Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av lymfocyter från mus könsorgan Mucosa

Published: September 3, 2012 doi: 10.3791/4391

Summary

Ett effektivt sätt att isolera lymfocyter från mus könsorgan beskrivs. Denna metod drar fördel av enzymnedbrytning och PercoU gradientseparation att tillåta effektiv isolering. Denna teknik är också anpassningsbar att användas i andra arter

Abstract

Slemhinneytor, även i de gastrointestinala, urogenitala och andningsorgan, ge portaler för inresa för patogener, såsom virus och bakterier 1. Slemhinnor är också induktiva platser i värden för att generera immunitet mot patogener, såsom Peyers fläckar i tarmkanalen och nasal-associerade lymforetikulär vävnad i luftvägarna. Denna unika funktion ger slemhinneimmunitet som en viktig aktör i den mottagande försvarssystem. Många studier har fokuserat på gastrointestinala och respiratoriska slemhinnor. Däremot har det varit liten undersökning av reproduktiva slemhinnor. Könsorganen slemhinna är det primära infektionen platsen för sexuellt överförbara sjukdomar (STD), inklusive bakterie-och virusinfektioner. STD är en av de mest kritiska hälsoutmaningar som världen står inför i dag. Centers for Disease Control and Prevention uppskattar att det finns 19 miljoner nya smittsamma varje år i USA. STDs kostar det amerikanska sjukvårdssystemet $ 17000000000 varje år 2 och kostnader individer ännu mer omedelbara och livslånga konsekvenser för hälsan. För att möta denna utmaning är en större förståelse för reproduktiv slemhinneimmunitet behövs och isolera lymfocyter är en viktig del av dessa studier. Här presenterar vi en metod för att reproducerbart isolera lymfocyter från murina kvinnliga genitala skrifter för immunologiska studier som kan modifieras för anpassning till andra arter. Metoden som beskrivs nedan är baserad på en mus.

Protocol

1. Borttagning av genitalierna

  1. Avliva musen med godkända riktlinjer. Gör låg mittlinjesnitt och dra hud.
  2. Isolera och ta bort hela könsorgan, från äggledaren till slidöppningen.
  3. Öppna hela tarmkanalen longitudinellt med en sax.
  4. Skär könsorganen med fina kirurgiska saxar till fina bitar (cirka <1 mm) i en petriskål med Komplett RPMI-10/EDTA (se formel nedan) och rör vävnaden i 125 ml kolv vid rumstemperatur på en magnetisk omrörare inställd för 15 minuter. Detta förfarande upprepas två gånger och sedan supernatanten, som innehåller epitelet och annat skräp, kasseras.
  5. Häll innehållet i kolven genom en cellfilter (40 pm). Tvätta EDTA rest med komplett medium.
    Komplett RPMI/10: RPMI 500 ml (Gibco), 10% fetalt bovint serum (FBS), värmeinaktiverat, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml 1 M HEPES.
    Komplett RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (som ovan) med 5 pM E
    DTA

2. Smälta könsorgan vävnad

  1. Överför vävnadsbitar till en ny kolv med 20 ml färsk RPMI-10/collagenase (se recept nedan) och smälta vävnaden vid 37 ° C under 1 timme på en magnetomrörare inställd att kraftfullt röra vävnaden.
    Komplett RPMI-10/collagenase: Precis innan användning, rekonstituera kollagenas typ VIII (Sigma, förvara vid -20 ° C eller enligt tillverkarens anvisningar.), Lägg i fullständig RPMI/10 till en slutlig koncentration av 450-500U/ml.
  2. Efter den första matsmältning, samla supernatanter genom 100 nm cell sil, hålla cellerna på is.
  3. Överför osmält vävnad till en ny kolv och upprepa steg 2,1 två gånger med färska komplett RPMI-10/collagenase för sammanlagt 3 separata digereringar. Vid det här laget bör inga synliga vävnadsbitar vara i lösning.
  4. Pool på alla supernatanterna tillsammans från ett prov och samla igenom 100 nm cell sil. Snurra calnar ned. Cellpelletar kommer att separeras med Percoll gradienter.

3. Separera genitalsekret celler med användning PercoU-gradienter

  1. Förbered varje koncentration av Percoll före användning:
    • 100% isoton Percoll: blanda 09:01 lager Percoll (Pharmacia Biotch) vs 10x PBS. pH till 7,4 med HCl.
    • 40% Percoll-lösning: blanda 40 ml 100% isoton Percoll och 60 ml komplett RPMI.
    • 70% Percoll-lösning: blanda 70 ml 100% isotonisk PercoU med 30 ml komplett RPMI.
  2. Resuspendera varje cellpellet från steg 6 i 40% Percoll-lösningar. En lika stor volym 70% Percoll kommer att användas för att göra gradienterna. Det finns två sätt att ställa in lutning rör:
    1. Under-lager: lägg cellsuspension med 40% Percoll i en gradient rör först och sedan försiktigt under-lager 70% Percoll.
    2. Över-skikt: lägg 70% Percoll i röret först, sedan försiktigt och långsamt ladda 40% Percoll innehållande cellerna påtoppen.
  3. Gradient prover centrifugeras @ 900 xg, rumstemperatur, under 20 min med bromsen avstängd.
  4. Lymfocyterna är vid gränsytan mellan skiktet 40% och 70% Percoll skikten. Försiktigt skörda gränsyteskiktet, tvätta med RPMI 1:3 och spinn ner på 740 xg. Lymfocyterna kommer att vara i cellpelleten och är redo för ytterligare användning.

