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Biology

माउस estrous चक्र मचान पहचान के लिए योनि Lavage, क्रिस्टल वायलेट धुंधला, और योनि कोशिकाविज्ञान मूल्यांकन प्रदर्शन

doi: 10.3791/4389 Published: September 15, 2012

Summary

यहाँ, हम वर्णन कैसे सरल, गैर इनवेसिव संग्रह और योनि धब्बा नमूने की कोशिकाविज्ञान मूल्यांकन murine प्रजनन (proestrus, मद, metestrus, या diestrus) के चरण की पहचान करने के लिए. हम आगे का वर्णन कैसे योनि कोशिका विज्ञान murine प्रजनन चक्र के माध्यम से संक्रमण अंतर्निहित हार्मोनल स्तरों परिसंचारी दर्शाता है.

Abstract

कृन्तकों में प्रजनन की स्थिति का आकलन करने के तेजी से मतलब प्रजनन में शिथिलता के अध्ययन में न केवल उपयोगी है, बल्कि ऊतक अध: पतन का हार्मोनल विनियमन (या उत्थान) में इस रोग के नए माउस मॉडल और जांच के रोग चुनौती के बाद उत्पादन के लिए आवश्यक है. proestrus, मद, metestrus, और diestrus: murine प्रजनन चक्र (या estrous) 4 चरणों में विभाजित है. डिम्बग्रंथि 17-β estradiol और प्रोजेस्टेरोन स्टेरॉयड के स्तर परिसंचारी में परिभाषित उतार चढ़ाव, luteinizing गोनैडोट्रॉपिंस और उत्तेजक हार्मोन कूप, और luteotropic इन चरणों के माध्यम से प्रजनन हार्मोन प्रोलैक्टिन संकेत संक्रमण. सेल typology में murine योनि नहर के भीतर परिवर्तन इन अंतर्निहित endocrine घटनाओं को दर्शाते हैं. Nucleated उपकला कोशिकाओं, श्रृंगित स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं, और योनि स्मीयरों में वर्तमान leukocytes के रिश्तेदार अनुपात का दैनिक आकलन murine estrous पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैचरणों. invasiveness की डिग्री है, लेकिन, इन नमूनों को प्रजनन स्थिति को बदलने और एक भड़काऊ प्रतिक्रिया है कि स्मीयरों की कोशिकाविज्ञान आकलन उलझाना कर सकते हैं बटोर कर सकते हैं इकट्ठा करने में कार्यरत है. यहाँ, हम एक सरल, गैर इनवेसिव प्रोटोकॉल है कि उसकी प्रजनन चक्र बदलने के बिना एक महिला माउस के estrous चक्र के मंच का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन करता है. हम कैसे विस्तार और योनि स्मीयरों में प्रमुख सेल typology के संग्रह और विश्लेषण द्वारा estrous चक्र के चार चरण और हम बताते हैं कि कैसे इन परिवर्तनों endocrine स्थिति के लिए सम्मान के साथ व्याख्या की जा सकती है के बीच अंतर.

Protocol

1. की तैयारी अभिकर्मकों

  1. बाँझ योनि lavage के लिए कमरे के तापमान पर एक कसकर मोहरबंद कंटेनर में दोहरा आसुत (DDH 2 हे) पानी और दुकान आटोक्लेव जरूरत तक.
  2. कोशिकाविज्ञान मूल्यांकन के लिए, DDH 2 ओ की 100 मिलीलीटर क्रिस्टल बैंगनी पाउडर के 0.1 ग्राम जोड़ने अच्छी तरह से मिलाएं. क्रिस्टल बैंगनी दाग ​​(0.1%) कमरे के तापमान पर एक कसकर मोहरबंद कंटेनर में संग्रहित किया जा सकता है जब तक की जरूरत है.

