Summary
כאן, אנו מתארים כיצד לזהות את השלב של הרבייה העכברית (proestrus, ייחום, metestrus, או diestrus) על ידי אוסף פשוט, לא פולשנית והערכת ציטולוגיה של דגימות למרוח בנרתיק. בנוסף, אנו מתארים כיצד ציטולוגית נרתיק משקפת רמות הורמונים במחזור שעשו את המעבר דרך מחזור הרבייה העכברי.
Abstract
אמצעי מהיר של הערכת מצב פוריות במכרסמים הוא שימושי לא רק בחקר תפקוד רבייה אלא גם נדרש לייצור דגמים חדשים עכבר של מחלה וחקירות הוויסות הורמונלי של ניוון רקמות (או התחדשות) בעקבות אתגר פתולוגי. מחזור הרבייה העכברית (או ייחום חולל) מחולק ל 4 שלבים: proestrus, ייחום, metestrus וdiestrus. תנודות שהוגדרו במחזור הרמות של סטרואידי השחלות 17-β-אסטרדיול ופרוגסטרון, הורמונים וזקיק luteinizing הורמונים המגרים את הדמיון, ומעבר luteotropic הורמון פרולקטין האות דרך שלבי רבייה אלה. שינויים בטיפולוגיה תא בתוך תעלת הנרתיק העכברית לשקף האירועים אנדוקריניות הבסיסיים הללו. הערכה יומית של היחס היחסי של תאי בעלי גרעין אפיתל, תאי אפיתל קשקש cornified וLeukocytes הנוכחי במריחות נרתיק יכולה לשמש לזיהוי ייחום חולל עכברישלבים. מידת הפולשנות, לעומת זאת, הועסקה באיסוף דגימות אלה יכולים לשנות את מצב פוריות ולעורר תגובה דלקתית שיכול לבלבל את הערכת ציטולוגיה של מריחות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט, לא פולשנית שיכול לשמש כדי לקבוע את השלב של מחזור הייחום חולל של עכבר נשי מבלי לשנות מחזור הרבייה שלה. אנחנו פירוט כיצד להבחין בין ארבעה שלבים של מחזור הייחום חולל על ידי איסוף וניתוח של טיפולוגיה תא השולט במריחות נרתיק ואנו מראים כיצד שינויים אלה יכולים להתפרש ביחס למעמד האנדוקרינית.
Protocol
1. ריאגנטים הכנה
- לשטיפת נרתיק סטרילי, חיטוי מים מזוקקים כפולים (DDH 2 O) ולאחסן במכל סגור היטב בטמפרטורת חדר עד צורך.
- להערכת ציטולוגיה, להוסיף 0.1 גר 'האבקה סגולה גביש עד 100 מ"ל של DDH 2 O. מערבב היטב. סגול קריסטל כתם (0.1%) ניתן לאחסן במכל סגור היטב בטמפרטורת חדר עד צורך.
2. תאי נרתיק איגום (שטיפת נרתיק)
- הנח נורת לטקס בקצה קצה μl סטרילי 200 ותרשום כ 100 μl של DDH 2 O סטרילי באמצעות השינויים ההדרגתיים בקצה כקו מנחה נפח.
- הרם את העכבר מחוץ לכלוב שלה ומניח אותה על אסלת הכלוב (מכסה) בקצה האחורי / אחורי שלה כלפיך.
- תקיפות לתפוס את הזנב ולרומם את האחוריים. העכבר כעת יש רק טלפיה הקדמיות התופסניות המרזב. בשלב זה העכבר יכול להשתין. אם כן, לחכות עד שמפסיק מתן שתן. לא צריך להיות שתן נשאר בכניסה לתעלת נרתיק, ייתכן שתרצה לשטוף את הפתיחה עם DDH 2 O העודף באמצעות טיפ נפרד (כלומר, לא טיפ אוסף המדגם שלך).
- מחבר את הקצה של קצה DDH 2 O מלא בפתיחה של תעלת הנרתיק נזהר שלא יחדור פתח כגירוי בנרתיק (וצוואר רחם) יכול לגרום pseudopregnancy בחולדות 1,2. הדיווחים האחרונים מראים עכברים הם פחות רגישים להשפעה זו בכל זאת יש להקפיד למזער את מידת הפולשנות בניתוחים חוזרים 3.
- עדינות לדכא את הנורה לגרש רבע למחצית מכמות המים (~ 25-50 μl) בפתיחת תעלת נרתיק. הנוזל יהיה ספונטני לשאוב לתוך התעלה ללא החדרת קצה. לאט לאט משחרר את הלחץ המופעל על הנורה. הנוזל ייסוג בחזרה לקצה. הימנע מלחץ משחרר מהר מדי כדי למנוע שאיפת הנוזללנורה. טיפ מסונן עשוי להיות שימושי למטרה זו.
