Summary
يوصف وسيلة فعالة لعزل الخلايا الليمفاوية من الجهاز التناسلي الماوس. هذه الطريقة يستفيد من إنزيم الهضم وPercoll الفصل المتدرج للسماح العزلة الفعالة. هذا الأسلوب هو أيضا قابلة للتكيف مع لاستخدامها في الأنواع الأخرى
Abstract
المخاطية الأسطح، بما في ذلك توفير في مساحات الجهاز الهضمي، البولي التناسلي، والجهاز التنفسي بوابات لدخول مسببات الأمراض، مثل الفيروسات والبكتيريا 1. المخاطية هي أيضا مواقع الاستقرائي في البلد المضيف لتوليد مناعة ضد مسببات الأمراض، مثل بقع Peyers في الأمعاء والأنسجة الأنفية المرتبطة اللمفي في الجهاز التنفسي. هذه الميزة الفريدة يجلب حصانة كلاعب حاسم للمضيف نظام الدفاع. وقد تركزت العديد من الدراسات على مواقع المخاطية المعوية وأمراض الجهاز التنفسي. ومع ذلك، كان هناك القليل من المواقع التحقيق المخاطية الإنجابية. المسالك التناسلية الغشاء المخاطي هو موقع العدوى الأولية للأمراض المنقولة جنسيا (STD)، بما في ذلك الالتهابات البكتيرية والفيروسية. الأمراض المنقولة جنسيا هي واحدة من التحديات الصحية الأكثر أهمية التي تواجه العالم اليوم. مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها يقدر أن هناك 19 مليون حالة جديدة كل عام المعدية في الولايات المتحدة. STتكلف DS في نظام الرعاية الصحية الامريكي 17 مليار دولار سنويا 2، والأفراد أكثر تكلفة حتى في العواقب الصحية المباشرة والحياة طويلة. لمواجهة هذا التحدي، هناك حاجة إلى فهم أكبر للحصانة الإنجابية وعزل الخلايا الليمفاوية هو عنصر أساسي من هذه الدراسات. هنا، نقدم طريقة لعزل الخلايا الليمفاوية من بتكاثر الفئران مساحات الأعضاء التناسلية للإناث للدراسات المناعية التي يمكن تعديلها لالتأقلم مع الأنواع الأخرى. ويستند الأسلوب هو موضح أدناه الماوس على أحد.
Protocol
1. إزالة الجهاز التناسلي
- الموت ببطء الماوس باستخدام المبادئ التوجيهية المعتمدة. جعل شق خط الوسط منخفضة وسحب الجلد.
- عزل وإزالة الجهاز التناسلي كله، من قناة البيض إلى فتحة المهبل.
- فتح المسالك كامل طوليا مع المقص.
- قطع الجهاز التناسلي مع مقص جراحي غرامة الى قطع صغيرة (حوالي <1MM) في طبق بتري مع RPMI-10/EDTA كاملة (انظر الصيغة أدناه)، وتحريك الأنسجة في قارورة 125 مل في درجة حرارة الغرفة على النمام المغناطيسي للتعيين 15 دقيقة. ويتكرر هذا الإجراء مرتين ثم يتم تجاهل طاف، الذي يحتوي على ظهارة وغيرها من الحطام.
- صب محتويات القارورة من خلال مصفاة الخلية (40μm). يغسل EDTA مع بقايا المتوسطة كاملة.
RPMI/10 كاملة: RPMI 500 مل (Gibco)، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، للحرارة المعطل، 5 مل البنسلين / الستربتوميسين، 5 مل 1M HEPES.
RPMI-10/EDTA كاملة: RPMI 10٪ (على النحو الوارد أعلاه) مع E 5μMDTA
2. هضم الأنسجة التناسلية المسالك
- نقل قطع الأنسجة لقارورة جديدة مع RPMI-10/collagenase 20 مل الطازجة (انظر الوصفة أدناه)، وهضم الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على تعيين النمام المغناطيسي لاثارة بقوة الأنسجة.
RPMI-10/collagenase كاملة: الحق قبل الاستخدام، إعادة كولاجيناز نوع VIII (سيغما؛ المحل في -20 درجة مئوية، أو وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.)، إضافة إلى RPMI/10 كاملة لتركيز النهائي من 450-500U/ml. - بعد الهضم الأول، جمع supernatants من خلال 100 ميكرومتر مصفاة الخلية، والحفاظ على الخلايا على الجليد.
- نقل الأنسجة غير مهضوم إلى قارورة جديدة وكرر الخطوة 2،1 مرتين أخريين باستخدام RPMI-10/collagenase كاملة جديدة لما مجموعه 3 الهضم منفصلة. عند هذه النقطة، لا ينبغي قطع الأنسجة وضوحا تكون في الحل.
- بركة supernatants جميعا من عينة وجمع من خلال 100 ميكرومتر مصفاة الخلية. تدور جells أسفل. سيتم فصل الكريات الخلية باستخدام التدرجات Percoll.
3. فصل الخلايا الجهاز التناسلي باستخدام التدرجات Percoll
- إعداد كل تركيز Percoll قبل الاستخدام:
- متساوي التوتر Percoll 100٪: مزيج الأسهم Percoll 09:01 (فارماسيا Biotch) مقابل PBS 10X. الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام ذلك HCL.
- 40٪ حل Percoll: 40 مل من مزيج متساوي التوتر Percoll 100٪ و 60 مل من RPMI كاملة.
- 70٪ حل Percoll: 70 مل من مزيج متساوي التوتر Percoll 100٪ مع 30 مل من RPMI كاملة.
