Summary
Aqui, descrevemos como identificar o estágio da reprodução murino (proestro, estro, metaestro ou diestro) pelo simples, a coleta não-invasiva e avaliação citológica de amostras de esfregaço vaginal. Iremos descrever como citologia vaginal reflete níveis circulantes hormonais subjacentes transição durante o ciclo reprodutivo murino.
Abstract
Um meio rápido de avaliação do estado reprodutivo em roedores é útil não só para o estudo da disfunção reprodutiva, mas também é necessário para a produção de novos modelos de rato de doença e investigações sobre a regulação hormonal da degeneração do tecido (ou regeneração) após desafio patológico. O ciclo reprodutivo murino (ou estro) é dividido em quatro fases: proestro, estro, metaestro e diestro. Flutuações definidas em níveis circulantes de esteróides ovarianos 17-β-estradiol e de progesterona, as gonadotrofinas luteinizante e folículo hormonas estimulantes, e a transição do sinal de luteotrópico hormona prolactina através destes estágios reprodutivos. Alterações na tipologia de células dentro do canal vaginal murina refletir esses eventos endócrinas subjacentes. Avaliação diária do índice relativo de nucleadas células epiteliais, células epiteliais escamosas cornificadas e leucócitos presentes em esfregaços vaginais podem ser usados para identificar estral murinofases. O grau de invasão, no entanto, empregado na coleta destas amostras pode alterar status reprodutivo e induzir uma resposta inflamatória que pode confundir avaliação citológica de esfregaços. Aqui, nós descrevemos um método simples, não invasivo protocolo que pode ser usado para determinar a fase do ciclo estral de um rato fêmea, sem alterar o seu ciclo reprodutivo. Nós detalhe como diferenciar entre os quatro estágios do ciclo estral pela coleta e análise de tipologia predominante de células em esfregaços vaginais e que mostram como estas alterações podem ser interpretados com respeito ao status endócrino.
Protocol
1. Reagentes Preparando
- Para lavagem vaginal estéril, autoclave água bidestilada (DDH 2 O) e guarde em um recipiente hermeticamente fechado em temperatura ambiente até ser necessário.
- Para a avaliação citológica, adicionar 0,1 g de pó de cristal violeta a 100 ml de DDQ 2 O. Misturar bem. O violeta de cristal mancha (0,1%) pode ser armazenado em um recipiente hermeticamente fechado à temperatura ambiente até ser necessário.
2. Coleta de células vaginais (lavagem vaginal)
- Colocar uma lâmpada de látex na extremidade de uma ponta de 200 ul estéril e elaborar a cerca de 100 ul de H2O estéril DDH usando as gradações na ponta como uma orientação volume.
- Levante o mouse para fora da sua gaiola e colocá-la no funil gaiola (tampa) com sua extremidade traseira / trás para você.
- Segure firmemente a cauda e elevar a extremidade traseira. O rato terá agora apenas as patas dianteiras agarrar a caçamba. Neste ponto, o mouse pode urinar. Se assim, Espere até parar de urinar. Caso haja urina deixados na entrada do canal vaginal, você pode querer lavar a abertura com excesso de DDH 2 O, utilizando uma ponta separado (ou seja, não a ponta coleta).
- Coloque a extremidade da ponta 2 DDH O-cheia na abertura do canal vaginal tendo o cuidado de não penetrar o orifício de estimulação (e cervical) pode induzir a pseudogravidez vaginal em ratos 1,2. Relatos recentes sugerem ratos são menos susceptíveis a este efeito, no entanto deve ser tomado cuidado para minimizar o grau de invasão em análises repetidas 3.
- Pressione levemente o bulbo de expulsão de um quarto a metade do volume de água (~ ul 25-50) na abertura do canal vaginal. O líquido vai-se espontaneamente aspirar para dentro do canal de inserção sem ponta. Libertam lentamente a pressão exercida sobre a lâmpada. O fluido vai retirar de volta para a ponta. Evitar a libertação demasiado rápida da pressão para evitar a aspiração de fluidono bulbo. Uma ponta filtrado podem ser úteis para esta finalidade.
