Summary
Ein effizienter Weg, um Lymphozyten, die aus Maus Genitaltrakt isolieren beschrieben. Diese Methode nutzt Enzym Verdauung und Percoll Gradienten Trennung effiziente Isolierung ermöglichen. Diese Technik ist auch anpassbar für die Verwendung in anderen Spezies
Abstract
Schleimhäute, einschließlich in den Magen-Darm-, Urogenital-, und Atemwege bieten Eintrittspforten für Krankheitserreger wie Viren und Bakterien ein. Schleimhäute sind auch induktive Plattformen mit dem Host, um Immunität gegen Pathogene, wie etwa die Peyer-Plaques im Darmtrakt und der nasalen-assoziierten lymphoretikulären Gewebe im Atemtrakt zu erzeugen. Dieses einzigartige Feature bringt Schleimhaut-Immunität als ein entscheidender Spieler des Abwehrsystem. Viele Studien haben sich auf gastrointestinalen und respiratorischen Schleimhaut Standorten konzentriert. Allerdings gibt es nur wenige Untersuchungen der reproduktiven Schleimhäute. Der Genitaltrakt Schleimhaut ist die primäre Infektion Website für sexuell übertragbare Krankheiten (STD), einschließlich bakterielle und virale Infektionen. Geschlechtskrankheiten sind eine der wichtigsten gesundheitlichen Herausforderungen der heutigen Welt. Centers for Disease Control and Prevention schätzt, dass es 19 Millionen neuer infektiöser jedes Jahr in den Vereinigten Staaten. STDs kostet das US-Gesundheitssystem $ 17000000000 jedes Jahr 2 und Kosten Individuen noch in unmittelbarer und lebenslanges gesundheitlichen Folgen. Um dieser Herausforderung zu begegnen, ist ein besseres Verständnis der reproduktiven Schleimhaut-Immunität benötigt und Isolierung Lymphozyten ist ein wesentlicher Bestandteil dieser Studien. Hier präsentieren wir eine Methode, um reproduzierbare Isolierung von Lymphozyten aus murinen weiblichen Genitaltrakt für immunologische Studien, die zur Anpassung an andere Arten modifiziert werden können. Das nachfolgend beschriebene Verfahren ist auf einer Maus.
Protocol
Ein. Das Entfernen des Genitaltraktes
- Euthanize die Maus über die Leitlinien gebilligt. Machen niedrigen Mittellinienschnitt und Einfahren Haut.
- Isolieren und entfernen ganzen Genitaltrakt von Eileiter zur vaginalen Öffnung.
- Öffnen Sie den gesamten Trakt längs mit einer Schere.
- Schneiden Sie den Genitaltrakt mit feinen chirurgische Schere in feine Stücke (etwa <1 mm) in einer Petrischale mit Complete RPMI-10/EDTA (siehe Formel unten) und rühren Sie das Gewebe in 125 ml Kolben bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer Set für 15 min. Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt und anschließend der Überstand, der Epithel und andere Verunreinigungen enthält, wird verworfen.
- Gießen Inhalt des Kolbens durch eine Zelle Sieb (40 um). Abwaschen EDTA Rückstand mit Vollmedium.
Komplette RPMI/10: 500 ml RPMI (Gibco), 10% fötalem Rinderserum (FBS), hitzeinaktiviertes, 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml 1M HEPES.
Komplette RPMI-10/EDTA: 10% RPMI (wie oben) mit 5 &mgr; EDTA
2. Verdauen Genitaltrakt Gewebe
- Übertragen Gewebestücke zu einer neuen Flasche mit 20 ml frisches RPMI-10/collagenase (siehe Rezept unten) und verdauen das Gewebe bei 37 ° C für 1 Stunde auf einem Magnetrührer auf kräftig rühren das Gewebe.
Komplette RPMI-10/collagenase: Kurz vor Gebrauch rekonstituieren Collagenase Typ VIII (Sigma; bei -20 ° C, oder nach den Anweisungen des Herstellers.), In komplette RPMI/10 hinzufügen einer Endkonzentration von 450-500U/ml. - Nach der ersten Verdauung, sammeln Überstände durch 100 um Zellsieb, halten die Zellen auf Eis.
- Übertragen die unverdaute Gewebe zu einem neuen Kolben und wiederhole Schritt 2.1 noch zweimal mit frischem Komplettmedium RPMI-10/collagenase für insgesamt 3 separaten Aufschlüsse. An diesem Punkt sollte keine sichtbaren Gewebestücke in Lösung sein.
- Pool die alle Überstände zusammen aus einer Probe und sammeln über 100 um Zellsieb. Drehen Sie das cEllen tief herunter. Zellpellets werden getrennt mit Percoll Gradienten werden.
3. Trennung Genitaltrakt Zellen mit Percoll Gradienten
- Bereiten Sie jede Konzentration von Percoll vor dem Gebrauch:
- 100% ige isotonische Percoll: mix 09.01 Lager Percoll (Pharmacia Biotch) vs 10x PBS. pH ist auf 7,4 mit HCL.
- 40% Percoll-Lösung: 40 ml Mischung aus 100% isotonischer Percoll und 60 ml vollständigem RPMI.
- 70% Percoll-Lösung: mix 70 ml 100% ige isotonische Percoll mit 30 ml komplettem RPMI.
