Summary
Эффективный способ изолировать тракта лимфоциты мыши половых описано. Этот метод использует фермент переваривания и Percoll разделения градиента, чтобы обеспечить эффективное изоляции. Эта методика также адаптируется к для использования в других видах
Abstract
Слизистых поверхностей, в том числе желудочно-кишечного тракта, мочеполовых и дыхательных путей, обеспечивают порталы для проникновения патогенов, таких как вирусы и бактерии 1. Слизистые оболочки также индуктивных сайтов в принимающей для создания иммунитета против патогенов, таких как патчи Peyers в желудочно-кишечном тракте и носовой связанных лимфоретикулярных ткани в дыхательных путях. Эта уникальная функция дает иммунитет слизистой оболочки в качестве важнейшего игрока в системе защиты организма. Многие исследования были направлены на желудочно-кишечного и респираторного слизистой сайтов. Тем не менее, наблюдается небольшое исследование репродуктивного слизистой сайтов. Слизистой оболочки половых путей является основной сайт инфекции, передаваемые половым путем (ЗППП), в том числе бактериальных и вирусных инфекций. ЗППП являются одной из наиболее важных проблем в области здравоохранения, стоящих перед миром сегодня. Центры по контролю и профилактике заболеваний считает, что существует 19 миллионов новых инфекционных каждый год в Соединенных Штатах. STDs стоить здравоохранения США системы 17 миллиардов долларов каждый год 2, и стоимость лиц еще в непосредственном и пожизненные последствия для здоровья. Для того, чтобы противостоять этой задачей, более глубокое понимание репродуктивной иммунитет слизистой оболочки необходимы и выделения лимфоцитов является важным компонентом этих исследований. Здесь мы представляем метод воспроизводимо изолировать лимфоцитов из мышиных женских половых путей для иммунологических исследований, которые могут быть модифицированы для адаптации к другим видам. Описанный ниже метод основан на одной мыши.
Protocol
1. Удаление половых путей
- Усыпить мыши с использованием утвержденных принципов. Сделать низкой средней линии разреза и убрать кожу.
- Изолировать и удалять целые половых путей, из яйцевода в вагинальное отверстие.
- Открыть весь тракт продольно с ножницами.
- Вырезать половых путей с мелкими хирургическими ножницами на мелкие кусочки (примерно <1 мм) в чашку Петри с полной RPMI-10/EDTA (см. формулу ниже) и перемешать ткани в 125 мл колбу при комнатной температуре на магнитной мешалки установлен для 15 мин. Эта процедура повторяется дважды, а затем супернатант, который содержит эпителия и другого мусора, отбрасывается.
- Вылейте содержимое колбы через ячейки сетчатого фильтра (40 мкм). Смойте остатки EDTA с полной среде.
Полное RPMI/10: 500 мл RPMI (Gibco), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), инактивированной нагреванием, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл 1М HEPES.
Полное RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (см. выше) с 5 мкм EDTA
2. Дайджест ткани гениталий тракта
- Передача части ткани в новую колбу с 20 мл свежего RPMI-10/collagenase (см. рецепт ниже) и переваривать ткань при 37 ° С в течение 1 ч на магнитной мешалки установлен энергично размешать ткани.
Полное RPMI-10/collagenase: Прямо перед использованием, восстановить коллагеназы типа VIII (Sigma; хранить при -20 ° C, или в соответствии с инструкциями производителя.), Добавить в полном RPMI/10 до конечной концентрации 450-500U/ml. - После первого пищеварения, собирают супернатанты через сито 100 мкм клетки, удерживает клетки на льду.
- Передача непереваренной ткани в новую колбу и повторите шаг 2,1 еще два раза с использованием свежих полных RPMI-10/collagenase на общую сумму 3 отдельных пищеварения. На данный момент, никаких видимых частей ткани должны быть в растворе.
- Бассейн все супернатанты вместе с образца и собираем через сито 100 мкм клетки. Побочные слоктя вниз. Сотовые гранулы будут разделены с использованием Percoll градиентов.
3. Разделение половых клеток путей использования Percoll градиентов
- Подготовка каждой концентрации Percoll перед использованием:
- 100% изотонический Percoll: смешайте 9:01 складе Percoll (Pharmacia Biotch) по сравнению с 10-кратным PBS. рН его до 7,4 использовании HCL.
- 40% Percoll решение: смешать 40 мл 100% изотонический Percoll и 60 мл полной RPMI.
- 70% Percoll решение: смешать 70 мл 100% изотонический Percoll с 30 мл полной RPMI.
