Summary
En effektiv måde at isolere lymfocytter fra mus genitale er beskrevet. Denne fremgangsmåde drager fordel af enzymspaltning og Percoll gradient separation for at tillade effektiv isolering. Denne teknik kan også tilpasses til at anvendes i andre arter
Abstract
Slimhindeoverflader, herunder i det gastrointestinale, urogenitale, og luftveje, portaler for indrejse for patogener, såsom virus og bakterier 1 giver. Slimhinder er også induktive sites i værten til at generere immunitet mod patogener, såsom Peyers patches i tarmkanalen og nasal-associerede lymforetikulære væv i luftvejene. Denne unikke funktion giver slimhindeimmunitet som en afgørende spiller i værtens forsvarssystem. Mange undersøgelser har været fokuseret på mave og respiratorisk slimhinder. Imidlertid har der været meget undersøgelse af reproduktive slimhinder. Det genitale mucosa er det primære infektionssted for seksuelt overførte sygdomme (STD), herunder bakterie-og virusinfektioner. Kønssygdomme er en af de mest kritiske sundhedsmæssige udfordringer i verden i dag. Centers for Disease Control og Forebyggelse vurderer, at der er 19 millioner nye smitsomme hvert år i USA. STDs koste det amerikanske sundhedssystem 17 milliarder dollar hvert år 2, og omkostningerne individer endnu mere i umiddelbare og livslang sundhedsmæssige konsekvenser. For at imødegå denne udfordring, er en større forståelse for reproduktiv slimhindeimmunitet behov og isolere lymfocytter er en væsentlig del af disse undersøgelser. Her præsenteres en metode til reproducerbar isolere lymfocytter fra murine kvindelige kønsorganer skrifter for immunologiske undersøgelser, der kan modificeres for tilpasning til andre arter. Den nedenfor beskrevne metode er baseret på en mus.
Protocol
1. Fjernelse af kønsorganerne
- Aflive mus ved hjælp af godkendte retningslinjer. Gøre lav midtlinjeincision og trække huden.
- Isoler og fjerne hele genitaler, fra æggelederen til skedeåbningen.
- Åbn hele tarmkanalen på langs med en saks.
- Skær kønsorganerne med fine kirurgiske sakse i fine stykker (ca. <1 mm) i en petriskål med Komplet RPMI-10/EDTA (se nedenstående formel) og omrør vævet i 125 ml kolbe ved stuetemperatur på en magnetisk omrører sæt til 15 min. Denne procedure gentages to gange og derefter supernatanten, som indeholder epitelet og andet snavs, bortkastes.
- Hæld indholdet af kolben gennem en celle si (40 um). Vask EDTA rest med komplet medium.
Komplet RPMI/10: RPMI 500 ml (Gibco), 10% føtalt bovint serum (FBS), varmeinaktiveret, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml 1 M HEPES.
Komplet RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (som ovenfor) med 5 uM EDTA
2. Fordøje kønsorganer væv
- Overførsel vævsstykker til en ny kolbe med 20 ml frisk RPMI-10/collagenase (se opskriften nedenfor) og fordøje væv ved 37 ° C i 1 time på en magnetisk omrører sat til kraftigt omrørt vævet.
Fuldstændig RPMI-10/collagenase: Lige før anvendelse, rekonstitueres collagenase Type VIII (Sigma; opbevares ved -20 ° C, eller ifølge producentens instruktioner.) Tilsættes, til fuldstændig RPMI/10 til en slutkoncentration på 450-500U/ml. - Efter den første fordøjelse, indsamle supernatanter gennem 100 um celle si, holde cellerne på is.
- Overfør den nedbrudte væv til en ny kolbe, og gentag trin 2,1 to gange mere med frisk komplet RPMI-10/collagenase for i alt tre adskilte fordøjelser. På dette tidspunkt bør ingen synlige vævsstykker være i opløsning.
- Pool de alle supernatanterne sammen fra en prøve og indsamle gennem 100 um celle si. Spin calen ned. Cellepellets vil blive adskilt ved hjælp af Percoll-gradienter.
3. Separering genitalkanalen celler under anvendelse af Percoll-gradienter
- Forbered hver koncentration af Percoll før brug:
- 100% isotonisk Percoll: mix 09:01 lager Percoll (Pharmacia Biotch) vs 10x PBS. pH det til 7,4 under anvendelse af HCL.
- 40% Percoll opløsning: mix 40 ml 100% isotonisk Percoll og 60 ml komplet RPMI.
- 70% Percoll opløsning: mix 70 ml 100% isotonisk Percoll med 30 ml komplet RPMI.
