Summary
Un moyen efficace pour isoler les lymphocytes de souris tractus génital est décrite. Cette méthode tire parti de la digestion enzymatique et séparation par gradient de Percoll pour permettre l'isolement efficace. Cette technique est également adaptable pour une utilisation à d'autres espèces
Abstract
Les muqueuses, y compris dans les voies gastro-intestinales, génito-urinaire, respiratoire et, fournir des portes d'entrée pour les agents pathogènes, comme les virus et les bactéries 1. Muqueuses sont également des sites inductifs dans l'hôte afin de générer une immunité contre les agents pathogènes, tels que les patchs Peyers dans le tractus intestinal et le tissu nasal lymphoréticulaire associé dans les voies respiratoires. Cette caractéristique unique permet de l'immunité des muqueuses comme un acteur incontournable du système de défense de l'hôte. De nombreuses études ont porté sur digestives et respiratoires dans les muqueuses. Cependant, il ya eu peu d'études de la reproduction des muqueuses. La muqueuse du tractus génital est le site d'infection primaire des maladies sexuellement transmissibles (MST), y compris les infections bactériennes et virales. MST sont un des problèmes de santé les plus critiques auxquels est confronté le monde d'aujourd'hui. Centers for Disease Control and Prevention estime qu'il ya 19 millions de nouveaux infectieuse chaque année aux États-Unis. STDs le coût du système de santé américain 17 milliards de dollars chaque année 2, et les individus de coûts encore plus en conséquences immédiates et à long de la vie. Pour faire face à ce défi, une meilleure compréhension de l'immunité muqueuse reproduction est nécessaire et isoler des lymphocytes est une composante essentielle de ces études. Ici, nous présentons une méthode reproductible pour isoler les lymphocytes murins de voies génitales femelles pour les études immunologiques qui peuvent être modifiés pour s'adapter à d'autres espèces. La méthode décrite ci-après est basé sur une souris.
Protocol
1. Retrait de l'appareil génital
- Euthanasier la souris en utilisant les lignes directrices approuvées. Faire une incision médiane bas et retirer la peau.
- Isoler et supprimer tout appareil génital, de l'oviducte dans l'ouverture du vagin.
- Ouvrez l'ensemble du tractus longitudinalement avec des ciseaux.
- Couper les voies génitales avec de beaux ciseaux chirurgicaux en petits morceaux (environ <1mm) dans une boîte de Pétri avec RPMI-10/EDTA complète (voir la formule ci-dessous) et agiter le tissu dans 125 ml flacon à température ambiante sur un agitateur magnétique réglé pour 15 min. Cette procédure est répétée deux fois, puis le surnageant, qui contient l'épithélium et d'autres débris, est rejetée.
- Verser le contenu du flacon à travers un tamis cellulaire (40 um). Enlever tout résidu de l'EDTA avec du milieu complet.
RPMI/10 complète: 500 ml de RPMI (Gibco), 10% de sérum bovin foetal (FBS), inactivé à la chaleur, 5 ml de pénicilline / streptomycine, 5 ml de HEPES 1M.
Complète RPMI-10/EDTA: RPMI 10% (comme ci-dessus) avec E 5 uMDTA
2. La digestion des tissus des voies génitales
- Transfert morceaux de tissu pour un nouveau flacon de 20 ml RPMI-10/collagenase frais (voir la recette ci-dessous) et de digérer les tissus à 37 ° C pendant 1 heure sur un agitateur magnétique réglé à remuer vigoureusement le tissu.
RPMI-10/collagenase complet: Juste avant utilisation, reconstituer la collagénase de type VIII (Sigma, conserver à -20 ° C, ou selon les instructions du fabricant.), Ajouter dans RPMI/10 complète à une concentration finale de 450-500U/ml. - Après la première digestion, de recueillir les surnageants à travers un tamis de 100 um cellule, maintenir les cellules sur la glace.
- Transférer le tissu non digérés dans un ballon à nouveau et répétez l'étape 2.1 deux fois à l'aide de frais RPMI-10/collagenase complet pour un total de 3 digestions distinctes. À ce stade, aucun morceaux de tissu doivent être visibles dans la solution.
- Réunir les fractions surnageantes tous ensemble à partir d'un échantillon et collecter à travers un tamis de 100 um cellule. Faites tourner la cElls vers le bas. Les culots cellulaires sont séparés en utilisant des gradients de Percoll.
3. Séparation des cellules du tractus génital en utilisant des gradients de Percoll
- Préparer chaque concentration de Percoll avant de l'utiliser:
- 100% Percoll isotonique: mélange 09:01 de stock Percoll (Pharmacia Biotch) vs 10x PBS. il le pH à 7,4 à l'aide HCL.