2. एकत्रित योनि कोशिकाओं (योनि Lavage)

  1. एक बाँझ 200 μl टिप के अंत पर एक लाटेकस बल्ब प्लेस और बाँझ DDH 2 हे नोक पर एक दिशानिर्देश के रूप में मात्रा gradations का उपयोग करने के लगभग 100 μl आकर्षित.
  2. लिफ्ट उसे पिंजरे के बाहर माउस और पिंजरे कूदनेवाला (ढक्कन) पर उसे उसे आप की ओर हिंद / पीछे के अंत के साथ जगह है.
  3. मजबूती पूंछ समझ और रियर अंत तरक्की. माउस अब केवल उसके सामने कूदनेवाला लोभी पंजे होगा. इस बिंदु पर माउस पेशाब कर सकते. यदि ऐसा है तो, पेशाब बंद हो जाता है जब तक प्रतीक्षा की. वहाँ योनि नहर के लिए प्रवेश द्वार पर छोड़ दिया मूत्र होना चाहिए, आप अतिरिक्त DDH 2 हे के साथ खोलने कुल्ला एक अलग टिप (यानी, नहीं अपने नमूना संग्रह टिप) का उपयोग करना चाहते हो सकता है.
  4. योनि योनि उत्तेजना (और गर्भाशय ग्रीवा) 1,2 चूहों में pseudopregnancy पैदा कर सकते हैं के रूप में घुसना करने के लिए नहीं छिद्र ख्याल रख रही नहर के उद्घाटन के अवसर पर DDH 2 हे भरा टिप के अंत रखें. हाल की रिपोर्ट का सुझाव है कि चूहों इस प्रभाव को कम करने के लिए अतिसंवेदनशील फिर भी देखभाल दोहराया 3 विश्लेषण में invasiveness की डिग्री कम से कम करने के लिए लिया जाना चाहिए.
  5. धीरे बल्ब दबाना योनि नहर के उद्घाटन के अवसर पर पानी की मात्रा (~ 25-50 μl) के आधे से 1/4 निष्कासित. तरल अनायास टिप प्रविष्टि के बिना नहर में aspirate जाएगा. धीरे धीरे बल्ब पर दबाव जारी है. द्रव वापस टिप में वापस ले लेंगे. दबाव को रिहा भी जल्दी से बचने के लिए तरल पदार्थ की आकांक्षा को रोकने केबल्ब में. फ़िल्टर टिप इस उद्देश्य के लिए उपयोगी हो सकता है.
  6. पिछले चरण 4-5 उसी टिप, बल्ब, और तरल पदार्थ का उपयोग करने के लिए एक नमूना में कोशिकाओं का एक पर्याप्त संख्या में प्राप्त बार दोहराएँ.
  7. गिलास स्लाइड पर तरल पदार्थ प्लेस, और धब्बा पूरी तरह से कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति. सूखी एक बार, इन estrous स्मीयरों तुरंत कलंकित किया जा सकता है या में जमा हो जाती है और एक बाद की तारीख में सना हुआ है.

3. कोशिकाविज्ञान क्रिस्टल वायलेट का उपयोग कर धुंधला 4 *

  1. एक coplin जार (या अन्य तुलनीय धुंधला हो पोत) में सूखी स्लाइड युक्त क्रिस्टल बैंगनी 1 मिनट के लिए दाग रखें.
  2. एक 2 coplin DDH 2 ओ युक्त जार निकालें 1 मिनट के लिए DDH 2 हे के साथ स्लाइड से धो लें. दोहराएँ.
  3. एक ऊतक प्रकाश कर्तव्य वाइपर के साथ स्लाइड के किनारों से निकालें अतिरिक्त DDH 2 हे, दाग धब्बा के साथ संपर्क से बचने.
  4. पिपेट धब्बा और कवर के शीर्ष पर ग्लिसरॉल के लगभग 15 μlपर्ची. वैकल्पिक रूप से, अन्य histological बढ़ते अभिकर्मकों के लिए एक अधिक स्थायी, गैर diffusing दाग प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

* धुंधला हो जाना यहाँ वर्णित विधि सरल प्रक्रिया है कि किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है. अन्य पद्धतियों के अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, Papanicolaou धुंधला हो जाना का उपयोग करते हुए, nucleated उपकला कोशिकाओं की परिपक्वता कम परिपक्व दाग फ़िरोज़ा और अधिक परिपक्व कोशिकाओं गुलाबी या नारंगी दाग ​​के साथ प्रतिष्ठित किया जा सकता है. इन मतभेदों को जल्दी या देर से proestrus मंच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 4.