- Resuspender hver cellepellet fra trin 6 i 40% Percoll-opløsninger. Et tilsvarende volumen 70% Percoll skal anvendes til fremstilling af gradienter. Der er to måder at opsætte gradient rør:
- Under-lag: tilføj cellesuspension med 40% Percoll i en gradient rør først, derefter forsigtigt underlag 70% Percoll.
- Over-layer: tilføj 70% Percoll i røret først, derefter forsigtigt og langsomt indlæse 40% Percoll indeholdende cellerne påtop.
- Gradient prøver bliver centrifugeret @ 900 x g, stuetemperatur i 20 min med bremse fra.
- Lymfocytterne er i grænsefladelaget mellem 40% og 70% Percoll-lagene. Forsigtigt høste grænsefladelaget, vaskes med RPMI 1:3 og spin ned på 740 xg. Lymfocytterne er i cellepelleten og er klar til yderligere anvendelse.
4. Repræsentative resultater
Et eksempel på isolering af lymfocytter fra mus kønsorganer og flowcytometri (FACS) analyse er vist i figur 1.. Genitale område blev fjernet fra Chlamydia muridarum intravaginalt inficeret mus 7 dage efter infektionen. To genitale skrifter blev samlet sammen for at have nok lymfocytter til funktionel og fænotype undersøgelse ved FACS. Dissekerede væv blev behandlet af fordøjelse og isoleringstrin som skitseret ovenfor. Den enkelt cellesuspension blev farvet for forskellige fluorokromkonjugeredemonoklonale antistoffer mod muse CD3, CD4 og CD8. Figur 1 viser et dot-plot præsentation af CD4-positive T-celler versus CD8 positive T-celler gated på CD3-positive T-lymfocytter. Vores procedure kan undersøge lymfocytter isoleret fra genital skrifter af forskellige sygdomsmodeller til at vurdere forskellige immuncelletyper funktionelle og fænotypiske karakteristika i forskellige sygdomme i musemodel. Disse omfatter forskellige immunceller såsom dendritiske celler, neutrofile, makrofager NK, NKT, T-celler (Ag-specifikke T-celler), B-celler etc. 3-10.
Figur 1. Lymfocytter blev isoleret fra genitale områder af mus inficeret med Chlamydia muridarum, ved anvendelse af fremgangsmåden præsenteret her. Efter fuldstændig adskillelse procedure blev lymfocytter farvet med fluorochrom-konjugerede CD3, CD4 og CD8. The Quadrant data var gated på CD3 +-lymfocytter,viser CD4 + versus CD8 + med og procentdelen af gatede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol er det vist, hvordan man forbereder lymfocytter fra mus genitale skrifter og er let mestrer. Det mest kritiske punkt af denne proces er at opretholde cellelevedygtighed ved at holde cellerne på is. Celleindholdet af denne metode afhænger af teknik, håndtering dygtighed, den infektiøse tilstand af musen (naive eller dag efter infektion), patogenet (bakteriel, viral, fungal), og den del af den murine kønsveje undersøgt (æggeleder, uterus, vaginal segment eller hele kønsorganer). Vores gruppe og andre har offentliggjort forskellige undersøgelser på forskellige lymfocytpopulationer fra mus kønsorganer 5-7. På vores hænder, fra den ene Naiv BALB / c mus kan hele genitialier generere 2 × 10 6 celler med 90% levedygtighed. I mange tilfælde vil lymfocytterne skal anvendes til yderligere funktionelle og / eller flow-cytometrisk analyse 3-10. I sammenligning med almindeligt anvendte isoleringsmetode 11 af vores fremgangsmåde, at cell udbytte øges 10 gange. Denne procedure er forholdsvis lang, men den kan forenkles afhængigt af den videre anvendelse af de isolerede lymfocytter. Når cellerne anvendes til ikke-funktionelle assays, såsom flowcytometri-analyse, kan fremgangsmåden blive kortsluttet spring Percoll-gradient trin. Denne metode giver en kraftfuld og et effektivt redskab til at studere mucosale lymfocytter og give indsigt i smitsomme sygdomme forskning, lette efterfølgende udvikling af vacciner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke NIH til finansiering af tilskud R01-AI026328 (KAK) og R01-AI079004 (KAK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
- M, The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation. Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. 2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).
- Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen. Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).
- Tang, V. A., Rosenthal, K. L. Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract. J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).
- Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue. J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).
- Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina. Immunology. 114, 213-224 (2005).
- Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides. J. Virol. 79, 393-400 (2005).
- Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).
- Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection. Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).
- Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model. J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).
- Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract. Virology. , 224-487 (1996).
