Summary
דרך יעילה לבודד את הלימפוציטים מדרכי מין עכבר מתוארת. שיטה זו מנצלת עיכול אנזים והפרדת השיפוע Percoll לאפשר בידוד יעיל. טכניקה זו היא גם להתאמה לשימוש במינים אחרים
Abstract
משטחים ריריים, כולל בשטחים במערכת העיכול, ואברי מין, ונשימה, מספקים פורטלים של כניסה לפתוגנים, כגון וירוסים וחיידקים 1. Mucosae גם אתרים אינדוקטיביים במארח לייצר חסינות מפני פתוגנים, כגון תיקוני Peyers עובר במעי ורקמות lymphoreticular אף הקשורים בדרך הנשימה. תכונה ייחודית זו מביאה חסינות רירית כשחקן חשוב מאוד במערכת ההגנה של המארח. מחקרים רבים שהתמקדו באתרי רירית מערכת עיכול ומערכת נשימה. עם זאת, יש כבר חקירה קטנה של אתרים ריריים רבייה. אברי המין בדרכי הרירית היא אתר הזיהום העיקרי למחלות המועברות במגע מיני (STD), כולל זיהומים חיידקיים ונגיפיים. מחלות מין הן האחד האתגרים הבריאותיים הקריטיים ביותר העומד בפני עולם כיום. מרכז לבקרת מחלות ומניעתן מעריך כי יש 19,000,000 מדבקת בכל שנה חדשה בארצות הברית. STDs עולה למערכת הבריאות בארה"ב 17 מליארד דולרים בכל שנה 2, ואנשים עוד יותר בעלות השלכות בריאותיות מיידיות וחיים ארוכים. על מנת להתמודד עם אתגר זה, הבנה טובה יותר של חסינות רירית רבייה יש צורך והבידוד לימפוציטים הוא מרכיב חיוני של לימודים אלה. כאן, אנו מציגים שיטת reproducibly לבודד ימפוציטים משטחי Murine מין נשי ללימודים אימונולוגיים כי ניתן לשנות להסתגלות למינים אחרים. השיטה המתוארת להלן מבוססת על עכבר אחד.
Protocol
1. הסרת איברי המין
- להרדים את העכבר באמצעות הנחיות מאושרות. הפוך חתך קו אמצע נמוך ולחזור בו עור.
- מבודד ולהסיר דרכי מין מלאות, מצינור השחלה לפתח נרתיק.
- פתח את כל דרכי longitudinally עם מספריים.
- חותך את איבר המין עם מספריים כירורגית עדינים לחתיכות (כ <1 מ"מ) בצלחת פטרי עם RPMI-10/EDTA מלא (ראה את הנוסחא בהמשך) ומערבב את הרקמה בבקבוק 125 מ"ל בטמפרטורת חדר על stirrer מגנטי מוגדרים עבור 15 דקות. הליך זה חוזר על עצמו פעמים ולאחר מכן את supernatant, המכיל האפיתל ופסולת אחרת, נמחק.
- יוצק תכולת הקנקן דרך מסננת תא (40μm). לשטוף את שאריות EDTA עם מדיום שלם.
RPMI/10 מלא: RPMI 500 מ"ל (Gibco), 10% בסרום שור עוברי (FBS), חום מומת-, 5 המ"ל פניצילין / סטרפטומיצין, 5 1M HEPES מ"ל.
RPMI-10/EDTA מלא: 10% RPMI (כאמור לעיל) עם E 5μMDTA
2. מעכל את רקמות מערכת מין
- להעביר פיסות רקמה לבקבוק חדש עם RPMI-10/collagenase טרי 20 מ"ל (ראה מתכון בהמשך) ולעכל את הרקמה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ב stirrer מגנטי מוגדרים נמרצות כדי לעורר את הרקמה.
RPMI-10/collagenase מלא: ממש לפני השימוש, collagenase לשקם סוג שמיני (סיגמא; חנות ב -20 ° C, או לפי הוראות היצרן.), להוסיף לRPMI/10 מלא לריכוז סופי של 450-500U/ml. - לאחר העיכול הראשון, לאסוף supernatants דרך מסננת תא 100 מיקרומטר, לשמור על תאים על קרח.
- העברת הרקמות המעוכלות בבקבוק חדש ולחזור על 2.1 פעמים נוספות באמצעות צעד RPMI-10/collagenase מלא טרי עבור סכום כולל של 3 digestions הנפרד. בשלב זה, ללא חלקי רקמה גלויות צריכים להיות בפתרון.
- ברכה את כל supernatants יחד ממדגם ואוסף דרך מסננת תא 100 מיקרומטר. ספין גאמות למטה. כדורים סלולריים יופרדו באמצעות גרדיאנטים Percoll.
3. הפרדת תאי מערכת מין באמצעות גרדיאנטים Percoll
- הכן את כל ריכוז של Percoll לפני שימוש:
- 100% Percoll איזוטוני: התמהיל 9:01 המנייה Percoll (Pharmacia Biotch) לעומת PBS 10x. חומציותו ל 7.4 באמצעות HCL.
- 40% פתרון Percoll: לערבב 40 מ"ל של Percoll איזוטוני 100% ו 60 מ"ל של RPMI המלא.
- 70% פתרון Percoll: לערבב 70 מ"ל של Percoll איזוטוני 100% עם 30 מ"ל של RPMI המלא.