4. योनि कोशिका विज्ञान

  1. प्रकाश सेल प्रकार वर्तमान निर्धारित माइक्रोस्कोपी के तहत स्मीयर जांच करते हैं. अन्वीक्षण धुंधला के रूप में क्रिस्टल बैंगनी कोशिकाओं से समय पर विसरित जब coverslipping लिए ग्लिसरॉल उपयोग किया जाएगा के बाद तुरंत किया जाना चाहिए. कोशिका विज्ञान दस्तावेज़ photomicrographs के विश्लेषण के समय पर लिया जाना चाहिए.
  2. Entir का परीक्षण करके शुरूएक कम बढ़ाई ई धब्बा. एक प्रतिनिधि क्षेत्र का चयन करें और एक उच्च वृद्धि के लिए कदम. आप शल्कित स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं, leukocytes, और / या nucleated उपकला कोशिकाओं (प्रतिनिधि परिणाम, चित्रा 1A-C) देखेंगे. मौजूद कोशिकाओं के अनुपात नमूना संग्रह के समय (प्रतिनिधि परिणाम, चित्रा 1D - जी) और उसे तत्काल हार्मोन स्थिति (चर्चा, चित्रा 2) आप अपने माउस के estrous चरण निर्धारित करने की अनुमति देगा.

5. प्रतिनिधि परिणाम

कोशिका विज्ञान: तीन प्राथमिक सेल प्रकार योनि धब्बा नमूनों में पाया जा सकता है: (1) nucleated उपकला कोशिकाओं (चित्रा 1 ए), (2) स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) और (3) (चित्रा 1C) leukocytes शल्कित. Nucleated उपकला कोशिकाओं एक हल्के दाग cytoplasm, गहरा दाग प्लाज्मा झिल्ली, और एक अंडाकार नाभिक है ( (चित्रा 1 बी) की कमी है. Polymorphonuclear leukocytes अपने अनियमित आकार, अंधेरे में दाग बहुरूपी नाभिक, और छोटे आकार (चित्रा 1C, काला तीर) द्वारा उपकला कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. मूत्र संदूषण धब्बा में मौजूद होना चाहिए, यूरिक एसिड क्रिस्टल अपने क्रिस्टलीय किसी भी उम्मीद सेल प्रकार (3 चित्रा) से भिन्न संरचनाओं द्वारा आसानी से पाया जाता है. यह घटित चाहिए, और प्रमुख कोशिका प्रकार के अस्पष्ट पता लगाने, धब्बा और त्याग किया जाना चाहिए प्रयोजनों के मंचन के लिए नहीं इस्तेमाल किया.

मचान: सेल स्मीयरों में मनाया प्रकार के रिश्तेदार अनुपात नमूना संग्रह के दिन (चित्रा 1D - जी) पर अपने माउस के estrous चक्र के मंच की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Proestrus दौरान कोशिकाओं लगभग विशेष रूप से कर रहे हैंदौर के समूहों, अच्छी तरह से बनाई उपकला कोशिकाओं (चित्रा 1D, प्रतिनिधि सफेद तीर द्वारा संकेत सेल) nucleated. मद के दौरान कोशिकाओं मुख्य रूप से स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं, घनी पैक समूहों में मौजूद है (चित्रा 1E, प्रतिनिधि arrowhead द्वारा संकेत सेल) शल्कित कर रहे हैं. Metestrus के दौरान, छोटे अंधेरे में दाग leukocytes प्रबल (चित्रा 1F, प्रतिनिधि काला तीर के संकेत सेल). शल्कित स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं टुकड़े, (चित्रा 1F, प्रतिनिधि काला arrowhead इंगित सेल) में अक्सर देखा जा सकता है. दौरान diestrus, दुर्लभ श्रृंगित स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं अभी भी मौजूद हो सकता है (चित्रा 1g, प्रतिनिधि काला arrowhead इंगित सेल) हो सकता है, लेकिन अभी भी leukocytes प्रबल (चित्रा 1G, प्रतिनिधि काला तीर के संकेत सेल). Nucleated diestrus में उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति (द्वारा diestrus से Metestrus प्रतिष्ठित किया जा सकता है g> चित्रा 1G, प्रतिनिधि सेल सफेद तीर द्वारा इंगित).