- إعادة تعليق بيليه كل خلية من الخطوة 6 في حلول Percoll 40٪. وسوف تستخدم حجم مساو من Percoll 70٪ لجعل التدرجات. هناك طريقتان لإنشاء أنابيب التدرج:
- تحت طبقة: إضافة تعليق الخلية مع Percoll 40٪ في أنبوب التدرج أولا، ثم بعناية تحت طبقة Percoll 70٪.
- الإفراط في طبقة: إضافة Percoll 70٪ في أنبوب أولا، ثم بعناية وببطء تحميل Percoll 40٪ تحتوي على الخلايا علىالقمة.
- سيتم طرد عينات متدرجة @ 900 درجة حرارة الغرفة XG،، لمدة 20 دقيقة مع الفرامل قبالة.
- فإن الخلايا الليمفاوية تكون على طبقة واجهة بين 40٪ و 70٪ Percoll طبقات. حصاد بعناية طبقة واجهة، وغسل مع RPMI 01:03 وتدور إلى أسفل في 740 XG. فإن الخلايا الليمفاوية تكون في الخلية بيليه ونحن على استعداد لاستخدامها مرة أخرى.
4. ممثل النتائج
ويرد مثال على عزل الخلايا الليمفاوية من المسالك التناسلية الماوس وتدفق الخلوي التحليل (FACS) في الشكل رقم 1. تمت إزالة الجهاز التناسلي من muridarum الكلاميديا الماوس intravaginally إصابة 7 أيام بعد الإصابة. وكان يتم تجميع اثنين من الأعضاء التناسلية للمساحات معا من أجل الحصول على ما يكفي من الخلايا الليمفاوية للفحص وظيفية والنمط الظاهري من قبل FACS. تمت معالجة الأنسجة تشريح من قبل الهضم والعزلة الخطوات كما هو موضح أعلاه. كانت ملطخة تعليق خلية واحدة لمختلف مترافق-ملون تألقيالأضداد وحيدة النسيلة ضد CD3 الماوس، CD4 CD8 و. ويظهر الشكل 1 عرضا الدوت مؤامرة خلايا CD4 T CD8 خلايا إيجابية مقابل T إيجابية على بوابات CD3 الخلايا الليمفاوية T إيجابية. يمكن إجراء فحص لدينا مساحات معزولة عن الخلايا الليمفاوية الأعضاء التناسلية للمرض من النماذج المختلفة لتقييم مختلف الخصائص الوظيفية والخلايا المناعية في المظهري أمراض مختلفة في نموذج الفأر. وتشمل هذه الخلايا المناعية المختلفة، مثل الخلايا الجذعية، العدلات، NK الضامة، NKT، وخلايا T (حج محددة الخلايا T)، والخلايا B الخ 3-10.
تم عزل الشكل 1. الخلايا اللمفاوية من مساحات الأعضاء التناسلية للفئران مصابة muridarum الكلاميديا، وذلك باستخدام أسلوب المقدمة هنا. بعد إجراء فصل كامل، كانت ملطخة الخلايا الليمفاوية مع ملون تألقي، مترافق CD3، CD4 CD8 و. وكانت البيانات رباعي بوابات على الخلايا اللمفية CD3 +،تظهر CD4 + + CD8 مقابل مع والنسبة المئوية للخلايا بوابات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، فإنه يظهر كيفية تحضير الخلايا الليمفاوية من مساحات الماوس التناسلية ويتقن بسهولة. نقطة أهم من هذه العملية هو الحفاظ على بقاء الخلية عن طريق الحفاظ على الخلايا على الجليد. العائد من الخلية هذا الأسلوب يعتمد على التقنية، التعامل مع المهارات، ووضع المعدية من الفأرة (السذاجة أو يوم بعد الإصابة)، والممرض (البكتيرية والفيروسية الفطرية،) وقسم من النظر فيه الفئران الجهاز التناسلي (قناة البيض والرحم، الجزء المهبلي أو الجهاز التناسلي بأكمله). لقد نشرت مجموعتنا وغيرها الدراسات المختلفة على السكان اللمفاويات مختلفة من المسالك التناسلية الماوس 5-7. على أيدينا، من الماوس BALB / ج السذاجة، يمكن الجهاز التناسلي بأكمله توليد 2 مع بقاء 90٪ × 10 6 خلايا. في العديد من المناسبات، سيتم استخدام الخلايا الليمفاوية للتحليل cytometric مزيد الوظيفية و / أو تدفق 3-10. بالمقارنة مع أسلوب العزل يشيع استخدام 11، من أسلوبنا، وميتم زيادة الغلة ليرة لبنانية 10 مرات. هذا الإجراء هو طويل نسبيا، ولكن يمكن تبسيط ذلك اعتمادا على استخدام المزيد من الخلايا الليمفاوية المعزولة. عندما يتم استخدام خلايا غير وظيفية لفحوصات مثل تحليل التدفق الخلوي، يمكن أن تكون طريقة قلل من تخطي Percoll الخطوة التدرج. هذا الأسلوب يوفر قوية وأداة فعالة لدراسة الخلايا اللمفية المخاطية وتوفير نظرة ثاقبة بحوث أمراض المعدية، وتيسير تطوير لقاح لاحقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر NIH للحصول على منح التمويل R01-AI026328 (KAK) وR01-AI079004 (KAK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
- M, The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation. Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. 2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).
- Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen. Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).
- Tang, V. A., Rosenthal, K. L. Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract. J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).
- Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue. J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).
- Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina. Immunology. 114, 213-224 (2005).
- Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides. J. Virol. 79, 393-400 (2005).
- Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).
- Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection. Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).
- Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model. J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).
- Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract. Virology. , 224-487 (1996).
