Summary
光音響眼科（PAOM）、光吸収ベースのイメージングモダリティは、現在入手可能な眼科イメージング技術に網膜の補完的な評価を提供します。我々は、ラットにおける同時マルチモーダル網膜イメージングのためのスペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（SD-OCT）と統合PAOMの使用を報告している。
Abstract
臨床診断と主要な眼疾患の基本的な調査の両方が大幅に様々な非侵襲的な眼科イメージング技術の恩恵を受ける。このような眼底撮影1、共焦点走査レーザー検眼鏡（cSLO）2、光コヒーレンストモグラフィー（OCT）3などの既存の網膜画像診断法は、病気の発症や進行を監視し、新たな治療戦略の開発に重要な貢献をしています。しかし、彼らは主に網膜から後方反射光子に依存しています。結果として、通常強く網膜病態生理状態に関連付けられている網膜の光吸収特性は、従来のイメージング技術によって、アクセスできません。
光音響眼底検査（PAOM）は、高感度4-7眼の光吸収コントラストの検出を可能に新興網膜イメージングモダリティである。 PAOM NaNにosecondレーザーパルスは瞳孔を介して配信し、まぶたに付着やり場の超音波振動子で検出される光音響（PA）の信号を誘導するために後部眼を横切ってスキャンされます。なぜならヘモグロビンとメラニンの強い光吸収のため、PAOMは、非侵襲的イメージング網膜と脈絡膜の血管系を、高コントラスト6,7における網膜色素上皮（RPE）メラニンが可能です。さらに重要なことは、よく発達した分光光音響イメージング5,8に基づいて、PAOMは、糖尿病性網膜症などのいくつかのまばゆいばかりの病気9の生理学および病理学を研究する際に重要になることができ、網膜血管中のヘモグロビンの酸素飽和度をマッピングするための可能性を秘めていると加齢黄斑変性症新生血管。
また、現存する唯一の光吸収ベース眼科画像診断法であること、PAOMは十分に確立された臨床眼科イメージングTEと統合することができます6,10複数の光のコントラストに基づいて、目のより包括的な解剖学的および機能的な評価を達成するためchniques。そこで本研究では、網膜の両方の光吸収と散乱特性が明らかにされているラットの in vivo網膜イメージングで PAOMと同時に用スペクトラルドメインOCT（SD-OCT）を統合することができます。システム構成、システムのアライメントや画像取得が提示される。
Protocol
1。システム構成
- PAOMサブシステム
- 照明光源：Nd：YAGレーザ（SPOT-10-100、Elforlight株式会社、英国：20μJ/パルス、2 nsecのパルス持続時間、最大30 kHzのパルス繰り返し率）。
- 1064nmで出力レーザは、β-バリウムボレート（BBO）結晶（CasTech、サンノゼ、CA）によって532 nmに周波数を倍になります。レーザラインミラーによってさらに分割した後、532nmの光は、シングルモード光ファイバ（P1-460A-FC-5、Thorlabs）を通じて配信され、1064 nmレーザーがトリガーダイオード（DET10A、Thorlabs）によって記録されPAの信号取得。
- シングルモード光ファイバから出たレーザ光 は、検流計（GM、QS-7、ナットフィールドテクノロジー）と望遠鏡の構成（F1 = 75ミリメートルとf2 = 14ミリメートル、エドモンド·オプティクス）6によって網膜上に配信されます。
- やり場の針トランスデューサ（40 MHzの中心周波数は、16 MHzの帯域幅、0.4×0.4 mm 2の能動素子のサイズ、NIHのリソースCente超音波トランスデューサ·テクノロジーズ、南カリフォルニア大学）のrは網膜から発生するPAの信号を検出するためにまぶたに接触して配置される。超音波ゲル（Sonotech）が良い音響結合のためのトランスデューサチップや動物のまぶたの間に印加される。
- PAの信号が2アンプ（ZFL-500LN +ミニ回路、5073PR、オリンパス）で増幅され、データ収集ボード（CS14200、ゲージはアプライド）によってデジタル化されています。
- SD-OCTサブシステム
- 低コヒーレンス光源：ブロードバンドスーパールミネッセントダイオード（IPSDD0804、InPhenix、中心波長：;：50nmの6 dBの帯域幅840 nm）を6μmの軸方向の分解能を決定する。
- 近赤外光は50でアームとサンプルアームを参照するために分割されている×50カスタマイズしたシングルモードファイバカプラ（オズオプティクス）。
- ホットミラー（FM02、Thorlabs）によってPAOM照明光と結合した後、10月のサンプルアームは同じスキャンと配信光学wiを共有目PAOM 6。