- Repetir os passos anteriores 4-5 vezes usando a mesma ponta, bulbo, e fluido para se obter um número suficiente de células de uma única amostra.
- Colocar o fluido em lâmina de vidro, e permitir que o esfregaço para secar completamente à temperatura ambiente. Depois de seco, estas manchas estral podem ser corados imediatamente ou armazenadas e coradas numa data posterior.
3. Citologia usando Cristal Violeta * 4
- Colocar a lâmina seca em um frasco Coplin (ou outro recipiente de coloração comparáveis) contendo a mancha violeta de cristal durante 1 min.
- Remover para um frasco contendo Coplin segundo DDH 2 O. Lava-se a lâmina com DDQ 2 O durante 1 min. Repetir.
- Retire o excesso de DDH 2 O a partir das bordas da lâmina com um limpador de tecido light-duty, evitando o contato com o esfregaço corado.
- Pipetar cerca de 15 ul de glicerol no topo da tampa e esfregaçoescorregar. Alternativamente, outros reagentes histológicos de montagem podem ser utilizados para se obter uma forma mais permanente, não-difusora mancha.
* O método de coloração descrito aqui é o procedimento mais simples que pode ser realizado em qualquer laboratório. Outros métodos podem fornecer detalhes adicionais. Por exemplo, usando a coloração de Papanicolaou, a maturidade de células epiteliais nucleadas podem ser distinguidos com células menos maduras manchadas de azul-turquesa e células mais maduras rosa ou laranja-manchadas. Estas diferenças podem ser usados para a fase precoce ou tardia de proestro. 4
4. Citologia vaginal
- Examinar o esfregaço sob microscopia de luz para determinar os tipos de células presentes. Exame microscópico deve ser feito imediatamente após a coloração violeta como o cristal irá difundir a partir de células ao longo do tempo quando se utiliza o glicerol para lamínulas. As fotomicrografias devem ser tomadas no momento da análise para documentar a citologia.
- Comece examinando a entiresfregaço e em uma menor ampliação. Selecione uma área representativa e passar para uma maior ampliação. Irá ver cornificado células epiteliais escamosas, leucócitos e / ou nucleadas células epiteliais (resultados representativos, Figura 1A-C). A proporção de células presente lhe permitirá determinar a fase do cio de seu mouse no momento da coleta da amostra (resultados representativos, Figura 1D-G) e seu status de imediato hormonal (discussão, Figura 2).
5. Resultados representativos
Cytology: Três tipos de células primárias podem ser detectadas em amostras de esfregaço vaginal: (1) nucleadas células epiteliais (Figura 1A), (2) cornificado células epiteliais escamosas (Figura 1B), e (3) os leucócitos (Figura 1C). Nucleadas células epiteliais têm citoplasma levemente manchado, mais escuro membrana plasmática manchado, e um núcleo oval (
Estadiamento: A proporção relativa dos tipos celulares nos esfregaços podem ser usados para identificar a fase do ciclo estral o rato no dia da colheita da amostra (Figura 1D-G). Durante proestro, as células são quase exclusivamenteaglomerados de redondo, bem formado nucleadas células epiteliais (Figura 1D, a célula representativa indicado pela seta branca). Durante o estro, as células são predominantemente cornificado células epiteliais escamosas, presentes em aglomerados densos (Figura 1E, a célula representativa indicada pela seta). Durante metaestro, pequenas leucócitos darkly coradas predominam (Figura 1F, célula representativa indicada pela seta preta). Cornified células epiteliais escamosas podem ser observadas, muitas vezes, em fragmentos (Figura 1F, célula representativa indicada pela seta preta). Durante diestro, raras cornificadas células epiteliais escamosas podem ainda estar presentes (Figura 1G, célula representativa indicada pela seta preta), mas ainda predominam leucócitos (Figura 1G, célula representativa indicada pela seta preta). Metaestro pode ser distinguido do diestro pelo aparecimento de nucleadas células epiteliais em diestro (
Figura 1. Avaliação citológica de esfregaços vaginais podem ser usados para identificar fase estro três principais tipos de células são detectados em amostras de esfregaço vaginal:. (A) nucleadas células epiteliais, (B) cornificadas células epiteliais escamosas, e (C) os leucócitos. A razão entre estes tipos de células presentes na mancha pode ser utilizado para identificar ratinhos em (D) proestro, (E) do estro, (F) metaestro, ou (G), tal como descrito em diestro resultados representativos. Setas pretas em E, F e ponto G ao representante cornified células epiteliais escamosas. Setas pretas em C, F e G a ponto leykocytes representativas. Setas brancas em D e G representante destaque nucleados células epiteliais.
