Summary
마우스 성기 기관에서 림프구를 분리 할 수있는 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 효율적으로 분리 할 수 있도록 효소 분해와 Percoll 기울기 분리에 활용합니다. 이 기술은 다른 종에 사용하기 위해도에 적용 할 수 있습니다
Abstract
, 위장병 비뇨 생식 및 호흡기 책자에서, 바이러스 및 박테리아 1로 병원균에 대한 항목의 포털을 제공 등의 점막 표면. Mucosae는 창자에있는 Peyers 패치와 호흡기의 코 - 관련 lymphoreticular 조직 등의 병원균에 대한 면역을 생성하는 것도 호스트의 유도 사이트입니다. 이 독특한 기능은 호스트 방어 시스템의 중요한 플레이어로 점막 면역을 제공합니다. 많은 연구 위장병과 호흡기 점막 사이트에 초점을 맞추고있다. 그러나, 생식 점막 사이트의 약간의 조사가되었습니다. 성기 요로 점막은 세균과 바이러스 감염 등의 성병 (STD)의 기본 감염 사이트입니다. 성병은 오늘날 세계적가 직면하고있는 가장 중요한 건강 문제 중 하나입니다. 질병 통제 예방 센터는 미국 19 명의 새로운 전염성 매년있는 것으로 추정하고 있습니다. STDS 매년 2 미국 의료 시스템에서 1백70억달러 비용, 그리고 즉각적이고 평생 건강 결과에 비용 개인보다. 이 문제를 직면하기 위해, 생식 점막 면역의 큰 이해가 필요하고 림프구를 분리하면 이러한 연구의 필수 구성 요소입니다. 여기, 우리는 reproducibly 다른 종에 대한 적응을 위해 수정할 수 있습니다 면역 연구 손쥐 여성 성기 책자에서 림프구를 분리하는 방법을 제시한다. 아래에서 설명하는 방법은 한 마우스에 기반을두고 있습니다.
Protocol
1. 성기 기관의 제거
- 승인 된 지침을 사용하여 마우스를 안락사시켜야. 낮은 중간 선을 절개하고 피부를 철회.
- 수란관에서 질구까지 전체 성기 기관을 분리하고 제거합니다.
- 가위로 길이 방향 전체 기관을 엽니 다.
- 전체 RPMI-10/EDTA있는 배양 접시에서 훌륭한 조각 (<1mm 정도) (아래의 공식을 참조)로 미세 수술 가위로 성기 기관을 잘라로 설정 자석 교반기에 실온에서 125 ML 플라스크에 조직을 저어 15 분. 이 절차는 두 번 반복되는 다음 상피와 다른 파편을 포함하는 표면에 뜨는는, 삭제됩니다.
- 셀 스트레이너 (40μm)를 통해 플라스크의 내용을 넣어. 전체 매체 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 잔류 물을 씻어.
열 inactivated RPMI 500 ML (Gibco), 10 % 태아 소 혈청 (FBS),, 5 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ML 100 HEPES : 전체 RPMI/10.
전체 RPMI-10/EDTA : 5μM E와 10% RPMI (위 등)DTA
2. 성기 요로 조직을 소화
- 20 ML 신선한 RPMI-10/collagenase로 새 플라스크 (아래의 제조법 참조) 조직 조각을 전송하고 적극적으로 조직을 저어하도록 설정 자석 교반기에 1 시간에 37 ° C에서 조직을 소화.
전체 RPMI-10/collagenase : 마우스 오른쪽 사용하기 전에, reconstitute collagenase를 입력 VIII이 (시그마, -20에 저장 ° C 또는 제조업체의 지시에 따라.), 450-500U/ml의 최종 농도에 완벽한 RPMI/10에 추가 할 수 있습니다. - 첫 번째 소화 한 후, 100 μm 셀 스트레이너를 통해 supernatants를 수집 얼음에 세포를 유지.
- 새로운 플라스크에 소화되지 않은 조직을 전송, 3 별도의 digestions의 총 신선한 완전한 RPMI-10/collagenase를 사용하여 단계 2.1 두 번 반복합니다. 이 시점에서 눈에 띄는 조직 조각이 솔루션에 할 수 없습니다.
- 수영장 모든 샘플에서 함께 supernatants 100 μm 셀 스트레이너를 통해 수집합니다. C를 스핀아래 ells. 세포 펠릿은 Percoll의 그라디언트를 사용하여 구분됩니다.
3. Percoll 그라디언트를 사용하여 성기 요로 세포를 분리
- 사용하기 전에 Percoll의 각 농도 준비 :
- 백퍼센트 등장 Percoll : 혼합 9시 1분 주식 Percoll (Pharmacia Biotch) 대 10 배 PBS. HCL을 사용하여 7.4으로 산도를.
- 40 % Percoll 솔루션 : 혼합 백퍼센트 등장 Percoll과 완벽한 RPMI 60 ML 40 ML.