- חזור על 4-5 פעמים בשלב הקודמת תוך שימוש באותה עצה, נורה, ונוזל לקבלת מספר מספק של תאים בדגימה אחת.
- הנח את הנוזל בשקופית זכוכית, ומאפשר המריחה להתייבש לחלוטין בטמפרטורת חדר. ברגע יבש, מורח הייחום חולל אלה יכול להיות מוכתמים באופן מיידי או מאוחסן ומוכתם במועד מאוחר יותר.
3. כתמי ציטולוגיה באמצעות קריסטל ויולט * 4
- הנח את השקף היבש בצנצנת Coplin (או כלי דומה מכתים אחר) המכיל קריסטל הסגול כתם לדקות 1.
- הסר לצנצנת המכילה 2 Coplin DDH 2 O. שטוף את השקופיות עם DDH 2 O לדקות 1. חזור.
- הסר את DDH 2 O העודף מקצוות של השקופיות עם מגב רקמת חובת אור, הימנעות ממגע עם הכתם הצבעוני.
- פיפטה כ 15 μl של גליצרול על גבי המשטח והכיסויתחליק. לחלופין, ריאגנטים הרכבה היסטולוגית אחרים יכולים להיות מנוצלים כדי לקבל כתם קבוע יותר, שאינם מתפוגג.
* שיטת הצביעה שתוארה כאן היא ההליך הפשוט ביותר שניתן לבצע בכל מעבדה. שיטות אחרות יכולות לספק פרטים נוספים. לדוגמה, באמצעות צביעת Papanicolaou, הפדיון של תאי האפיתל בעלי גרעין ניתן להבחין בתאים פחות בוגרים תאי טורקיז ועוד מוכתמים בשלים ורודים או כתומים מוכתמים. הבדלים אלה יכולים לשמש כדי לביים proestrus המוקדם או מאוחר. 4
4. ציטולוגית נרתיק
- בחן את הכתם תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע סוגי תאים קיימים. בדיקה מיקרוסקופית צריך להיעשות מייד לאחר הכתמה כסגולה גביש לפזר מהתאים לאורך זמן בעת השימוש בגליצרול לcoverslipping. Photomicrographs יש לנקוט בעת הניתוח כדי לתעד ציטולוגיה.
- התחל על ידי בחינת entirלמרוח דואר בהגדלה נמוכה. בחר אזור נציג ולעבור להגדלה גבוהה יותר. אתה תראה cornified תאי קשקש האפיתל, לויקוציטים, ו / או תאי אפיתל בעלי גרעין (תוצאות נציגויות, האיור 1A-C). היחס בין הווה תאים יאפשר לך לקבוע את שלב הייחום חולל על העכבר בשלב של איסוף דגימה (תוצאות נציגויות, איור 1D-G) ומצב הורמונלי המיידי (דיון, איור 2).
5. נציג תוצאות
ציטולוגיה: שלושה סוגי תאים עיקריים ניתן להבחין בדגימות למרוח נרתיק: (1) תאי האפיתל בעלי גרעין (איור 1 א), (2) cornified תאי קשקש האפיתל (1B איור), ו( 3) Leukocytes (התרשים 1C). תאי האפיתל בעלי גרעין יש ציטופלסמה קלילות מוכתמת, קרום פלזמה צבעוני כהה יותר, וגרעין סגלגל (
בימוי: היחס היחסי של סוגי תאים שנצפו מריחות יכול לשמש כדי לזהות את השלב של מחזור הייחום חולל על העכבר ביום איסוף דגימה (איור 1D-G). במהלך proestrus, תאים הם כמעט אך ורקאשכולות של סיבוב, בנוי היטב בבעלי גרעין תאי אפיתל (1D איור, נציג תא מסומן על ידי חץ לבן). במהלך ייחום, תאים cornified בעיקר תאי קשקש האפיתל, בהווה באשכולות צפופים (האיור 1E, נציג תא שצוין על ידי ראש החץ). במהלך metestrus, לויקוציטים קדרות המוכתם הקטן שולט (האיור 1F, נציג תא מסומן על ידי חץ שחור). תאי אפיתל קשקש Cornified ניתן להבחין לעתים קרובות בברים, (האיור 1F, נציג תא שצוין על ידי ראש החץ שחור). במהלך diestrus, תאי קשקש cornified נדירים אפיתל עשויים עדיין להיות נוכחים (האיור 1G, נציג תא שצוין על ידי ראש החץ שחור), אולם עדיין שולט, לויקוציטים (האיור 1G, נציג תא מסומן על ידי חץ שחור). Metestrus ניתן להבחין בין diestrus ידי המראה של תאי האפיתל בעלי גרעין בdiestrus (
איור 1. הערכת ציטולוגיה של מריחות נרתיק יכולה לשמש לזיהוי שלב ייחום חולל שלושה סוגי תאים עיקריים שזוהו בדגימות למרוח נרתיק:. () תאי אפיתל בעלי גרעין, (ב) תאי אפיתל קשקש cornified, ו (ג) תאי דם לבנים. היחס של סוגי תאים אלה נמצאים במריחה יכול לשמש כדי לזהות עכברים ב( ד ') proestrus, (ה) ייחום, (F) metestrus, או (ז) diestrus כמתואר בתוצאות נציג. ראשי חץ שחורים בE, F ונקודת G לתאי קשקש cornified יציגים אפיתל. חיצים שחורים ב C, F ו-G לנקודת leykocytes נציג. חצים לבנים בD ונציג שיא G בעלי גרעין תאי אפיתל.