- Solution Percoll 40%: mélanger 40 ml de Percoll isotonique 100% et de 60 ml de RPMI complet.
- Solution Percoll 70%: mélanger 70 ml de Percoll isotonique 100% avec 30 ml de RPMI complet.
- Remettre en suspension chaque culot cellulaire de l'étape 6 dans les solutions de Percoll 40%. Un volume égal de Percoll 70% sera utilisé pour faire les dégradés. Il ya deux façons de mettre en place des tubes de gradient:
- Sous-couche: ajouter suspension cellulaire avec Percoll 40% dans un tube à gradient d'abord, puis soigneusement sous-couche de Percoll 70%.
- Sur-couche: ajouter Percoll 70% dans le tube, puis soigneusement et lentement charger Percoll 40% contenant les cellules de ladessus.
- Gradient échantillons seront centrifugés à 900 xg température ambiante,, pendant 20 minutes avec le frein hors tension.
- Les lymphocytes seront à la couche d'interface entre 40% et 70% des couches de Percoll. Soigneusement récolter la couche d'interface, laver avec du RPMI 1:3 et spin bas à 740 xg. Les lymphocytes sont dans le culot cellulaire et sont prêts pour une utilisation ultérieure.
4. Les résultats représentatifs
Un exemple de l'isolement des lymphocytes de souris tractus génital et cytométrie de flux (FACS) est illustré à la figure 1. Tractus génital a été retiré de Chlamydia muridarum intravaginale souris infectées 7 jours après l'infection. Deux voies génitales ont été regroupées afin d'avoir suffisamment de lymphocytes pour examen fonctionnel et le phénotype par FACS. Tissus disséqués ont été traitées par la digestion et étapes d'isolation tel que décrit ci-dessus. La suspension cellulaire unique a été coloré pour diverses conjugué à un fluorochromeanticorps monoclonaux dirigés contre CD3 de souris, CD4 et CD8. La figure 1 montre une présentation dot-plot des cellules T CD4 positifs par rapport aux lymphocytes T CD8 positifs gated sur CD3 des lymphocytes T positifs. Notre procédure peut examiner lymphocytes isolés à partir des voies génitales de modèles de maladies différentes pour évaluer les différentes caractéristiques de cellules immunitaires fonctionnelles et phénotypiques dans différentes maladies dans le modèle de souris. Il s'agit notamment de diverses cellules immunitaires, telles que les cellules dendritiques, les macrophages, polynucléaires neutrophiles NK, NKT, les lymphocytes T (Ag cellules T spécifiques), les lymphocytes B, etc 3-10.
Lymphocytes Figure 1. Ont été isolés à partir des voies génitales de souris infectées par la chlamydia muridarum, en utilisant la méthode présentée ici. Après la procédure de séparation complète, les lymphocytes ont été colorés avec un fluorochrome conjugués CD3, CD4 et CD8. Les données ont été quadrant gated sur lymphocytes CD3 +,montrant CD4 + CD8 + par rapport aux cellules et le pourcentage de dépendants.
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Discussion
Dans ce protocole, il est montré comment préparer des lymphocytes de souris voies génitales et est facilement maîtrisé. Le point le plus critique de ce processus est de maintenir la viabilité des cellules en gardant les cellules sur la glace. Le rendement cellulaire de cette méthode dépend de la technique, la gestion des compétences, le statut infectieux de la souris (ou naïve jour après l'infection), l'agent pathogène (bactérie, virus, champignon) et la section de la souris examiné l'appareil reproducteur (oviducte, l'utérus, secteur vaginal ou toute tractus génital). Notre groupe et d'autres ont publié plusieurs études sur différentes populations de lymphocytes de souris tractus génital 5-7. Sur nos mains, d'une naïve souris BALB / c, toute tractus génital peut générer 2 × 10 6 cellules avec une viabilité de 90%. En de nombreuses occasions, les lymphocytes sera utilisé pour l'analyse par cytométrie en plus fonctionnels et / ou le débit 3-10. En comparaison avec la méthode d'isolement couramment utilisé 11, par notre méthode, la CEll rendement est augmenté de 10 fois. Cette procédure est relativement longue, mais elle peut être simplifiée en fonction de l'utilisation ultérieure des lymphocytes isolés. Lorsque les cellules sont utilisées pour des tests non-fonctionnels tels que l'analyse par cytométrie en flux, la méthode peut être court-circuité en sautant l'étape gradient de Percoll. Cette méthode fournit un outil puissant et un outil efficace pour étudier lymphocytes de la muqueuse et de donner un aperçu des recherches sur les maladies infectieuses, de faciliter le développement futur vaccin.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier NIH pour les subventions de financement R01-AI026328 (KAK) et R01-AI079004 (KAK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
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