. Jpg "alt =" Figura 2 "/>
Figura 2. Citologia oncótica vaginal reflete eventos endócrinas subjacentes. Detalhes também são fornecidos em Discussão. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Cristais de ácido úrico pode estar coloração com violeta de cristal presentes seguinte de urina contaminadas amostras. (A) Os cristais são transparentes e podem ser de vários tamanhos (setas e região boxed ampliadas em (B)). Sem as células estão presentes nesta área. Deve contaminação cristais de ácido úrico nos campos usados para a coloração citológica estar presente, pode ser difícil de identificar com precisão os tipos de células presentes no esfregaço e deve ser descartada. Barra de escala = 50 um.
Discussion
Estas mudanças na tipologia das células são indicativos de eventos endócrinas subjacentes. A fase de proestro do ciclo estral corresponde à fase folicular humano do ciclo menstrual, 5 e é definida por um aumento pré-ovulatório, em circulação de 17 β-estradiol níveis 6, bem como uma pequena onda de prolactina 7 (Figura 2, proestro, painel esquerdo). O aumento em 17-β-estradiol estimula indirectamente gonadotropina libertadora de hormona de neurônios no hipotálamo e septo que, por sua vez, activam as células que respondem na pituitária anterior para libertar a hormona luteinizante e hormona folículo-estimulante para a circulação 8,9 (Figura 2 , proestro, painel esquerdo). Em esfregaços vaginais colhidas dos animais em proestro, as células são quase exclusivamente ovais nucleadas células epiteliais (Figura 1D, a Figura 2, proestro, painel direito). O pico de folículo estimulante-Hormum nível ovulação sinais e entrada em estro 10,11. Durante o estro, 17-β-estradiol níveis declínio dos níveis de prolactina e de pico 6,7 (Figura 2, o estro, painel esquerdo). Esfregaços vaginais são caracterizadas por detecção quase exclusiva de formato irregular cornificadas células epiteliais escamosas, muitas vezes em tufos (Figura 1E, a Figura 2, o estro, painel direito). Entrada em metaestro coincide com um aumento contínuo nos níveis de progesterona de 6 e corresponde ao início da fase luteal humano 12 (Figura 2, metaestro, painel esquerdo). Como os níveis de progesterona começam a subir e existe uma pequena onda de 17-β-estradiol em resposta a níveis de corpus luteum activação 6,13,14 (Figura 2, metaestro, painel esquerdo). Os tipos de células presentes no esfregaço vaginal durante esta fase são fragmentados, cornified células epiteliais e leucócitos menores escuras manchadas (Figure 1F, Figura 2, metaestro, painel direito). Finalmente, a entrada em diestro ocorre em ratinhos e os níveis de progesterona em circulação pico 6, que corresponde à fase lútea tardia humano 12. Regressão do corpo lúteo leva a um declínio acentuado subsequente dos níveis de progesterona 15,16 (Figura 2, diestro, painel esquerdo). Leucócitos predominam nos esfregaços durante diestro. A frequência de células epiteliais cornificadas e nucleadas é reduzida das células epiteliais começam a ser detectada imediatamente antes da transição para o proestro (Figura 1G, a figura 2, diestro, painel direito).
Em resumo, este protocolo simples de rotina podem ser utilizados para estimar variações hormonais diárias e estabelecer fase estro em ratos experimentais sem alterar estado reprodutivo se as seguintes precauções sejam tomadas. A amostragem deve ser efectuada mais do que uma vez por dia utilizando o não-invasivo protocolo described aqui, em comparação com a penetração repetida do canal vaginal, aspiração, e agitação. Isto pode causar uma irritação vaginal resultando numa resposta inflamatória que resulta 17 em leucócitos e outros tipos de células de estar presentes em esfregaços que podem confundir a avaliação citológica. Além disso, mesmo na colônia alojados fêmeas, é normal ver diestro longos e estágios de estro em camundongos diferentes como a indução bem, de 18 de anestro e essa identificação é útil na interpretação do impacto hormonal reprodutiva, gênero e estudos de doenças. Variabilidade na duração do ciclo também é introduzido com a idade e por diferenças de habitação dentro de colônias (indivíduo ou grupo habitação) de fêmeas 7,19-21. Fêmeas alojadas no feminino somente colônias pode deixar de bicicleta e entrar em um estado de diestro prolongado 18,22,23 embora o ciclismo pode ser restabelecida pela exposição ao gaiolas pré-tratadas com urina masculina para provocar ciclismo 24,25. Assim, para estabelecer individual comprimentos de ciclo para um dado rato, recomenda-se que as avaliações não invasivas descritas aqui ser realizado diariamente, com cuidado, até dois ciclos completos são observados.
Disclosures
Os autores declaram que não há conflito de interesse. Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade de Ottawa Animal Care e do Comitê Canadian Council on Animal Care.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Marc Leonard de Carleton Immersive Media Studio para assistência técnica especializada em produção de vídeo e edição e Immersive Dr. Martin Bertrand de Carleton Media Laboratory Regeneração Estúdio / Neural de assistência modelo visual. Os autores agradecem os pareceres dos peritos do Dr. Marilyn Keaney e toda a sua equipe dedicada na Universidade de Ottawa Animal Care e Serviços Veterinários. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR, MOP 62.826) para SALB, o Instituto CIHR de Envelhecimento e Iniciativa Formação Estratégica em Pesquisa em Saúde / Programa de Formação de CIHR em lipidómica Neurodegenerativas (96.121 TGF) para SALB e SF, Fundação Canadense Para que a inovação SF, Ontário Inovação Trust para SF e Investigação da Autodesk para a SF. ACM recebe um Banting e Best CIHR prêmio de doutorado. NV recebe uma bolsa de pós-profissional do Instituto de Envelhecimento e Programa de Treinamento em CIHR lipidómica Neurodegenerativas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile 200 μl pipette tips | Diamed | E340901 | |
| Latex bulb (1 ml) | Fisher | 03-488-21 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Crystal Violet stain (25 g) | Fisher | C581-25 | |
| Light-duty Tissue Wipers | VWR | 82003-820 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| Microscope Cover Glass (22x30) | Fisher | 12-544A |
References
- Adler, N. T., Zoloth, S. R. Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats. Science. 168, 1480-1482 (1970).
- Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation. Physiology. 5, 1003-1007 (1970).
- Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse. Journal of. 21, 30-39 (2009).
- Hong, H. Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer. Cancer research. 70, 221-228 (2010).
- Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. The menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).
- Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone. Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).
- Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle. Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).
- Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats. Nature. 264, 461-463 (1976).
- Rajendren, G., Gibson, M. J. A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen. Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).
- Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature. 15, 201-204 (1997).
- Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice. Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).
- Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. The normal menstrual cycle in women. Animal reproduction science. , 124-229 (2011).
- Appelgren, L. E. Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis. Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).
- Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice. Reproduction. 138, 571-579 (2009).
- Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).
- Rudolph, M. Induction of overt menstruation in intact mice. PLoS One. 7, e32922 (2012).
- Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).
- Whitten, W. K. Occurrence of anoestrus in mice caged in groups. The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).
- Lamond, D. R. Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice. The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).
- Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification. Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).
- Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).
- Armaiz-Pena, G. N. Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).
- Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).