- Resuspend כל תא גלולה מהשלב 6 בפתרוני Percoll 40%. נפח שווה של Percoll 70% יהיה בשימוש על מנת להפוך את השיפועים. ישנן שתי דרכים להגדיר צינורות הדרגתיים:
- תחת שכבה: להוסיף השעית תא עם Percoll 40% לצינור שיפוע ראשון, ואז בזהירות מתחת לשכבה 70% Percoll.
- מעל השכבה: להוסיף Percoll 70% לצינור ראשון, ואז בזהירות ובאיטיות לטעון Percoll 40% המכיל את התאים עלעליון.
- דגימות שיפוע תהיינה centrifuged @ 900 XG, בטמפרטורת החדר, במשך 20 דקות עם הבלם כבוי.
- הלימפוציטים יהיו בשכבת הממשק שבין 40% ושכבות Percoll 70%. זהירות לקצור את שכבת הממשק, לשטוף עם RPMI 01:03 וספין למטה ב740 XG. הלימפוציטים יהיו בתא הכדורי ומוכנים לשימוש נוסף.
4. נציג תוצאות
דוגמה לבידוד של לימפוציטים מדרכי מין עכבר וcytometry ניתוח תזרים (FACS) מוצגת באיור 1. דרכי מין הוסרו מכלמידיה muridarum עכבר נדבק intravaginally 7 ימים לאחר הדבקה. שני מסלולי גניטלי היו נקווים יחד כדי שיהיו מספיק לימפוציטים לבדיקה פונקציונלית ופנוטיפ ידי FACS. רקמות גזורות עובדו על ידי העיכול וצעדי בידוד כפי שתואר לעיל. השעית התא הבודדה הייתה מוכתמת לfluorochrome מצומדות השונהנוגדנים חד שבטי כנגד CD3 עכבר, CD4 וCD8. איור 1 מציג מצגת הדוט עלילה של תאי T מסוג CD4 חיוביים לעומת תאי T CD8 חיוביים מגודרים בלימפוציטים מסוג T CD3 חיובי. ההליך שלנו יכול לבחון לימפוציטים שבודדו משטחי אברי מין של מודלים שונים מחלה להעריך תאים חיסוניים מאפיינים שונים ופונקציונליים הפנוטיפי במחלות שונות במודל עכבר. אלה כוללים תאים חיסוניים מגוונים, כגון תאים דנדריטיים, נויטרופילים, מקרופגים NK, NKT, תאי T (תאי T Ag ספציפיים), תאי B וכו 3-10.
האיור 1. ימפוציטים בודדו משטחי אברי מין של עכברים נגועים בכלמידיה muridarum, בשיטה שהוצגה כאן. לאחר הליך ההפרדה המוחלטת, לימפוציטים הוכתמו CD3 fluorochrome-מצומדות, CD4 וCD8. הנתונים של הרביע היו מגודרים בCD3 הלימפוציטים +,מראה מסוג CD4 + לעומת CD8 + ובאחוז התאים מגודרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, הוא הראה כיצד להתכונן לימפוציטים משטחי עכבר אברי מין והוא שולט בקלות. הנקודה הקריטית ביותר של תהליך זה היא לשמור על כדאיויות תא על ידי שמירה על התאים על קרח. תשואת התא משיטה זו תלויה בטכניקה, מיומנות טיפול, מצב המדבק של העכבר (נאיבי או יום אחרי הדבקה), פתוגן (חיידקים, נגיפים, פטריות) ובקטע של רביית הדרכים הנבחנות העכברית (צינור שחלה, רחם, קטע נרתיק או דרכי מין כולו). הקבוצה ואחרים פרסמו מחקרים שונים באוכלוסיות לימפוציטים שונות מדרכי מין עכבר 5-7. בידות שלנו, מעכבר אחד נאיבי BALB / ג, מערכת מין כולו יכולה לייצר 2 × 10 6 תאים עם 90% יכולת קיום. בהזדמנויות רבות, את הלימפוציטים ישמשו לניתוח פונקציונלי נוסף ו / או זרימת cytometric 3-10. בהשוואה לשיטה הנפוצה הבידוד 11, בשיטה שלנו, ceתשואת ll הוא גדל פי 10. הליך זה הוא ארוך יחסית, אבל זה יכול להיות פשוט תלוי בשימוש הנוסף של לימפוציטים הבודדים. כאשר התאים המשמשים למבחנים שאינם פונקציונליים, כגון ניתוח cytometry זרימה, השיטה יכולה להיות לקצר ידי דילוג על שלב השיפוע Percoll. שיטה זו מספקת עצמה וכלי יעיל ללמוד ימפוציטים ריריים ולספק תובנה מחקר מחלות זיהומיות, להקל על פיתוח חיסון שלאחר מכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות לNIH למימון מענקי R01-AI026328 (קאק) וR01-AI079004 (קאק).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
- M, The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation. Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. 2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).
- Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen. Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).
- Tang, V. A., Rosenthal, K. L. Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract. J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).
- Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue. J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).
- Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina. Immunology. 114, 213-224 (2005).
- Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides. J. Virol. 79, 393-400 (2005).
- Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).
- Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection. Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).
- Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model. J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).
- Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract. Virology. , 224-487 (1996).