- 自作分光器は、ラインスキャンCCDカメラ（Aviiva SM2、e2v社）は、24 kHzのラインレートを可能に、SD-OCTの干渉信号を記録するために使用されます。典型的な分光器の設計は、いくつかの以前に発行された文献11から発見され、ファイバ結合SD-OCTの分光器は現在市販されていることができます。 SD-OCTの感度は90デシベルよりも良好であることが測定されます。
- スキャニング方式
- 検流計のスキャンを高速で2次元ラスターもPAOMレーザー発射と10月分析計の信号取得の両方をトリガアナログ出力ボード（PCI-6731、ナショナルインスツルメンツ）によって制御されます。結果として、PAOMとOCTサブシステム内のデータの取得が同期されます。
- PAOMデータ取得は、フォトダイオードの記録PAOMレーザーシーケンス（1.1.2を参照）によってトリガされます。
- 3次元体積画像や2次元眼底画像（256×256 B-スキャン画像から構成され、Bごとの行）の画像をスキャンしてください。
2。システムのアライメント
- BBO結晶の周波数逓倍の効率とシングルモード光ファイバの結合効率を最大化します。 PAOM照明光を最適化する際に職員の目の保護のためのLG3ゴーグル（Thorlabs）を着用してください。
- 直径2.0ミリメートルにPAOMのファイバ出力レーザをコリメート。
- 同軸にPAOMとSD-OCTの複合照明光の位置を合わせます。
- 〜0.8 mWで光をプロービング〜40 NJ /パルスと、SD-OCTでPAOM励起光を設定し、どちらも6,12アイセーフであると報告されている。
（3）マルチモーダル生体網膜走査で
- 透明ポリプロピレンボックスにラットを移し、1.5％の濃度と10分間2.0リットル/分の流量で、イソフルランの混合物（フェニックス製薬株式会社）と、通常の空気によって動物を麻酔。
- homemaで麻酔をかけたラットを拘束デ5軸調整可能自由（ 図1）と、加熱パッド（REPTIサーム、ズーム研究所、Inc。）によって〜37℃で、その体温を維持してホルダ。実験を通して1.0％の濃度と1.5リットル/分の流量で混合されたイソフルランと通常の空気の吸入ガスによる麻酔を維持している。
- 、手術用のハサミを使ってまつげをカット1％トロピカミド点眼液で生徒を拡張、0.5％塩酸テトラカイン点眼液を用いた虹彩括約筋の筋肉を麻痺させる。ラットの眼球角膜の脱水と白内障形成を防ぐために他のすべての分に人工涙液滴（Systane、アルコン·ラボラトリーズ社）を適用します。撮像中にパルスオキシメータ（8,600 V、Nonin医療、MN）が動物の心拍数、呼吸、血液酸素化を監視します。
- SD-OCTの照明光をオンにして、〜0.8mWとなるようにプローブ光を確認してください。
- ガルバノスキャンを有効にします。 SD-OCTの照射光の配信を揃えるラットの網膜上に、5軸動物ホルダーを調整することにより、関心領域（ROI）の網膜領域を識別します。 ROIが異なる研究要件に基づいて選択されるべきである間、ここに、視神経乳頭は、意図的に、視野の中心に配置されます。
- さらに最高の光学焦点に到達するまで、両方の走査方向における網膜断面（ラスタ走査方向を切り換えることによって）のSD-OCT画像品質を最適化するために、動物のホルダーを調整します。
- 5軸調整可能なプラットフォーム上で針器を準備し、トランスデューサの先端に超音波ゲルのドロップを適用し、優しく動物まぶたにトランスデューサの先端にお問い合わせください。
- 外部トリガモードにPAOMレーザーを設定し、ガルバノスキャンを開始し、動物の網膜のPAOM断面画像のリアルタイム表示を有効にしてください。 PAOMイメージが最良の信号対雑音比（SNR）を有し、その間に、均等にdistを示すまで、慎重にトランスデューサの向きを調整両方の走査方向におけるributed PAの振幅パターン。
- スキャンパラメータを設定し、SD-OCT及びPAOMの同時網膜イメージングを実施しています。 SD-OCT及びPAOMオフラインの3次元画像を再構成する。当社の再建コードは、Matlabで書かれていましたし、3次元可視化は、フリーウェア（Volview、Kitware）をuing達成された。 SD-OCTの復興のためのアルゴリズム11。文献で 見つけることができ、PAOM再建のためのアルゴリズムは、文献に記載されています。6とRef 13。必要であれば、）-3.9）3.7の手順を繰り返します。