4. Representativa resultat

Ett exempel på isolering av lymfocyter från mus könsorgan och flödescytometri (FACS)-analys visas i figur 1. Könsorgan togs bort från Chlamydia muridarum intravaginalt infekterade mus 7 dagar efter infektion. Två genitala skrifter slogs samman för att få tillräckligt med lymfocyter för funktionell och fenotyp undersökning av FACS. Dissekerade vävnader behandlas av matsmältningen och steg isolering enligt ovan. Den enda cellsuspensionen färgades för olika fluorokrom-konjugeradmonoklonala antikroppar mot mus CD3, CD4 och CD8. Figur 1 visar en dot-plot presentation av CD4-positiva T-celler jämfört CD8 positiva T-celler gated på CD3-positiva T-lymfocyter. Vår procedur kan undersöka lymfocyter isolerade från genitala områden av olika sjukdomsmodeller för att bedöma olika immunceller funktionella och fenotypiska egenskaper i olika sjukdomar i musmodell. Dessa inkluderar olika immunceller, såsom dendritiska celler, neutrofiler, makrofager NK, NKT, T-celler (Ag-specifika T-celler), B-celler etc. 3-10.

Figur 1
Figur 1. Lymfocyter isolerades från genitala områden av möss infekterade med Chlamydia muridarum, med användning av metoden som presenteras här. Efter fullständig separation förfarandet lymfocyter färgades med fluorokrom-konjugerade CD3, CD4 och CD8. Kvadranten data var gated på CD3 + lymfocyter,visar CD4 + kontra CD8 + med och andel gated celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll visas det hur du förbereder lymfocyter från mus genitala skrifter och är lätt behärskar. Den mest kritiska punkten av denna process är att upprätthålla cellviabiliteten genom att hålla cellerna på is. Cellen Utbytet från denna metod beror på teknik, hantering skicklighet, smittsam status hos musen (naiva eller dagen efter infektion), patogenen (bakterie, virus, svamp) och den del av den murina reproduktionsorganen undersökta (äggledare, livmoder, vaginal segment eller hela könsorgan). Vår grupp och andra har publicerat flera studier på olika lymfocytpopulationer från mus könsorgan 5-7. På våra händer, från en naiv BALB / c-mus, kan hela könsorgan genererar 2 x 10 6 celler med 90% viabilitet. I många tillfällen kommer lymfocyterna användas för vidare funktionella och / eller flödescytometrisk analys 3-10. I jämförelse med den vanligen använda isoleringsmetoden 11, genom vår metod, cell avkastning ökar 10 gånger. Detta förfarande är relativt lång, men den kan förenklas beroende på den fortsatta användningen av isolerade lymfocyter. När cellerna används för icke-funktionella analyser såsom flödescytometrianalys, kan förfarandet vara kortsluten genom att hoppa PercoU-gradient steg. Denna metod ger ett kraftfullt och effektivt verktyg för att studera slemhinnor lymfocyter och ge insikt i infektionssjukdomar forskning, underlätta efterföljande vaccinutveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi vill tacka NIH för finansiering bidrag R01-AI026328 (KAK) och R01-AI079004 (KAK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase Sigma Life Sciences C2139-1G
Percoll GE Healthcare Bio-Sciences 17-0891-01
RPMI1640 Gibco by Life Technologies 11875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. M, The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation. Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).
  2. Centers for Disease Control and Prevention. 2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).
  3. Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen. Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).
  4. Tang, V. A., Rosenthal, K. L. Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract. J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).
  5. Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue. J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).
  6. Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina. Immunology. 114, 213-224 (2005).
  7. Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides. J. Virol. 79, 393-400 (2005).
  8. Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection. Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).
  9. Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection. Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).
  10. Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model. J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).
  11. Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract. Virology. , 224-487 (1996).

Tags

Immunologi slemhinneimmunitet sexuellt överförbara sjukdomar könsorgan lymfocyter lymfocytisolering flödescytometri
Isolering av lymfocyter från mus könsorgan Mucosa
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, J., Kelly, K. A. Isolation of More

Jiang, J., Kelly, K. A. Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa. J. Vis. Exp. (67), e4391, doi:10.3791/4391 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter