Integrato oftalmoscopia fotoacustico e Spectral-dominio Optical Coherence Tomography

Summary

Fotoacustica oftalmologia (PAOM), un assorbimento ottico basato modalità di imaging, fornisce la valutazione complementare della retina alle tecnologie attualmente disponibili oftalmici imaging. Riportiamo l'utilizzo di PAOM integrato con-dominio spettrale tomografia a coerenza ottica (SD-OCT) per il controllo simultaneo di imaging multimodale retinica nel ratto.

Abstract

Sia la diagnosi clinica e di indagine fondamentale delle malattie oculari gravi trarre grandi vantaggi dalle tecnologie oftalmiche varie non invasive di imaging. Gli attuali modalità di imaging della retina, come la fotografia del fondo oculare ^1, oftalmoscopia scansione laser confocale (cSLO) ^2, e la tomografia a coerenza ottica (OCT) ^3, hanno contribuito in modo significativo nel monitoraggio insorgenze della malattia e progressioni, e lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, essi prevalentemente affidamento sulle back-fotoni riflessi dalla retina. Di conseguenza, le proprietà di assorbimento ottico della retina, che sono di solito fortemente associati con lo stato fisiopatologia retinica, sono accessibili dalle tecnologie di imaging tradizionali.

Oftalmoscopia fotoacustica (PAOM) è una modalità emergente imaging della retina che permette di rilevare i contrasti di assorbimento ottico nell'occhio con una sensibilità elevata ^4-7. In PAOM nanimpulsi laser osecond vengono forniti attraverso la pupilla e la scansione attraverso l'occhio posteriore per indurre fotoacustica (PA), i segnali che vengono rilevati da un trasduttore ad ultrasuoni non a fuoco attaccato alla palpebra. A causa del forte assorbimento ottico di emoglobina e melanina, PAOM è in grado di non-invasivo imaging delle vasculatures retina e della coroide, e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) melanina ad alto contrasto ^6,7. Ancora più importante, basato sul ben sviluppato spettroscopica di imaging fotoacustica ^5,8, PAOM ha il potenziale per mappare la saturazione di ossigeno dell'emoglobina in vasi retinici, che può essere critica nello studio della fisiologia e patologia delle diverse malattie cecità ⁹ come la retinopatia diabetica e neovascolare legata all'età degenerazione maculare.

Inoltre, essendo l'unico esistente assorbimento ottico-oftalmico a base di modalità di imaging, PAOM può essere integrato con consolidata clinica oftalmica Imaging techniques per ottenere valutazioni anatomiche e funzionali più complete degli occhi in base a molteplici contrasti optical ^6,10. In questo lavoro, integriamo PAOM e spettrali nel dominio OCT (SD-OCT) per la realizzazione contemporanea in vivo imaging della retina di ratto, in cui si rivelano sia assorbimento ottico e proprietà di diffusione della retina. La configurazione del sistema, l'allineamento del sistema di acquisizione e di imaging sono presentati.

Protocol

1. Configurazione di sistema

1. PAOM sottosistema
   1. Illuminazione fonte: un laser Nd: YAG (SPOT-10-100, Elforlight Ltd, Regno Unito: 20 μJ / impulso, 2 nsec durata dell'impulso, 30 kHz frequenza cardiaca massima di ripetizione).
   2. L'uscita laser a 1064 nm è a frequenza doppia di 532 nm da una beta-bario-borato (BBO) cristallo (CasTech, San Jose, CA). Dopo un'ulteriore suddivisione da uno specchio linea laser, luce 532 nm viene erogata attraverso una modalità singola fibra ottica (P1-460A-FC-5, Thorlabs), e 1064 nm laser viene registrato da un fotodiodo (DET10A, Thorlabs), che innesca PA acquisizione del segnale.
   3. La luce laser proveniente dalla modalità singola fibra ottica viene erogata sulla retina da un galvanometro (GM, QS-7, Nutfield Technology) ed una configurazione telescopio (f1 = 75 mm e f2 = 14 mm, Edmund Optics) ^6.
   4. Un trasduttore ago sfocata (40 MHz di frequenza centrale, larghezza di banda di 16 MHz, 0,4 × 0,4 mm ² dimensioni elemento attivo, NIH risorse Center per le tecnologie del trasduttore ad ultrasuoni, la University of Southern California), viene posto a contatto con la palpebra di rilevare i segnali PA generati dalla retina. Gel ultrasuoni (Sonotech) è applicato tra la punta del trasduttore e della palpebra animale per accoppiamento acustico bene.
   5. Il segnale viene amplificato PA da due amplificatori (ZFL-500LN +, Mini-Circuits, e 5073PR, Olympus), e viene digitalizzato da una scheda di acquisizione dati (CS14200, Gage Applicata).
2. SD-OCT sottosistema
   1. Bassa sorgente luminosa coerenza: una banda larga super-luminescente diodo (IPSDD0804, InPhenix; centro lunghezza d'onda: 840 nm, 6-dB larghezza di banda: 50 nm), che determina la risoluzione assiale di 6 micron.
   2. La luce nel vicino infrarosso è diviso per fare riferimento a braccio e braccio del campione da un 50 × 50 su misura single-mode in fibra accoppiatore (Ottica OZ).
   3. Dopo aver combinato con la luce PAOM illuminante da uno specchio caldo (FM02, Thorlabs), braccio del campione ottobre condivide la scansione stessa e la consegna ottica wiPAOM ° ^6.
   4. Una casa costruita spettrometro viene utilizzata per registrare le SD-ottobre segnali di interferenza, in cui una linea di scansione CCD (Aviiva SM2, E2V) permette un tasso di una linea di 24 kHz. Progettazione di spettrometri tipici possono essere trovati da diverse letterature già pubblicati ¹¹ e accoppiato in fibra SD-ottobre spettrometri sono ora disponibili in commercio. L'SD-OTT sensibilità viene misurata per essere migliore di 90 dB.
3. Schema di scansione
   1. Fast 2-D raster scansione del galvanometro è controllato da una scheda di uscita analogica (PCI-6731, National Instruments), che attiva anche la cottura sia PAOM laser e l'acquisizione del segnale di ottobre dello spettrometro. Come risultato, le acquisizioni dati in PAOM e sottosistemi ottobre sono sincronizzati.
   2. L'acquisizione PAOM dati viene attivato da una sequenza di registrazione fotodiodo PAOM laser (vedi 1.1.2).
   3. 3-D immagini volumetriche o 2-D immagini del fondo oculare sono costruiti da 256 B-Scan (256 linee A per BLa scansione immagine).