- 実験終了後、SD-OCTプローブ光をオフに直ちにホルダーから動物を削除し、それが自然に目覚めるまで、それを暖かく保つ。回復する目のために余分な時間のために暗い環境で動物を保管してください。動物の麻酔と画像取得を含む全実験期間は、経験豊富なオペレーターのための30分未満です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図2は、SD-OCT及びPAOMの2次元眼底画像はそれぞれ、アルビノラット（A とB）と着色されたラット（CとD）で同時に取得を示しています。 SD-OCT眼底画像（ 図2Aおよび2C）で、網膜血管は、光をプロービングのヘモグロビン吸収に起因する暗い外観を持っている。網膜血管（ 図2BのRV）に加えて、PAOMが原因欠けRPEのメラニンのアルビノの眼の脈絡膜血管系を（ 図2BのCV）を可視化します。着色された目は、高いメラニン濃度、網膜血管に加えて、コントラストの高い画像PAOM RPE（ 図2D）があるため。すべての網膜イメージングでは、最大走査角は26度で、画像取得は、〜2.7秒かかります。 PAOMの三次元イメージング能力を実証するために、 図2bに示すように、データの体積レンダリングはFigurで与えられているE 3。
図1 5軸動物ホルダーの写真。矢印1-5 5調節可能な自由と矢印6ハイライト動物制止を強調表示します。
図2と同時に、SD-OCT（AとC）とPAOM（BおよびD）眼底画像を取得しました。 A）とB）はアルビノラットから取得され、c）およびd）着色されたラットから得られる。 RV：網膜血管、CV：脈絡膜血管; RPE：網膜色素上皮。バー：500μmである。
<強い>図3アルビノラット網膜におけるPAOMの体積可視化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、SD-OCTと組み合わせるPAOMを用いたラットの目の in vivo網膜イメージングの同時の詳細な手順を紹介します。光散乱ベースのSD-OCTは、おそらく、網膜イメージング3のための臨床"ゴールドスタンダード"ですが、それが網膜に光吸収を検出するためには区別されません。新開発の6 PAOMは、網膜の光吸収特性を提供する唯一の光吸収ベース眼科画像診断法である。ヘモグロビンとメラニンが内生的に強い光吸収性顔料であるので、PAOM追加の造影剤に頼らずに解剖し、網膜/脈絡膜血管とRPEの機能の調査を可能にします。
T側のPA信号の腐った検出感度を引き起こし、その有限能動素子に起因PAOMで、やり場の超音波トランスデューサは、限られた感度領域（〜2.8×2.8ミリメートル2）を有する10視野（FOV）の彼は周囲。したがって、変換器の傾斜角度は慎重に均質網膜FOVを達成するために調整されるべきである。従来の圧電変換器のための潜在的な置換はPAOMで優れたSNRで、より均質な網膜像を提供するかもしれない低いノイズと同等の圧力値と広い検出指向性14を有する共振器のマイクロリングを適用することです。 SD-OCTと比較して、PAOMは、同様の横方向の解像度（〜20μm）で、現在は限られた超音波帯域6に起因する非常に悪い軸分解能（〜23μm）を持っています。 PAOMの軸方向の分解能は、潜在的にも斬新な超音波検出器を採用することによって改善することができます。 PAOM解像度のキャリブレーション方法は、以前は6,15を報告した。
要約すると、統合されたPAOMおよびSD-OCTイメージングシステムは、より包括的な解剖学的および網膜の機能評価を提供しており、したがって、で偉大な約束を保持している多くの眼疾患の将来の臨床診断と経営陣。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
すべての実験動物手順は、ノースウェスタン大学の施設内動物のケアと使用委員会によって承認された。
Acknowledgments
私たちは、国立科学財団（キャリアCBET-1055379）と米国立衛生研究所（1RC4EY021357、1R01EY019951）からの寛大な支援に感謝します。また、中国奨学会から魏の歌への支援を認めている。
References
- Kinyoun, J. L., Martin, D. C., Fujimoto, W. Y., Leonetti, D. L. Ophthalmoscopy versus fundus photographs for detecting and grading diabetic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33 (6), 1888-1893 (1992).
- Schuman, J. S., Wollstein, G., Farra, T., Hertzmark, E., Aydin, A., Fujimoto, J. G., Paunescu, L. A. Comparison of optic nerve head measurements obtained by optical coherence tomography and confocal scanning laser ophthalmoscopy. Am. J. Ophthalmol. 135 (4), 504-512 (2003).