. "Alt =" jpg איור 2 "/>
איור 2. ציטולוגית מריחה בנרתיק משקפת אירועים אנדוקריניות בסיסיים. פרטים ניתנים גם בדיון. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. גבישי חומצת שתן עלולים להיות מכתימים ההווה הבא גביש סגול של דגימות שתן מזוהמות. () קריסטלים שקופים ויכולים להיות בגדלים שונים (חצים ואזור התאגרף המוגדלים ב( ב)). אין תאים קיימים בתחום זה. האם זיהום שתן חומצת גביש בתוך שדות המשמשים לצביעת ציטולוגיה להיות נוכח, זה עלול להיות קשה לזהות במדויק סוגי תאים בהווה ובהכפשה אמורה להיות מושלכת. ברי קנה מידה = 50 מיקרומטר.
Discussion
שינויים אלו בטיפולוגיה תא מעידים על אירועים אנדוקריניות בסיסיים. שלב proestrus של מחזור הייחום חולל תואם את שלב הזקיקים האנושי של מחזור 5 ומוגדר על ידי גידול טרום ביוץ במחזור הרמות 17-β-אסטרדיול 6, כמו גם עלייה קטנה ב7 פרולקטין (איור 2, Proestrus, פנל שמאלי). העלייה ב- β-אסטרדיול 17 בעקיפין ממגרת גונדוטרופין-שחרור הורמון הנוירונים ביפותלמוס ומחץ, בתורו, מפעילים תאים מגיבים ביותרת המוח קדמי כדי לשחרר את הורמון luteinizing הורמון זקיק ומגרה למחזור הדם 8,9 (איור 2 , Proestrus, פנל שמאלי). במריחות נרתיק שנלקחו מבעלי החיים בproestrus, הם תאי אפיתל בעלי גרעין באופן כמעט בלעדי סגלגלים (1D איור, איור 2, Proestrus, לוח ימני). השיא בהורם זקיק מגרה1 רמות ביוץ אותות וכניסה לייחום 10,11. במהלך הייחום, רמות 17-β-אסטרדיול ופרולקטין ירידת רמות שיא 6,7 (איור 2, ייחום, פנל שמאלי). מריחות נרתיק מאופיינות בזיהוי כמעט בלעדי של תאים חריגים בצורת cornified קשקש האפיתל לעתים קרובות בגושים (האיור 1E, איור 2, ייחום, לוח ימני). כניסה לmetestrus עולה בקנה אחד עם עלייה מתמדת ברמות הורמון פרוגסטרון 6 ותואמת את תחילתו של שלב שני בבני אדם 12 (איור 2, Metestrus, פנל שמאלי). כאשר רמות הפרוגסטרון מתחילות לעלות ויש זרם קל ברמות 17-β-אסטרדיול בתגובה להפעלת הגופיף צהוב 6,13,14 (איור 2, Metestrus, פנל שמאלי). סוגי התאים המצויים במריחות נרתיק בשלב זה הם תאי אפיתל מקוטעים, cornified וLeukocytes המוכתם הכהה קטן יותר (Figurהדואר 1F, איור 2, Metestrus, לוח ימני). לבסוף, כניסה לdiestrus בעכברים מתרחשת ורמות פרוגסטרון במחזור 6 שיא, המקבילה לשלב השני באיחור האנושי 12. רגרסיה של הגופיף הצהוב מובילה לירידה חדה ברמות פרוגסטרון לאחר 15,16 (איור 2, Diestrus, פנל שמאלי). Leukocytes שולט במריחות במהלך diestrus. התדירות של תאי האפיתל cornified מצטמצמת ותאי האפיתל בעלי גרעין מתחילים להתגלות רק לפני המעבר לproestrus (לוח ימני האיור 1G, איור 2, Diestrus,).