- 70 % Percoll 솔루션 : 전체 RPMI의 30 ML과 혼합 백퍼센트 등장 Percoll의 70 ML.
- 40 % Percoll 솔루션의 6 단계에서 각 셀 펠렛을 Resuspend. 70 % Percoll의 동일한 볼륨은 그라디언트를 만들기 위해 사용됩니다. 그라데이션 튜브를 설정하는 방법은 두 가지가 있습니다 :
- 아래 층 : 그럼 조심스럽게 이하 계층 70 %의 Percoll 먼저 그라디언트 관에 40 % Percoll과 세포 현탁액을 추가합니다.
- 이상 층 : 첫 번째 관에 70 % Percoll을 추가 한 다음 조심스럽게 천천히의 세포를 포함하는 40 % Percoll을로드맨.
- 그라디언트 샘플은 브레이크를 해제로 20 분을 위해, @ 900 XG, 방 온도를 centrifuged 될 것입니다.
- 림프구는 40 %와 70 % Percoll 레이어 사이의 인터페이스 계층에있을 것입니다. 조심스럽게, 인터페이스 레이어를 수확 RPMI 1시 3분로 씻고 740 XG에서 스핀 다운. 림프구는 세포 펠렛에 추가로 사용할 준비가됩니다.
4. 대표 결과
마우스 성기 요로 및 유동 세포 계측법 (FACS) 분석에서 림프구의 분리의 예는 그림 1에 표시됩니다. 성기 요로 7 일 감염 후 intravaginally 감염 마우스 클라미디아 muridarum에서 제거되었습니다. 두 성기 책자는 FACS에 의해 기능 및 표현형 검사에 충분한 림프구를 위해 함께 풀링되었습니다. 해부 조직은 위에서 설명한대로 소화 및 절연 단계에서 처리되었다. 하나의 세포 현탁액은 다양한 fluorochrome - 복합에 얼룩이되었습니다마우스에는 3 번 CD, CD4 및 CD8에 대한 단클론 항체. 그림 1은 3 번 CD 긍정적 인 T 림프구의 출입을 금지 CD8 양성 T 세포 대 CD4 양성 T 세포의 점 플롯 프리젠 테이션을 보여줍니다. 우리 절차는 마우스 모델에서 다른 질병에 다양한 면역 세포 기능과 phenotypic 특성을 평가하기 위해 다른 질병 모델 성기 책자로부터 격리 림프구을 검사 할 수 있습니다. 이는 수지상 세포, 호중구, 대 식세포 NK, NKT, T 세포 (자세 별 T 세포), B 세포 등 3-10 등 다양한 면역 세포 등이 있습니다.
그림 1. 림프구는 여기에 제시된 방법을 사용하여 클라미디아 muridarum에 감염된 생쥐의 성기 책자에서 고립되었다. 전체 분리 절차 후, 림프구는 fluorochrome - 복합 3 번 CD, CD4와 CD8 물들했다. 분면 데이터는 3 번 CD +의 림프구에 대한 출입을 금지했다CD4를 보여주는 + 대 CD8 +와와 출입을 금지 세포의 비율입니다.
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Discussion
이 프로토콜에서, 마우스 성기 책자에서 림프구를 준비하는 방법에 표시되며 쉽게 마스터 수 있습니다. 이 과정의 가장 중요한 포인트는 얼음에 세포를 유지하여 세포 생존 능력을 유지하는 것입니다. 이 방법에서 세포 수율은 기술, 마우스의 전염성 상태 (나이브 또는 감염 후 일), 병원체 (세균, 바이러스, 곰팡이)와 손쥐 생식 기관 심사의 절 (수란관, 자궁, 처리, 기술에 따라 달라집니다 질 세그먼트 또는 전체 성기 기관). 우리 그룹과 다른는 5-7 마우스 성기 요로 다른 림프구 인구의 다양한 연구를 발표했습니다. 손에 한 순진한 BALB / C 마우스에서 전체 성기 요로 2를 생성 할 수 있습니다 × 10 6 세포를 90 % 생존과. 많은 경우에서, 림프구는 더 기능적 및 / 또는 흐름 cytometric 분석 3-10에 사용됩니다. 우리의 방법, CE에 의해 일반적으로 사용되는 절연 방법 11에 비해붙인다 수율은 10 배 증가합니다. 이 절차는 비교적 긴하지만, 그것은 고립 된 림프구의 추가 사용에 따라 간소화 할 수 있습니다. 세포 등 유동 세포 계측법 분석 같은 비 기능 assays에 사용하는 경우, 상기 방법은 Percoll 그라데이션 단계를 건너 뛰는하여 누전이 될 수 있습니다. 이 방법은 점막 림프구을 연구하고 전염성 질병 연구에 통찰력을 제공 후속 백신 개발을 촉진 할 강력하고 효율적인 도구를 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 기금 보조금 R01-AI026328 (KAK) 및 R01-AI079004 (KAK)에 대한 NIH에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
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