2. Sistema di allineamento

1. Massimizzare l'efficienza doppia frequenza del cristallo BBO e l'efficienza di accoppiamento della modalità singola fibra ottica. Indossare occhiali LG3 (Thorlabs) per la protezione degli occhi del personale durante l'ottimizzazione della luce PAOM illuminante.
2. Collimare l'uscita laser fibra di PAOM a 2,0 mm di diametro.
3. Allineare le luci di illuminazione combinati di PAOM e SD-OCT per essere coassiale.
4. Impostare la luce PAOM eccitazione a ~ 40 nJ / impulsi e SD-OCT sondaggio luce ~ 0,8 mW, entrambi i quali sono segnalati per essere sicuro per gli occhi ^6,12.

3. Imaging in vivo Multimodale della retina

1. Trasferire il ratto ad una scatola di polipropilene trasparente, e anestetizzare l'animale da una miscela di aria isoflurano (Phoenix farmaceutica, Inc.) e normale ad una concentrazione di 1,5% e una portata di 2,0 litri / min per 10 min.
2. Frena il ratto anestetizzato in un homemade supporto con cinque assi libertà regolabile (Figura 1), e mantenere la sua temperatura corporea a ~ 37 ° C da un cuscinetto riscaldante (Repti Therm, laboratori Zoomed, Inc.). Mantenere l'anestesia per inalazione di gas misto aria isoflurano e normale con 1,0% di concentrazione e 1,5 litri / min portata tutta la durata dell'esperimento.
3. Tagliare la ciglia con un paio di forbici chirurgiche, dilatare le pupille con la soluzione oftalmica Tropicamide 1%, e paralizzare il muscolo sfintere dell'iride utilizzando 0,5% Tetracainum cloridrato soluzione oftalmica. Applicare artificiali gocce strappo (Systane, Alcon Laboratories, Inc.) ad occhio ratto ogni minuto per evitare la disidratazione cornea e formazione di cataratta. Monitorare la frequenza cardiaca degli animali, la respirazione, e l'ossigenazione del sangue da un pulsossimetro (8.600 V, Nonin Medical, MN) durante l'esposizione.
4. Accendere SD-OCT luce che illumina e controllare la luce probe sia accurata al ~ 0,8 mW.
5. Attivare la scansione galvanometro. Allineare la SD-OCT consegna di irradiazione di lucesulla retina di ratto e di identificare la regione retinica di interesse (ROI) regolando cinque assi detentore dell'animale. Qui, il disco ottico viene intenzionalmente collocato nel centro del campo di vista, mentre il ROI deve essere selezionato in base a differenti esigenze di ricerca.
6. Regolare ulteriormente il titolare animale per ottimizzare le SD-ottobre qualità di imaging retinico sezione trasversale in entrambe le direzioni di scansione (per commutare la direzione di scansione raster) finché il miglior fuoco ottico viene raggiunto.
7. Preparare il trasduttore ago su un cinque assi piattaforma regolabile, applicare una goccia di gel ultrasuoni alla punta del trasduttore, e delicatamente contattare la punta del trasduttore al palpebra animale.
8. Impostare laser PAOM al-trigger esterno modalità, avviare la scansione galvanometro, e attivare visualizzazione in tempo reale delle PAOM trasversale immagine della retina animale. Regolare accuratamente l'orientamento del trasduttore finché l'immagine PAOM ha il miglior rapporto segnale-rumore (SNR) e, nel frattempo, mostra un uniformemente distributed modelli ampiezza PA in entrambe le direzioni di scansione.
9. Impostare i parametri di scansione, e condurre l'imaging simultaneo della retina di SD-OCT e PAOM. Ricostruire le immagini tridimensionali di SD-OCT e PAOM off-line. I nostri codici di ricostruzione sono stati scritti in Matlab e la visualizzazione tridimensionale è stato raggiunto uing un freeware (Volview, Kitware). L'algoritmo per SD-OCT ricostruzione può essere trovato in rif. ¹¹ e l'algoritmo per PAOM ricostruzione può essere trovato in rif. ⁶ e Ref.. ^13. Se necessario, ripetere le procedure di 3,7) -3,9).
10. Dopo l'esperimento, spegnere l'SD-OCT luce sondaggio, togliere l'animale dal supporto immediatamente, e tenere in caldo fino a quando non si sveglia in modo naturale. Tenere l'animale in un ambiente buio per un'ora in più per gli occhi per recuperare. L'intera durata sperimentale, compresa l'anestesia animale e di acquisizione di immagini, è inferiore a 30 minuti per un operatore esperto.