לסיכום, פרוטוקול זה פשוט, שגרתי ניתן להשתמש כדי להעריך את תנודות הורמונליות יומיות והקמת שלב ייחום חולל בעכברי ניסוי מבלי לשנות מצב פוריות אם אמצעי הזהירות הבא נלקחים. דגימה יש לבצע לא יותר מאשר באמצעות הפרוטוקול יורד פולשני פעם ביוםribed כאן בהשוואה לחדירה חוזרת ונשנית של תעלת הנרתיק, שאיפה, והסתה. זה יכול לגרום לגירוי נרתיק וכתוצאה מכך 17 תגובה דלקתית וכתוצאה מלויקוציטים וסוגי תאים אחרים להיות נוכח במריחות שעלולות רודפות הערכת ציטולוגיה. יתר על כן, גם בנקבות מושבה שוכנה, זה נורמלי לראות diestrus מורחב ושלבי ייחום בעכברים שונים כמו גם אינדוקציה של 18 anestrous והזדהות זו היא שימושית בפרשנות של השפעה ההורמונלית ברבייה, מין, ומחקרי מחלה. השתנות באורך המחזור היא גם הציג עם גיל והבדלי דיור במושבות (אישי או קבוצתי לדיור) של נקבות 7,19-21. נקבות שוכנו במושבות נשיות בלבד יכולות להפסיק את הרכיבה על אופניים ולהיכנס למצב של diestrus הממושך 18,22,23 למרות שרכיבה על אופניים יכולה להיות מחדש נחקקה על ידי חשיפה לכלובי pretreated עם שתן גברי לעורר רכיבה 24,25. לכן, כדי להקים individuaאורכי מחזור הליטר לעכבר ניתן, מומלצים שההערכות לא פולשנית תוארו כאן יש לבצע מדי יום, בזהירות, עד שני מחזורים שלמים הם נצפו.
Disclosures
המחברים מצהירים אין ניגוד האינטרסים. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בציות מלא להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת אוטווה בעלי חי טיפול הוועדה והמועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות למארק לאונרד מקרלטון Immersive סטודיו מדיה לקבלת סיוע טכני מומחה בהפקת וידאו ועריכת ד"ר מרטין ורטרנד מקרלטון Immersive מעבדה וסטודיו / עצבי התחדשות לסיוע מודל חזותי. החוקרים מכירים תודה עמוק על הייעוץ המקצועי של ד"ר מרילין Keaney וכל צוות המסור שלה באוניברסיטה של אוטווה וטיפול בבעלי חי שירותים הווטרינריים. עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR, MOP 62826) לSALB, CIHR המכון להזדקנות ויוזמת אימונים אסטרטגיים במחקר בריאות / תכנית אימוני CIHR בLipidomics ניווניות (96121 TGF) לSALB ומדע בדיוני, קרן קנדית לחדשנות למדע בדיוני, אונטריו חדשנות נאמנות למדע בדיוני, וAutodesk מחקר למדע בדיוני. ACM מקבל נטינג CIHR ופרס דוקטורט הטוב ביותר. NV מקבל מלגת פוסט מקצועית ממכון להזדקנות ותכנית אימוני CIHR בLipidomics ניווניות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile 200 μl pipette tips | Diamed | E340901 | |
| Latex bulb (1 ml) | Fisher | 03-488-21 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Crystal Violet stain (25 g) | Fisher | C581-25 | |
| Light-duty Tissue Wipers | VWR | 82003-820 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Microscope Cover Glass (22x30) | Fisher | 12-544A |
References
- Adler, N. T., Zoloth, S. R. Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats. Science. 168, 1480-1482 (1970).
- Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation. Physiology. 5, 1003-1007 (1970).
- Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse. Journal of. 21, 30-39 (2009).
- Hong, H. Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer. Cancer research. 70, 221-228 (2010).
- Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. The menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).
- Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone. Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).
- Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle. Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).
- Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats. Nature. 264, 461-463 (1976).
- Rajendren, G., Gibson, M. J. A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen. Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).
- Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature. 15, 201-204 (1997).
- Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice. Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).
- Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. The normal menstrual cycle in women. Animal reproduction science. , 124-229 (2011).
- Appelgren, L. E. Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis. Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).
- Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice. Reproduction. 138, 571-579 (2009).
- Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).
- Rudolph, M. Induction of overt menstruation in intact mice. PLoS One. 7, e32922 (2012).
- Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).
- Whitten, W. K. Occurrence of anoestrus in mice caged in groups. The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).
- Lamond, D. R. Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice. The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).
- Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification. Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).
- Armaiz-Pena, G. N. Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).
- Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).
