Summary
Fare genital lenfosit yalıtmak için verimli bir şekilde tarif edilmiştir. Bu yöntem verimli izolasyonu sağlamak için enzim sindirim ve Percoll degrade ayrılık yararlanır. Bu teknik, diğer tür kullanım için de uyarlanabilmektedir
Abstract
, Gastrointestinal ürogenital ve solunum yolları, bu tür virüs ve bakteri gibi patojenlerin 1 için giriş portalları sağlamak dahil Mukozal yüzeyler. Mucosae gibi bağırsak Peyers yamalar ve solunum yollarında nazal ilişkili lenforetiküler doku gibi patojenlere karşı bağışıklık oluşturmak için de konak endüktif sitelerdir. Bu benzersiz özellik, konak savunma sisteminin önemli bir oyuncu olarak mukozal bağışıklık getiriyor. Birçok çalışma, gastrointestinal ve solunum mukoza alanlarında odaklanmıştır. Ancak, üreme mukozal siteleri küçük bir araştırma olmuştur. Genital mukoza bakteriyel ve viral enfeksiyonlar dahil olmak üzere cinsel yolla bulaşan hastalıklar (STD) için primer enfeksiyon sitedir. CYBH, bugün dünyanın karşı karşıya olduğu en önemli sağlık sorunlarından biridir. Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri Amerika Birleşik Devletleri'nde 19 milyon yeni enfeksiyon her yıl olduğunu tahmin ediyor. AzizDs her yıl 2 ABD sağlık sistemi 17000000000 $ maliyeti ve acil ve yaşam boyu sağlık sonuçlarının maliyet bireyler daha. Bu meydan yüzleşmek için, üreme mukozal bağışıklık daha büyük bir anlayış gerekli ve lenfositler izole bu çalışmaların önemli bir bileşenidir. Burada, tekrarlanabilir diğer türlere adaptasyon için modifiye edilebilir immünolojik çalışmalar için fare dişi genital yollarında gelen lenfositler izole etmek için bir yöntem mevcut. Aşağıda tarif edilen yöntem, bir fare dayanmaktadır.
Protocol
1. Genital sistem Kaldırma
- Onaylanan yönergeleri kullanarak fare Euthanize. Düşük orta hat kesi olun ve cilt geri çekin.
- Oviduct vajinal açılış, bütün genital ayırın ve çıkarın.
- Makas ile uzunlamasına tüm yolu açın.
- Tam RPMI-10/EDTA ile bir petri tabağına ince parçalar (<1 mm kadar) (aşağıdaki formül bakınız) içine ince cerrahi makas ile genital kesin ve ayarlamak için bir manyetik karıştırıcı üzerinde, oda sıcaklığında 125 ml'lik şişe içerisinde doku ilave edin 15 dk. Bu prosedür iki kez tekrarlandı ve daha sonra epitel ve diğer artıkları içeren süpernatan, göz ardı edilir.
- Bir hücre süzgeç (40μm) yoluyla balonun içeriği dökün. Tam orta EDTA ile kalıntı yıkayın.
Isı ile inaktive edilmiş 500 ml RPMI (Gibco),% 10 fetal sığır serumu (FBS), 5 ml penisilin / streptomisin, 5 ml 1 M HEPES: Tam RPMI/10.
Komple RPMI-10/EDTA: 5 mikron E ile% 10 RPMI (yukarıdaki gibi),DTA
2. Genital doku hazmetmek
- 20 ml taze RPMI-10/collagenase ile yeni şişesi (aşağıdaki tarife bakınız) için doku parçaları aktarın ve şiddetle doku karıştırmaya ayarlanmış bir manyetik karıştırıcı üzerinde 1 saat süreyle 37 ° C de doku sindirmek.
Komple RPMI-10/collagenase: Sağ kullanımdan önce, sulandırmak kollajenaz tip VIII (Sigma; -20 mağaza ° C, ya da üreticinin talimatlarına göre.), 450-500U/ml bir nihai konsantrasyonu tam RPMI/10 içine ekleyin. - Birinci sindirim sonra, 100 mikron hücre süzgecinden süpernatan toplamak buz üzerinde hücreleri tutmak.
- Yeni bir şişeye sindirilmemiş doku aktarın ve 3 ayrı sindirimler toplam taze tam RPMI-10/collagenase kullanarak adım 2.1 iki kez daha tekrarlayın. Bu noktada, görünür bir doku parçaları çözelti içinde olması gerekir.
- Havuz her bir örneklem araya süpernatanlar ve 100 mikron hücre süzgecinden toplamak. C Spinaşağı arşın. Hücre peletleri Percoll gradyanları kullanılarak ayrılır.
3. Percoll gradyanlar kullanarak genital sistem hücreleri ayırmak
- Kullanımdan önce Percoll her bir konsantrasyonu hazırlanması:
- 100% izotonik Percoll: mix 9:01 stok Percoll (Pharmacia Biotch) vs 10x PBS. HCL ile 7.4 pH bunu.
- % 40 Percoll çözelti: karışım% 100 izotonik Percoll ve komple RPMI 60 ml, 40 ml.
