Summary
淋巴细胞从小鼠生殖道隔离的一种有效的方式来进行说明。此方法利用酶消化和Percoll梯度分离，以允许有效地隔离。此技术是用于在其他物种中也适应
Abstract
粘膜表面，包括胃肠道，泌尿生殖道，呼吸道，进入门户网站的病原体，如病毒和细菌1。粘膜也电感的网站中的一个主机，以产生对病原体的免疫力，如Peyers在肠道中的补丁和在呼吸道的鼻相关的淋巴网状组织。这种独特的功能使黏膜免疫的宿主防御系统的一个重要参与者。许多研究都集中在胃肠道和呼吸道粘膜部位。然而，生殖黏膜部位出现了小调查。生殖道粘膜是性传播疾病（STD），包括细菌和病毒感染的主要感染部位。性传播疾病是当今世界面临的最严重的健康挑战之一。美国疾病控制和预防中心估计，有19万个新的传染病，每年在美国。 STDS成本，美国的医疗保健系统每年的170亿美元的2，个人成本更在近期和终身的健康后果。为了应对这一挑战，需要更深入的了解生殖黏膜免疫和分离淋巴细胞，这些研究是一个必不可少的组成部分。在这里，我们提出了一种方法，再现分离淋巴细胞小鼠女性生殖道的免疫学研究，可以修改为其他物种适应。下面描述的方法是基于在一个鼠标。
Protocol
1。去除生殖道
- 安乐死鼠标采用批准的指引。低正中切口，并收回皮肤。
- 隔离和删除整个生殖道，由输卵管阴道口。
- 打开整个道纵向剪下来的。
- 良好的手术剪刀切下生殖道细小的碎片（<1毫米左右），一个培养皿完整的RPMI-10/EDTA（见下面的公式），并于125毫升容量瓶中，在室温下搅拌组织在磁力搅拌器上设置15分钟。此过程重复两次，然后将上清液，其中包含上皮细胞和其他碎片，被丢弃。
- 倒入烧瓶的内容，通过细胞过滤器（40微米）。洗掉EDTA的残余物用完全培养基。
完整RPMI/10：：RPMI500毫升（Gibco）中，10％胎儿牛血清（FBS），热灭活，5 ml青霉素/链霉素，5毫升1M HEPES。
完整RPMI-10/EDTA：10％RPMI（定义如上）与5μMÊDTA
2。消化生殖道组织
- 组织片转移到一个新的的烧瓶用20毫升新鲜RPMI-10/collagenase（见下面的配方），并设置为大力搅拌组织在磁力搅拌器上的1小时，在37℃下消化组织。
以完整的RPMI-10/collagenase：用鼠标右键，重组型胶原酶VIII（Sigma公司;储存在-20°C，或根据制造商的说明。），在使用前，添加到完整的RPMI/10终浓度为450-500U/ml。 - 第一消化后，收集上清液，通过100μm的细胞过滤网，将细胞置于冰上保持。
- 未消化的组织转移到新的烧瓶中，并重复执行步骤2.1两次使用的新鲜完全RPMI-10/collagenase为共3个独立的消化。此时，无肉眼可见的组织片应该是在溶液中。
- 池的上清液一起从样本收集到100微米的细胞过滤。旋转的c英语学习生下来。将使用Percoll密度梯度分离细胞沉淀。
3。使用Percoll密度梯度分离生殖道细胞
- 使用前准备每个浓度的Percoll：
- 100％等渗Percoll密度：混合9:1股票的Percoll（Pharmacia公司Biotch）与10倍的PBS。 pH值7.4使用HCL。
- 40％的Percoll溶液：混合40毫升100％等渗Percoll密度和60毫升的完全RPMI中。
- 70％的Percoll溶液：混合70毫升100％等渗的Percoll用30毫升完全RPMI。
- 每个细胞沉淀重悬，从40％的Percoll解决方案中的步骤6。将等体积的70％的Percoll将被用于使梯度。建立梯度管的方法有两种：
- 在层：细胞悬液与40％的Percoll成梯度管，然后小心地根据层70％的Percoll。
- 过层：第一管中加入70％的Percoll，然后小心地慢慢地加载含有上的细胞的40％的Percoll顶部。
- 将样品离心梯度@ 900×g离心，室温，20分钟，与制动切断。
- 淋巴细胞，将在40％和70％的Percoll层之间的界面层。小心收获的接口层，洗与RPMI 1:3，在740 XG降速。淋巴细胞的细胞沉淀中，并准备好以供进一步使用。
4。代表性的成果
从小鼠生殖道和流式细胞术（FACS）分析淋巴细胞的隔离的一个例子是在图1中所示。生殖道衣原体muridarum从阴道内感染的小鼠在感染后7天。两个生殖道汇集在一起，以便有足够的淋巴细胞的功能和表型检测用流式细胞仪。解剖组织进行处理，正如上文所述的步骤的消化和隔离。单细胞悬浮液染色各种荧光染料共轭对小鼠CD3，CD4和CD8的单克隆抗体。图1示出的CD4阳性T细胞与CD8阳性T细胞对CD3阳性T淋巴细胞门控的点积呈列。我们的程序可以检查不同的疾病模型生殖道分离出的淋巴细胞，在不同的疾病小鼠模型，以评估各种免疫细胞的功能和表型特征。这些包括不同的免疫细胞，如树突状细胞，中性粒细胞，巨噬细胞的NK细胞，NKT细胞，T细胞（抗原特异性的T细胞），B细胞等3-10。
图1。淋巴细胞中分离出小鼠的生殖道感染衣原体muridarum的 ，这里介绍的方法使用。后完整的分离过程中，与荧光染料共轭的CD3，CD4和CD8淋巴细胞染色。象限数据选通淋巴细胞CD3 +，显示CD4 +与CD8 +和门控细胞的百分比。
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Discussion
在这个协议中，它展示了如何准备淋巴细胞小鼠生殖道，很容易掌握。在此过程中最关键的一点是维持细胞活力的保持将细胞置于冰上。从该方法的细胞产量取决于技术，处理技能，鼠标（幼稚或感染后的天）的感染状态，病原体（细菌，病毒，真菌）和部分的小鼠生殖道年审（输卵管，子宫，阴道内段或整个生殖道）。本集团及其他已出版了各种不同的淋巴细胞群的研究小鼠生殖道5-7。在我们的手中，从一个天真的BALB / c小鼠，整个生殖道可产生2×10 6细胞有90％的可行性。淋巴细胞在许多场合，将被用于进一步的功能和/或流式细胞术分析3-10。比较常用的隔离方法11，我们的方法，CELL的产量增加了10倍。此过程是比较长的，但它可以简化取决于分离的淋巴细胞上的进一步使用。当细胞被用于如流式细胞仪分析的非功能性的检测方法，该方法可以通过跳过Percoll梯度步骤短路。这种方法提供了一个强大的和高效率的工具，研究黏膜淋巴细胞和感染性疾病的研究提供洞察，方便后续的疫苗开发。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢美国国立卫生研究院的资金补助R01-AI026328（KAK）和R01-AI079004（KAK）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
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