finns i vaginala utstryk under detta skede är fragmenterade, förhornade epitelceller och mindre mörkare färgade leukocyter (Figure 1F, 2 figur Metestrus, högra panelen). Slutligen sker inträde i diestrus i möss och cirkulerande progesteronnivåer topp 6, motsvarande den humana sen luteal fas 12. Regression av gulkroppen leder till en efterföljande kraftig nedgång i progesteronnivåer 15,16 (figur 2, Diestrus, vänstra panelen). Leukocyter dominerar i utstryk under diestrus. Frekvensen av förhornade epitelceller reduceras och kärnförsedda epitelceller börjar detekteras strax före övergången till proöstrus (figur 1G, figur 2, Diestrus, höger panel).
Sammanfattningsvis kan denna enkla, rutin protokoll användas för att uppskatta dagliga hormonella svängningar och etablera estrous steg i experimentella möss utan att reproduktiv status om följande försiktighetsåtgärder vidtas. Provtagning ska utföras mer än en gång dagligen med den icke-invasiva protokoll described här jämfört med upprepad penetrering av den vaginala kanalen, aspiration, och omröring. Detta kan orsaka vaginal irritation resulterar i ett inflammatoriskt svar 17 resulterar i leukocyter och andra celltyper att vara närvarande i utstryk som kan förvirra cytologisk utvärdering. Även i koloni hysta kvinnor, är det normalt att se utökade diestrus och estrus stadier i olika möss samt induktion av anestrous 18 och denna identifikation är användbar vid tolkningen av hormonella effekter i reproduktiv, kön och studier sjukdom. Variabilitet i cykellängd godtas också med ålder och bostäder skillnader inom kolonier (individ eller grupp-bostäder) av kvinnor 7,19-21. Kvinnor hålls i kvinnodominerade endast kolonier kan upphöra cykling och ange ett tillstånd av långvarig diestrus 18,22,23 även cykling kan återinföras genom exponering för burar förbehandlade med manlig urin att framkalla cykling 24,25. Således, för att etablera individual cykellängder för en given mus, rekommenderas att de icke-invasiva bedömningar som beskrivs här utföras dagligen, med omsorg, till två kompletta cykler observeras.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt. Alla djurförsök utfördes i strikt överensstämmelse med de riktlinjer och regler som anges av University of Ottawa Animal Care kommittén och kanadensiska rådet om Animal Care.
Acknowledgments
Vi vill tacka Marc Leonard från Carleton Immersive Media Studio för teknisk experthjälp i videoproduktion och redigering och Martin Bertrand från Carleton Immersive Media Studio / neurala Regeneration Laboratoriet för visuell modell hjälp. Författarna erkänner tacksamt expertråd av Dr Marilyn Keaney och alla hennes hängivna personal vid universitetet i Ottawa Animal Care och veterinärtjänster. Detta arbete har finansierats av den kanadensiska Institute of Health Research (CIHR, MOP 62.826) till SALB är CIHR Institutet för Aging och strategisk utbildning initiativet hälsoforskning / CIHR utbildningsprogram Neurodegenerativa Lipidomics (TGF 96.121) till SALB och SF, kanadensisk stiftelse för innovation till SF, Ontario Innovation Lita till SF, och Autodesk Research till SF. ACM får CIHR Banting och Best doktorsexamen utmärkelse. NV får en post-professionell gemenskap från Institute of Aging och CIHR utbildning i Neurodegenerativa Lipidomics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile 200 μl pipette tips | Diamed | E340901 | |
| Latex bulb (1 ml) | Fisher | 03-488-21 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Crystal Violet stain (25 g) | Fisher | C581-25 | |
| Light-duty Tissue Wipers | VWR | 82003-820 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Microscope Cover Glass (22x30) | Fisher | 12-544A |
References
- Adler, N. T., Zoloth, S. R. Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats. Science. 168, 1480-1482 (1970).
- Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation. Physiology. 5, 1003-1007 (1970).
- Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse. Journal of. 21, 30-39 (2009).
- Hong, H. Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer. Cancer research. 70, 221-228 (2010).
- Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. The menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).
- Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone. Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).
- Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle. Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).
- Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats. Nature. 264, 461-463 (1976).
- Rajendren, G., Gibson, M. J. A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen. Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).
- Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature. 15, 201-204 (1997).
- Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice. Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).
- Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. The normal menstrual cycle in women. Animal reproduction science. , 124-229 (2011).
- Appelgren, L. E. Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis. Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).
- Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice. Reproduction. 138, 571-579 (2009).
- Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).
- Rudolph, M. Induction of overt menstruation in intact mice. PLoS One. 7, e32922 (2012).
- Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).
- Whitten, W. K. Occurrence of anoestrus in mice caged in groups. The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).
- Lamond, D. R. Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice. The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).
- Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification. Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).
- Armaiz-Pena, G. N. Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).
- Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).
