Isolering av Lymfocytter fra Mouse kjønnsorgan Mucosa

Summary

En effektiv måte å isolere lymfocytter fra mus kjønnsorgan er beskrevet. Denne metoden drar nytte av enzym fordøyelse og Percoll gradient separasjon å tillate effektiv isolasjon. Denne teknikken er også tilpasses for bruk i andre arter

Abstract

Mucosal overflater, inkludert i de gastrointestinale, urogenitale og luftveier, gi portaler for oppføring av patogener, som for eksempel virus og bakterier ^en. Slimhinner er også induktive nettsteder i verten for å generere immunitet mot patogener, slik som Peyers flekker i tarmkanalen og nasal-assosiert lymforetikulære vev i luftveiene. Denne unike funksjonen gir mucosal immunitet som en avgjørende spiller verten forsvar. Mange studier har vært fokusert på gastrointestinale og luftveier mucosal nettsteder. Imidlertid har det vært liten undersøkelse av reproduktive mucosal nettsteder. Genital skrift mucosa er den primære infeksjon nettstedet for seksuelt overførbare sykdommer (STD), inkludert bakterielle og virale infeksjoner. Kjønnssykdommer er en av de mest kritiske helsemessige utfordringene verden står overfor i dag. Centers for Disease Control and Prevention anslår at det er 19 millioner nye smittsomme hvert år i USA. STDs koste det amerikanske helsevesenet $ 17 milliard hvert år ^to, og kostnader enkeltpersoner enda mer i umiddelbar og livslang helsemessige konsekvenser. For å konfrontere denne utfordringen, er en større forståelse av reproduktive mucosal immunitet nødvendig og isolere lymfocytter er en viktig del av disse studiene. Her presenterer vi en metode for å reproduserbart isolere lymfocytter fra murine kvinnelige genital trakter immunologiske studier som kan endres for tilpasning til andre arter. Metoden som er beskrevet under er basert på en mus.

Protocol

1. Fjerning av kjønnsorgan

1. Avlive musen med vedtatte retningslinjer. Gjør lav midtlinjesnitt og trekke huden.
2. Isolere og fjerne hele kjønnsorgan, fra egglederen til skjedeåpningen.
3. Åpne hele tarmkanalen i lengderetningen med saks.
4. Skjær kjønnsorganer med fine kirurgiske sakser til fine stykker (ca <1mm) i en petriskål med Komplett RPMI-10/EDTA (se formelen nedenfor) og omrør vevet i 125 ml kolbe ved romtemperatur på en magnetrører satt for 15 min. Denne prosedyren gjentas to ganger og deretter supernatanten, som inneholder epitel og annet rusk, blir forkastet.
5. Hell innholdet i kolben gjennom en celle sil (40μm). Vask EDTA rester med komplett medium.
   Komplett RPMI/10: RPMI 500 ml (Gibco), 10% føtalt bovint serum (FBS), varme-inaktivert, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml 1 M HEPES.
   Komplett RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (som ovenfor) med 5μM EDTA

2. Bearbeider kjønnsorgan vev

1. Overføre vev brikkene til en ny kolbe med 20 ml fersk RPMI-10/collagenase (se oppskriften nedenfor) og fordøye vevet ved 37 ° C i 1 time på en magnetrører satt til kraftig røre vevet.
   Komplett RPMI-10/collagenase: Rett før bruk rekonstitueres collagenase typen VIII (Sigma, oppbevar ved -20 ° C, eller i henhold til produsentens instruksjoner.), Legge inn fullstendig RPMI/10 til en endelig konsentrasjon på 450-500U/ml.
2. Etter den første fordøyelsen, samle supernatants gjennom 100 mikrometer celle sil, holde cellene på is.
3. Overfør ufordøyd vevet til en ny kolbe og gjenta trinn 2,1 to ganger ved hjelp av fersk komplett RPMI-10/collagenase for totalt 3 separate digestions. På dette punktet, bør ingen synlige vev stykk være i løsning.
4. Pool all supernatantene sammen fra en prøve og samle gjennom 100 mikrometer celle sil. Spinn calen ned. Celle pellets vil bli separert ved hjelp Percoll gradienter.