- Resuspendieren jede Zelle Pellet aus Schritt 6 in 40% Percoll-Lösungen. Ein gleiches Volumen von 70% Percoll wird verwendet, um die Gradienten zu machen. Es gibt zwei Möglichkeiten zum Einrichten Gradienten Röhren:
- Unter-Schicht: add Zellsuspension mit 40% Percoll in einem Gradienten Rohr, dann vorsichtig unter-Schicht 70% Percoll.
- Überlagerungsschicht: in 70% Percoll in das Rohr zuerst, dann vorsichtig und langsam geladen werden 40% Percoll, welche die Zellen auf dietop.
- Gradient Proben @ 900 xg, Raumtemperatur zentrifugiert werden, für 20 min mit der Bremse ab.
- Die Lymphozyten werden an der Grenzschicht zwischen 40% und 70% Percoll Schichten sein. Sorgfältig ernten die Grenzschicht, waschen mit RPMI 1:3 und Spin-Down bei 740 xg. Die Lymphozyten werden im Zellpellet sein und sind zur weiteren Verwendung bereit.
4. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel der Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genitaltrakt und Durchflusszytometrie (FACS)-Analyse ist in Abbildung 1 gezeigt. Genitaltrakt wurde von Chlamydia muridarum entfernt intravaginal infiziert Maus 7 Tage nach der Infektion. Zwei Genitaltrakt wurden zusammen, um genügend Lymphozyten zur funktionellen Untersuchung und Phänotyp durch FACS haben gepoolt. Seziert Gewebe wurden durch die Verdauung und Isolierungsschritte wie oben verarbeitet. Die einzelne Zellsuspension wurde für verschiedene Fluorochrom-konjugierten angefärbtmonoklonale Antikörper gegen den Maus-CD3, CD4 und CD8. Abbildung 1 zeigt eine Dot-Plot Darstellung der CD4-positiven T-Zellen im Vergleich zu CD8-positiven T-Zellen aufgetastet CD3 positive T-Lymphozyten. Unser Verfahren untersuchen können Lymphozyten aus Genitaltrakt verschiedener Krankheitsmodelle isoliert verschiedenen Immunzellen funktionelle und phänotypische Merkmale bei verschiedenen Krankheiten im Mausmodell zu beurteilen. Dazu gehören verschiedene Immunzellen, wie dendritische Zellen, Neutrophilen, Makrophagen NK, NKT, T-Zellen (Ag-spezifischen T-Zellen), B-Zellen usw. 3-10.
Abbildung 1. Lymphozyten wurden aus Genitaltrakt von Mäusen mit Chlamydia muridarum infiziert isoliert, mit dem hier vorgestellten Verfahren. Nach der vollständigen Trennung Verfahren wurden Lymphozyten mit Fluorochrom-konjugierten CD3, CD4 und CD8 gefärbt. Die Quadranten Daten waren gated auf CD3 +-Lymphozyten,zeigt CD4 + gegenüber CD8 + mit und Prozentsatz der gated Zellen.
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Discussion
In diesem Protokoll wird gezeigt, wie man von Maus-Lymphozyten Genitaltrakt vorzubereiten und wird leicht beherrschen. Der kritischste Punkt bei diesem Verfahren ist, um die Zellviabilität, indem die Zellen auf Eis erhalten. Die Zellausbeute aus dieser Methode hängt von Technik, Handhabung Geschicklichkeit, den infektiösen Zustand der Maus (naive oder Tage nach Infektion), die Erreger (Bakterien, Viren, Pilze) und den Abschnitt des murinen Reproduktionstrakt geprüft (Eileiter, der Gebärmutter, vaginalen Bereich oder die gesamte Genitalbereich). Unsere Gruppe und andere haben verschiedene Studien auf verschiedenen Lymphozyten-Populationen aus Maus Genitaltrakt 5-7 veröffentlicht. Auf unseren Händen, von einem naiven BALB / c Maus, können ganze Genitaltrakt zu generieren 2 × 10 6 Zellen mit 90% Lebensfähigkeit. In vielen Fällen werden die Lymphozyten für die weitere funktionelle und / oder Durchflusszytometrieanalyse 3-10 verwendet werden. Im Vergleich zu den üblicherweise verwendeten Isolierungsverfahren 11, mit unserer Methode, die cell Ausbeute 10 Mal erhöht. Dieses Verfahren ist relativ lang, aber es kann vereinfacht je nach weiterer Verwendung der isolierten Lymphozyten werden. Wenn die Zellen nicht-funktionellen Assays wie Durchflusszytometrie-Analyse verwendet werden, kann das Verfahren kurzgeschlossen werden dabei Percoll Gradientenstufe. Diese Methode bietet eine leistungsstarke und ein effizientes Instrument zur mukosalen Lymphozyten studieren und geben einen Einblick in Erforschung infektiöser Krankheiten, zu erleichtern spätere Entwicklung von Impfstoffen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten NIH für die Finanzierung Zuschüsse R01-AI026328 (KAK) und R01-AI079004 (KAK) danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma Life Sciences | C2139-1G | |
| Percoll | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0891-01 | |
| RPMI1640 | Gibco by Life Technologies | 11875 |
References
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