- Strøm, C., Sander, B., Larsen, N., Larsen, M., Lund-Andersen, H. Diabetic macular edema assessed with optical coherence tomography and stereo fundus photography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (1), 241-245 (2002).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy. J. Vis. Exp. (51), e2729 (2011).
- Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photonics. 3 (9), 503-509 (2009).
- Jiao, S., Jiang, M., Hu, J., Fawzi, A., Zhou, Q., Shung, K. K., Puliafito, C. A., Zhang, H. F. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt. Express. 18 (4), 3967-3972 (2010).
- Wei, Q., Liu, T., Jiao, S., Zhang, H. F. Image chorioretinal vasculature in albino rats using photoacoustic ophthalmoscopy. J. Mod. Optic. 58 (21), 1997-2001 (2011).
- Liu, T., Wei, Q., Wang, J., Jiao, S., Zhang, H.F Combined photoacoustic microscopy and optical coherence tomography can measure metabolic rate of oxygen. Biomed. Opt. Express. 2 (5), 1359-1365 (2011).
- Yu, D., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Prog. Retin. Eye Res. 20 (2), 175-208 (2001).
- Song, W., Wei, Q., Liu, T., Kuai, D., Burke, J. M., Jiao, S., Zhang, H. F. Integrating photoacoustic ophthalmoscopy with scanning laser ophthalmoscopy, optical coherence tomography, and fluorescein angiography for a multimodal retinal imaging platform. J. Biomed. Opt. 17 (6), 061206 (2012).
- Mark, E. Brezinski Optical Coherence Tomography: Principles and Applications. , Academic Press. (2006).
- Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic ophthalmic angiography. Opt. Lett. 35 (1), 1-3 (2010).
- Zhang, H. F., Maslov, K., Wang, L. V. In vivo imaging of subcutaneous structures using functional photoacoustic microscopy. Nature protocols. 2, 797-804 (2007).
- Ling, T., Chen, S. L., Guo, L. J. High-sensitivity and wide-directivity ultrasound detection using high Q polymer microring resonators. Appl. Phys. Lett. 98 (20), 204103 (2011).
- Xie, Z., Jiao, S., Zhang, H. F., Puliafito, C. A. Laser-scanning optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt. Lett. 34, 1771-1773 (2009).