3. Skille genitale celler ved hjelp Percoll gradienter

1. Forbered hver konsentrasjon av Percoll før bruk:
   • 100% isoton Percoll: mix 09:01 lager Percoll (Pharmacia Biotch) vs 10x PBS. pH det til 7,4 ved hjelp av HCL.
   • 40% Percoll-løsning: Bland 40 ml av 100% isotonisk Percoll og 60 ml komplett RPMI.
   • 70% Percoll-løsning: blanding 70 ml av 100% isotonisk Percoll med 30 ml komplett RPMI.
2. Resuspender hver cellepellet fra trinn 6 i 40% Percoll løsninger. Et likt volum av 70% Percoll vil bli brukt til å lage de gradienter. Det er to måter å sette opp gradient rør:
   1. Under-lag: legg cellesuspensjon med 40% Percoll i en gradient tube først, deretter forsiktig under-lag 70% Percoll.
   2. Over-lag: legg 70% Percoll i røret først, deretter forsiktig og langsomt laste 40% Percoll inneholder cellene påtoppen.
3. Gradient prøver vil bli sentrifugeres @ 900 xg, romtemperatur, i 20 minutter med brems.
4. Lymfocyttene vil være på grensesjiktnivået mellom 40% og 70% Percoll lag. Nøye høste grensesjiktnivået, vask med RPMI 01:03 og spinne ned på 740 xg. Lymfocyttene vil være i cellepelleten og er klare for videre bruk.

4. Representant Resultater

Et eksempel på isolasjon av lymfocytter fra mus kjønnsorganer og flowcytometri (FACS) analyse er vist i figur 1. Kjønnsorgan ble fjernet fra Chlamydia muridarum intravaginalt smittet mus 7 dager etter smitte. To genital traktene ble samlet sammen for å ha nok lymfocytter for funksjonell og fenotype undersøkelse av FACS. Dissekert vev ble behandlet av fordøyelsen og isolasjon trinnene som beskrevet ovenfor. Den enkel cellesuspensjon ble farget for ulike fluorokromkonjugerte konjugertmonoklonale antistoffer mot mus CD3, CD4 og CD8. Fig. 1 viser et prikk-plot presentasjon av CD4 positive T-celler versus CD8-positive T-celler med gating på CD3 positive T-lymfocytter. Vår prosedyre kan undersøke lymfocytter isolert fra genital områder med ulike sykdommer modeller for å vurdere ulike immunceller funksjonelle og fenotypisk egenskaper i ulike sykdommer i mus modell. Disse inkluderer diverse immunceller, slik som dendrittiske celler, nøytrofile, makrofager NK, NKT, T-celler (Ag-spesifikke T-celler), B-celler etc. ^3-10.

Figur 1. Lymfocytter ble isolert fra genital områder med mus infisert med klamydia muridarum, som bruker metoden som presenteres her. Etter den fullstendige separasjonen prosedyren, ble lymfocytter farget med fluorokrom-konjugerte CD3, CD4 og CD8. The Quadrant data var separert på CD3 + lymfocytter,viser CD4 + versus CD8 + med og prosentandel av gated celler.

Discussion

I denne protokollen, er det vist hvordan å forberede lymfocytter fra mus genital tracts og er lett mestret. Den mest kritiske punktet i denne prosessen er å opprettholde cellelevedyktighet ved å holde cellene på is. Cellen utbytte fra denne metoden avhenger teknikk, håndtering dyktighet, smittsomme status musen (naiv eller dag etter infeksjon), patogen (bakteriell, virus-, sopp) og den delen av den murine reproduktive tarmkanalen undersøkt (egglederen, livmor, vaginal segment eller hele kjønnsorgan). Vår gruppe og andre har publisert flere studier på ulike lymfocyttpopulasjoner fra mus kjønnsorgan ^5-7. På våre hender, fra én naiv BALB / c mus, kan hele kjønnsorgan generere 2 × 10 ⁶ celler med 90% levedyktighet. I mange tilfeller, vil lymfocytter bli brukt for ytterligere funksjonelle og / eller flowcytometrisk analyse ^3-10. I sammenligning med brukte isolasjon metode ^11, av vår metode, cell avkastning er økt 10 ganger. Denne prosedyren er relativt lang, men det kan forenkles avhengig av videre bruk av isolerte lymfocytter. Når cellene brukes til ikke-funksjonelle analyser som strømningscytometri analyse, kan metoden være kortsluttet ved å hoppe Percoll gradient trinn. Denne metoden gir en kraftig og et effektivt verktøy for å studere mucosal lymfocytter og gi innsikt i smittevern forskning, lette senere vaksineutvikling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase	Sigma Life Sciences	C2139-1G
Percoll	GE Healthcare Bio-Sciences	17-0891-01
RPMI1640	Gibco by Life Technologies	11875