- Ресуспендируют каждой ячейки гранул, начиная с шага 6 в 40% решений Percoll. Равном объеме 70% Percoll будет использоваться, чтобы сделать градиентов. Есть два способа создать градиент труб:
- Под слоем: добавить клеточной суспензии с 40% Percoll в градиенте трубки, а затем осторожно под слоем 70% Percoll.
- За слоя: добавить 70% Percoll в трубку, а затем осторожно и медленно загружается 40% Percoll содержащие клетки насверху.
- Градиент образцы будут центрифугировали при 900 х г при комнатной температуре в течение 20 мин с тормозом прочь.
- Лимфоцитов будет на уровне интерфейса между 40% и 70% слоев Percoll. Осторожно собрать интерфейс слой, промывают RPMI 1:3 и спином вниз на 740 мкг. Лимфоцитов будет в осадок клеток и готовы к дальнейшему использованию.
4. Представитель Результаты
Пример выделения лимфоцитов мыши половых путей и проточной цитометрии (FACS) анализ показано на рисунке 1. Генитальный тракт был отстранен от хламидий muridarum интравагинально инфицированных мышей 7 дней после заражения. Два половых путей были объединены вместе для того, чтобы иметь достаточно лимфоцитов для функционального и фенотип рассмотрение FACS. Расчлененный ткани были обработаны пищеварения и выделения шаги, как описано выше. Суспензии отдельных клеток окрашивали для различных флуорохромом сопряженныхмоноклональных антител против CD3 мыши, CD4 и CD8. На рисунке 1 показан сюжет точка-презентация CD4 + Т-клеток CD8 сравнению с положительным Т-клеток CD3 закрытого на положительные Т-лимфоциты. Наша процедура может исследовать лимфоциты изолированы из половых путей различных моделей болезней для оценки различных иммунных клеток, функциональные и фенотипические характеристики при различных заболеваниях в мышиной модели. Они включают в себя разнообразные иммунные клетки, такие как дендритные клетки, нейтрофилы, макрофаги, NK, NKT, Т-клетки (Ag-специфических Т-клеток), В-клетки и т.д. 3-10.
Рисунок 1. Лимфоциты выделяли из половых путей мышей, зараженных Chlamydia muridarum, используя метод, представленный здесь. После полной процедуры разделения, лимфоциты были окрашены флуорохромом сопряженных CD3, CD4 и CD8. Квадрант данные были закрытом на CD3 + лимфоцитов,показывающие CD4 + CD8 + по сравнению с и процент закрытых ячеек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, показано, как подготовить лимфоциты мыши половых путей и легко освоили. Наиболее критическая точка этого процесса является поддержание жизнеспособности клеток, сохраняя клетки на льду. Выход клеток из этого метода зависит от техники, обработки мастерство, инфекционные состояния мыши (или наивные день после заражения), возбудителя (бактериальные, вирусные, грибковые) и части мышиного репродуктивного тракта обследованных (яйцевод, матку, вагинальные сегмента или всей половых путей). Наша группа и другие опубликовали различные исследования на разных популяций лимфоцитов мыши из половых путей 5-7. На наших руках, от одного наивного BALB / с мышью, всего половых путей может генерировать 2 × 10 6 клеток на 90% жизнеспособность. Во многих случаях, лимфоциты будут использованы для дальнейшего функционального и / или проточной цитометрии 3-10. По сравнению с обычно используется метод изоляции 11, по нашему методу, сеLL доходность увеличилась в 10 раз. Эта процедура является относительно долго, но это может быть упрощена в зависимости от дальнейшего использования выделенных лимфоцитов. Когда клетки используют для нефункциональных анализы, такие как анализ потока цитометрии, этот метод может быть замкнут, пропуская Percoll шаг градиента. Этот метод обеспечивает мощный и эффективный инструмент для изучения слизистой оболочки лимфоцитами и обеспечить понимание исследований в области инфекционных заболеваний, облегчения последующей разработки вакцины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить NIH гранты для финансирования R01-AI026328 (КАК) и R01-AI079004 (КАК).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
- M, The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation. Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).
- Centers for Disease Control and Prevention. 2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).
- Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen. Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).
- Tang, V. A., Rosenthal, K. L. Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract. J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).
- Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue. J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).
- Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina. Immunology. 114, 213-224 (2005).
- Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides. J. Virol. 79, 393-400 (2005).
- Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).
- Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection. Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).
- Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model. J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).
- Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract. Virology. , 224-487 (1996).