- % 70 Percoll çözelti: komple RPMI 30 ml ile karışım% 100 izotonik Percoll 70 ml.
- 40% Percoll çözümleri 6. adımdan itibaren her hücre pelletini tekrar. % 70 Percoll eşit hacimde bir gradyanlar yapmak için kullanılır. Degrade tüpleri kurmanın iki yolu vardır:
- Under-katman: sonra dikkatlice altında katman% 70 Percoll, önce bir degrade tüp içine 40% Percoll ile hücre süspansiyonu ekleyin.
- Aşırı tabaka: İlk tüp içine 70% Percoll ekleyin, sonra dikkatlice ve yavaşça üzerindeki hücreler içeren 40% Percoll yüklenemeditop.
- Gradyan örnekleri fren kapalı ile 20 dakika süre ile, 900 x g'de @, oda sıcaklığında santrifüje edilir.
- Lenfositler% 40 ve% 70 Percoll katman arasındaki ara tabaka olacaktır. Dikkatle, arabirim katmanı hasat RPMI 1:3 yıkayın ve 740 xg'de aşağı spin. Lenfosit hücre pelet olmak ve kullanım için hazır olacaktır.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Fare genital ve akış sitometrisi (FACS) analizi ile lenfosit izolasyon bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Genital sistem 7 gün sonra enfeksiyon bulaşmış intravajinal fare Chlamydia muridarum çıkarıldı. İki genital yolları FACS tarafından fonksiyonel ve fenotip muayene için yeterli lenfosit için birlikte birleştirildi. Dissected dokular yukarıda belirtildiği gibi sindirim ve izolasyon adımlar ile işleme tabi tutulmuştur. Tek bir hücre süspansiyonu çeşitli florokrom-konjuge için boyandıfare CD3, CD4 ve CD8 karşı monoklonal antikorlar. Şekil 1 CD3 pozitif T lenfositler kapılanan CD8 pozitif T hücreleri karşı CD4 pozitif T hücrelerinin bir nokta-arsa sunumu gösterir. Bizim prosedürü fare modeli değişik hastalıkların çeşitli immün hücre fonksiyonel ve fenotipik özelliklerini belirlemek için farklı hastalık modellerinin genital yolları izole lenfositlerin inceleyebilirsiniz. Bunlar, örneğin dendritik hücreler, nötrofil, makrofajlar NK, NKT, T hücreleri (Ag-spesifik T-hücreleri), B hücreleri gibi 3-10 kadar çeşitli bağışıklık hücreleri içerir.
Şekil 1. Lenfositler Burada sunulan yöntem kullanarak, Klamidya muridarum ile enfekte farelerde genital yolları izole edilmiştir. Tam bir ayırma işlemi sonrası, lenfositler florokrom-konjuge CD3, CD4 ve CD8 ile boyandı. Kadranda veriler, CD3 + lenfosit kapılanan vardıCD4 + göstererek karşı CD8 + ve Geçitli hücrelerin yüzdesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, fare genital yolları lenfosit hazırlamak için nasıl gösterilir ve kolayca hakim. Bu sürecin en kritik nokta buz üzerinde hücreleri tutarak hücre canlılığını muhafaza etmektir. Bu yöntem hücre verimi beceri, fare enfeksiyon durumu (saf ya da enfeksiyon sonrası gün), patojen (bakteriyel, viral, fungal) ve fare üreme sisteminin irdelenmesi bölümünde (yumurtalık, rahim, işleme, tekniği bağlıdır vajinal segment veya tüm genital sistem). Bizim grup ve diğerleri 5-7 fare genital farklı lenfosit toplulukları üzerinde çeşitli çalışmalar yayınlanmıştır. Bizim eller üzerinde, bir naif BALB / c fare, tüm genital sistem 2 üretebilirsiniz × 10 6 hücre% 90 canlılık ile. Birçok durumda, lenfosit daha fazla fonksiyonel ve / veya akış sitometrik analizi 3-10 için kullanılacaktır. Bizim yöntem, ce tarafından yaygın olarak kullanılan ayırma yöntemi 11 ile karşılaştırıldığındall verim 10 kat artmıştır. Bu işlem oldukça uzun, ancak izole lenfositlerin daha fazla kullanımına bağlı olarak basitleştirilebilir. Hücreleri gibi akış sitometrisi analizi olmayan fonksiyonel deneyleri için kullanıldığı zaman, yöntem, Percoll gradient adım atlayarak kısa olabilir. Bu yöntem mukozal lenfositler eğitim ve bulaşıcı hastalık araştırma içgörü sağlamak, sonraki aşı geliştirme kolaylaştırmak için güçlü ve etkili bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz finansman hibe R01-AI026328 (KAK) ve R01-AI079004 (KAK) için NIH teşekkür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
- M, The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation. Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. 2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).
- Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen. Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).
- Tang, V. A., Rosenthal, K. L. Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract. J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).
- Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue. J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).
- Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina. Immunology. 114, 213-224 (2005).
- Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides. J. Virol. 79, 393-400 (2005).
- Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).
- Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection. Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).
- Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model. J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).
- Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract. Virology. , 224-487 (1996).