Representative Results

La figura 2 mostra le immagini 2-D fundus di SD-OCT e PAOM acquisite simultaneamente in un ratto albino (A e B) e un ratto pigmentato (C e D), rispettivamente. Nelle SD-ottobre le immagini del fondo oculare (figure 2A e 2C), vasi retinici hanno aspetto scuro a causa dell'assorbimento di emoglobina di sondare luce. Oltre a vasi retinici (RV in Figura 2B), PAOM visualizza le vasculatures coroide (CV in Figura 2B) in albino occhio a causa della mancanza di melanina RPE. Poiché occhio pigmentata ha un'alta concentrazione di melanina, PAOM immagini RPE (Figura 2D) con elevato contrasto in aggiunta ai vasi retinici. In tutte le immagini della retina, l'angolo di scansione massimo è 26 gradi e l'acquisizione di immagini prende ~ 2,7 sec. Per dimostrare l'tridimensionale capacità di imaging di PAOM, una resa volumetrica dei dati mostrati in figura 2b è dato in Figure 3.

Figura 1. Fotografia di cinque assi detentore dell'animale. Le frecce 1-5 evidenziano le cinque libertà regolabili e la freccia 6 punti salienti il ​​limitatore animale.

Figura 2. Contemporaneamente acquisito SD-OCT (A e C) e PAOM (B e D) le immagini del fondo oculare. A) e B) sono acquisiti da un ratto albino, e C) e D) sono acquisiti da un ratto pigmentato. RV: retinica nave; CV: nave della coroide; RPE: dell'epitelio pigmentato retinico. Bar: 500 micron.

<strong> Figura 3. visualizzazione volumetrica di PAOM in una retina di ratto albino.

Discussion

Qui, vi presentiamo un istruzioni dettagliate su simultanea in vivo imaging della retina degli occhi di ratto utilizzando PAOM combinato con SD-OCT. Ottico-scattering basata SD-OCT è forse la clinica "gold standard" per imaging della retina ^3, tuttavia, non è sensibile per rilevare l'assorbimento ottico nella retina. Il recente sviluppo PAOM è l'unica ottica di assorbimento a base di modalità di imaging oftalmico che fornisce le proprietà di assorbimento ottico della retina ^6. Poiché l'emoglobina e melanina sono endogenamente forti pigmenti ottici che assorbono, PAOM consente l'inchiesta di anatomia e le funzioni dei vasi della retina / coroide e la RPE senza ricorrere ad altri mezzi di contrasto.

In PAOM, il trasduttore a ultrasuoni ha sfocata una regione limitata sensibilità (~ 2,8 × 2,8 mm ²⁾ per la sua attiva elementi finiti, che provoca una sensibilità decaduto rilevamento di segnali PA verso t ¹⁰egli periferia del campo di vista (FOV). Così, l'angolo di inclinazione del trasduttore deve essere accuratamente regolata per ottenere una omogenea FOV retinica. Una sostituzione potenziale per il trasduttore piezoelettrico tradizionale è di applicare micro-ring risonatore, che ha bassi valori di pressione di rumore equivalente e direttività rilevamento più ampia ^14, che può fornire un'immagine più omogenea retinica con migliore SNR in PAOM. Confronto con SD-OCT, PAOM ha simile risoluzione laterale (~ 20 micron), ma molto peggio risoluzione assiale (~ 23 micron) a causa della larghezza di banda limitata attualmente a ultrasuoni ^6. La risoluzione assiale di PAOM possono potenzialmente essere migliorata impiegando romanzo rivelatore ultrasonico pure. Il metodo di taratura delle risoluzioni PAOM è stato segnalato precedente ^6,15.

In sintesi, l'integrato PAOM e SD-OCT sistema di imaging anatomico offre più completa e valutazione funzionale della retina, e, quindi, contiene grandi promesse inla diagnosi clinica e futuro management di molti disturbi oculari.