Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

החרקים Published: December 11, 2012 doi: 10.3791/4392
Automatic Translation
1, 1, 1
1INRA, Micalis UMR1319, France

Summary

זיהום haemocolic אוראלי ותוך של זחלים של עש השעווה הגדולה יותר

Abstract

המחקר של חיידקים ארסיים לעתים קרובות מחייב מודל חיה מתאימה. מודלי יונקים של זיהום הם יקרים ועשויים להעלות סוגיות אתיות. השימוש בחרקים כמודל לזיהום מספק חלופה רבה ערך. בהשוואה למארחי מודל שאינם בעלי חוליות אחרים, כגון נמטודות, חרקים יש מערכת מתקדמת יחסית של הגנות מיקרוביאלית ולכן הם נוטים יותר להפקת מידע רלוונטי לתהליך ההדבקה של יונקים. כמו יונקים, חרקים בעלי מערכת חיסון מולדת מורכבת 1. תאים בhemolymph מסוגלים phagocytosing או encapsulating פולשי מיקרוביאלי, ותגובות הומורלית כוללות ייצור המושרה של פפטידים Lysozyme והקטנים אנטיבקטריאליות 2,3. בנוסף, אנלוגיות נמצאות בין תאי האפיתל של midguts זחל חרקים ותאי מעי מערכת עיכול של יונקים. לבסוף, מספר מרכיבים בסיסיים חיוניים לתהליך זיהום החיידקים כגון הידבקות תא, התנגדותפפטידים מיקרוביאלית, ניוון רקמות ואת ההסתגלות לסטרס חמצונים, סביר שיהיה חשוב בשני חרקים ויונקים 1. לכן, חרקים הם כלים רבים ערכיים לזיהוי והאפיון של גורמים ארסיים מיקרוביאלי המעורב בזיהומים ביונקים.

זחלים של העש הגדול שעוות Galleria mellonella הוכחו לספק תובנה שימושית לפתוגנזה של מגוון רחב של זיהומים מיקרוביאליים כוללים פטרייתי יונקים (Fusarium oxysporum, אספרגילוס fumigatus, קנדידה אלביקנס) וחיידקים פתוגנים, כגון סטפילוקוקוס אוראוס, vulgaris פרוטאוס , Aeruginosa Serratia marcescens Pseudomonas, monocytogenes יסטריה או Enterococcus faecalis 4-7. ללא קשר למיני חיידקים, תוצאות שהושגו עם זחלי Galleria הנגועים על ידי הזרקה ישירה דרך העור המת באופן עקבי לתאם עם אלה של סימיlar מחקרי יונקים: זני חיידקים שנחלשו במודלים של יונקים להפגין אלימות נמוכה בגלריה, וזני גרימת זיהומי אדם חמורים גם ארסיים ביותר במודל Galleria 8-11. דלקת פה של גלריה היא הרבה פחות משומשת ותרכובות נוספות, כמו רעלים מסוימים, יש צורך להגיע לתמותה.

מספר יתרונות G. mellonella זחלים נוכחיים טכניים: הם גדולים יחסית (זחלי instar אחרונים לפני ההתגלמות הם 250 מ"ג משקל ארוכים בערך 2 סנטימטר ו), ובכך מאפשר הזרקה של מנות מוגדרות של חיידקים, הם יכולים להיות שגדלו בטמפרטורות שונות (20 מעלות C עד 30 ° C) וזיהום מחקרים יכולים להתנהל בין 15 ° C למעל 37 מעלות צלזיוס 12,13, המאפשרים ניסויים המחקים סביבה של יונקים. בנוסף, גידול חרקים הוא קל וזול יחסית. זיהום של הזחלים מאפשר ניטור ארסיות חיידקים על ידי מספר אמצעים, includinחישוב גרם של LD 50 14, מדידה של הישרדות חיידקים 15,16 ובחינה של תהליך ההדבקה 17. כאן, אנו מתארים את הגידול של החרקים, המכסים את כל שלבי החיים של ג mellonella. אנו מספקים פרוטוקול מפורט של זיהום על ידי שני מסלולים של חיסון: haemocoelic פה ופנים. מודל החיידקים השתמש בפרוטוקול זה הוא cereus Bacillus, הפתוגן גראם חיובי מעורבים במערכת עיכול כמו גם בזיהומים אחרים חמורים מקומיים או מערכתיים אופורטוניסטיים 18,19.