चित्रा 1
चित्रा 1. योनि स्मीयरों की कोशिकाविज्ञान मूल्यांकन estrous चरण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है तीन मुख्य प्रकार के सेल योनि धब्बा नमूनों में पाया: (ए) nucleated उपकला कोशिकाओं, (बी) श्रृंगित स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं, और (सी) leukocytes. इन सेल धब्बा में मौजूद प्रकार के अनुपात में (डी) proestrus, (ई) मद, (एफ) metestrus, या (G) diestrus प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित चूहों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ई, एफ और जी बिंदु में काले arrowheads प्रतिनिधि श्रृंगित स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं को. प्रतिनिधि leykocytes सी एफ और जी बिंदु में काला तीर. डी और जी को उजागर प्रतिनिधि में व्हाइट तीर उपकला कोशिकाओं nucleated.

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चित्रा 2. योनि धब्बा कोशिका विज्ञान अंतर्निहित endocrine घटनाओं को दर्शाता विवरण भी चर्चा में प्रदान की जाती हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. यूरिक एसिड क्रिस्टल मूत्र दूषित नमूनों की निम्नलिखित क्रिस्टल बैंगनी धुंधला हो जाना हो सकता है (ए) क्रिस्टल पारदर्शी हैं और विभिन्न आकारों (तीर और बॉक्सिंग क्षेत्र (बी) में बढ़ाया) हो सकता है हो सकता है. कोई कोशिकाओं को इस क्षेत्र में मौजूद हैं. क्षेत्र में यूरिक एसिड क्रिस्टल संदूषण कोशिकाविज्ञान धुंधला के लिए इस्तेमाल मौजूद होना चाहिए, यह कठिन हो करने के लिए सही सेल प्रकार वर्तमान और धब्बा खारिज किया जाना चाहिए की पहचान हो सकती है. स्केल सलाखों = 50 सुक्ष्ममापी.

Discussion

सेल typology में इन परिवर्तन अंतर्निहित endocrine घटनाओं की ओर संकेत कर रहे हैं. estrous चक्र के proestrus चरण मासिक धर्म चक्र के 5 मानव कूपिक चरण से मेल खाती है और 17 β-estradiol स्तर 6 परिसंचारी में एक पूर्व ovulatory वृद्धि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 7 प्रोलैक्टिन में एक छोटे से वृद्धि (2 चित्रा द्वारा परिभाषित किया गया है, Proestrus, बाएं पैनल). 17 β-estradiol में वृद्धि परोक्ष रूप से उत्तेजित करता है gonadotropin हार्मोन hypothalamus और पट में न्यूरॉन्स (2 चित्रा कि, बारी में, पूर्वकाल पिट्यूटरी में उत्तरदायी कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए 8,9 संचलन में luteinizing हार्मोन और कूप - उत्तेजक हार्मोन जारी रिहा Proestrus, बाएं पैनल). योनि proestrus में जानवरों से लिया स्मीयरों, कोशिकाओं लगभग विशेष रूप से अंडाकार nucleated उपकला कोशिकाओं (चित्रा 1D, चित्रा 2, Proestrus, सही पैनल) कर रहे हैं. कूप उत्तेजक horm में शिखरएक के स्तर संकेतों और 10,11 कामोंमाद में ovulation प्रविष्टि. प्रेरणा के दौरान, 17 β-estradiol गिरावट और प्रोलैक्टिन स्तर 6,7 शिखर स्तर (2 चित्रा, मद, बाएं पैनल). योनि स्मीयरों अनियमित आकार श्रृंगित clumps में स्क्वैमस उपकला अक्सर कोशिकाओं (चित्रा 1E, चित्रा 2, मद, सही पैनल) के लगभग अनन्य का पता लगाने के द्वारा विशेषता है. में प्रवेश metestrus प्रोजेस्टेरोन हार्मोन 6 के स्तर में निरंतर वृद्धि के साथ मेल खाता है और मानव luteal चरण 12 (2 चित्रा, Metestrus, बाएं पैनल) की शुरुआत करने के लिए मेल खाती है. के रूप में प्रोजेस्टेरोन स्तर में बढ़ोतरी शुरू और कोष luteum 6,13,14 सक्रियण (2 चित्रा, Metestrus, बाएं पैनल) जवाब में 17 β-estradiol के स्तर में वृद्धि है. सेल इस चरण के दौरान योनि स्मीयरों में मौजूद प्रकार खंडित, श्रृंगित उपकला कोशिकाओं और छोटे गहरा दाग leukocytes (Figurई 1F, चित्रा 2, Metestrus, सही पैनल). अंत में, चूहों में diestrus में प्रवेश होता है और प्रोजेस्टेरोन स्तर शिखर 6, मानव देर luteal चरण 12 करने के लिए इसी परिसंचारी. पीत - पिण्ड के प्रतिगमन प्रोजेस्टेरोन 15,16 के स्तर में एक बाद में तेज गिरावट (2 चित्रा, Diestrus, बाएं पैनल) की ओर जाता है. Leukocytes diestrus दौरान स्मीयरों में प्रबल होना. श्रृंगित उपकला कोशिकाओं की आवृत्ति कम है और nucleated उपकला कोशिकाओं को बस से proestrus (चित्रा 1g, चित्रा 2, Diestrus, सही पैनल) संक्रमण के लिए पहले से पता लगाया जा शुरू.

संक्षेप में, यह सरल, सामान्य प्रोटोकॉल करने के लिए दैनिक हार्मोनल उतार चढ़ाव का अनुमान है और प्रजनन स्थिति फेरबदल यदि निम्न सावधानियां बरती हैं बिना प्रयोगात्मक चूहों में estrous मंच स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नमूना एक बार दैनिक गैर इनवेसिव प्रोटोकॉल desc का उपयोग कर से अधिक नहीं किया जाना चाहिएयहाँ ribed योनि नहर, आकांक्षा, और आंदोलन के बार - बार प्रवेश करने के लिए तुलना में. एक भड़काऊ प्रतिक्रिया leukocytes और अन्य प्रकार की कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप 17 स्मीयरों कि कोशिकाविज्ञान मूल्यांकन उलझाना सकता में उपस्थित होने में जिसके परिणामस्वरूप इस योनि जलन पैदा कर सकते हैं. इसके अलावा, कॉलोनी रखे महिलाओं में भी, यह सामान्य है 18 anestrous के अच्छी तरह से शामिल है और इस पहचान प्रजनन, लिंग में हार्मोनल प्रभाव की व्याख्या करने में उपयोगी है, और रोग के अध्ययन के रूप में अलग चूहों में विस्तारित diestrus और कामोंमाद चरणों को देखने के लिए. चक्र लंबाई में परिवर्तनशीलता भी उम्र के साथ और कालोनियों के भीतर आवास 7,19-21 महिलाओं के मतभेद (व्यक्ति या समूह आवास) द्वारा शुरू की है. केवल महिला कालोनियों में रखे महिलाओं साइकिल चालन के संघर्ष और हालांकि साइकिल चालन पुरुष 24,25 साइकिल चालन के प्रकाश में लाना मूत्र साथ pretreated पिंजरों से संपर्क किया जा सकता है द्वारा फिर से instated लंबे समय तक diestrus 18,22,23 के एक राज्य में प्रवेश कर सकते हैं. इस प्रकार, individua स्थापित करने के लिएमैं एक भी माउस के लिए चक्र लंबाई, यह सिफारिश की है कि गैर इनवेसिव आकलन यहाँ वर्णित दैनिक प्रदर्शन किया जा, देखभाल के साथ, जब तक दो पूरा चक्र मनाया जाता है.

Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा. जानवरों पर सभी प्रयोगों ओटावा पशु की देखभाल समिति के विश्वविद्यालय और पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के साथ सख्त अनुसार में प्रदर्शन किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 200 μl pipette tips Diamed E340901
Latex bulb (1 ml) Fisher 03-488-21
Glass microscope slides Fisher 12-550-15
Crystal Violet stain (25 g) Fisher C581-25
Light-duty Tissue Wipers VWR 82003-820
Glycerol Fisher BP229-1
Microscope Cover Glass (22x30) Fisher 12-544A

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References

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McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389, doi:10.3791/4389 (2012).More

McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389, doi:10.3791/4389 (2012).

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