Protocol

1. חקר גידול חרקים

כל מחזור מביצה לזחלי instar האחרונים נמשך כ 5 שבועות ב 25 ° C. אחד או 2 שבועות נוספים נדרשים כדי להשיג פרפרים בוגרים.

  1. הנח לפחות 100 גלמים או התמזג מבוגר לפתע ג פרפרי mellonella בכלוב 5-ליטר חוט תיל. פרפרי זכרים למדוד 10-15 מ"מ. עש זכר הבוגר הוא בצבע בז' עם אור קלוש וסימנים כהים. מדד פרפרים נקבה סביב 20 מ"מ. נקבות כהות יותר זכרים בעלי צבע חום / אפור.
  2. להשעות את שתי חבילות של נייר ארבע שכבות בכלוב להטלת ביצים. לאחר 2 ימים, הנקבה הבוגרת תטיל את ביצים על הקצה בין העיתונים.
  3. פעמים בשבוע, להניח את חבילות ביצי נייר בתיבות גידול פלסטיק חדשות עם רשתות כדי לאפשר לאוויר לזרום, המכיל אבקת פרחים ושעוות דבורים. ביצים בוקעות בכ 3 ימים וזחלים קטנים להתחיל לפתח על ידי האכלה בשעווה ואבקת פרחים. לחלופין, זחלים ניתן להציב על דיאטת consistin מלאכותיגרם של תערובת של דבש 500 גרם נוזלי, גליצרין 400 גרמו, שמרי בירה מיובשים 100 גרם, קמח חיטה 250 גרם, אבקת חלב דל שומן 200 גרם וגרם פולנטה 400. כדי לספק יחס המתאים של אוכל לזחל, להפריד באופן קבוע את הזחלים לתוך תיבות חדשות ולחדש את האוכל כל ימים.
  4. זחלים גדלים במהלך השישה השלבים של אצטדיון זחל. כל אצטדיון מתאפיין בגלישה של הקפסולה הראש של זחלים. כאשר זחלים מגיעים לשלב האחרון לפני ההתגלמות, הם מפסיקים האכלה ולהתחיל לבנות את פקעת משי אור.
  5. בגלמי מגנם, הזחלים ינוחו ולהפוך לגלמים. תולעי שעווה יישארו בשלב הגולם ל1-2 שבועות כדי לצאת לעשים בוגרים. העש הבוגר לא שותה ולא אוכל. הזדווגות מתרחשת ומחזור החיים של תולעי השעווה מתחיל שוב.
  6. כדי לתקן את assay פתולוגיה, לקחת את הזחלים בשלב הזחל האחרון. בשלב זה הם מפסיקים האכלה, לעבור לכיסוי של תיבת גידול ולהתחיל לייצר משי. זו שלאחוז נמשך סביב 5 ימים.

2. בחירת חרק לזיהום

  1. בחר הזחלים אחרונים instar, שהם ארוכים 2-3 סנטימטר ו180-250 מ"ג במשקל, 24 שעות לפני הזיהומים והכנסת אותם לתוך תיבה ריקה להרעיב אותם.
  2. הסר את פקעת המשי מתהווה סביב הזחלים.

3. הכנת קטריאלי

  1. הכן השעיות Bacillus חיידקים להשיג ריכוזים סופיים הנעים בין 10 4 יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מ"ל ל10 8 CFU / מ"ל להזרקה תוך וhaemocoelic מ3x10 6 CFU / מ"ל ל1x10 8 CFU / מ"ל לבליעה (CFU להשיג LD 50 תלוי במיני החיידקים). במקרה שלנו, ב ' cereus גדל במדיום מרק לוריא-Bertani (LB, 10 גרם / ליטר tryptone, שמרי תמצית 5 גרם / הליטר, 10 גר '/ ליטר NaCl) על 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עד שלב כניסה לנייח, המקבילה לincurvation של הצמיחה עקומה. מדוד את 600 nm (ODבין 1 ו 2 לB. cereus) ולהשתמש בו כדי להעריך את ריכוז חיידקים, תוך שימוש בעקומת טיטרציה עשתה בעבר. חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה XG ב 5000 למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר וresuspend בנאגרו מלוחים פוספט (PBS: 1M KH 2 PO 4, 1M K 2 HPO 4, NaCl 5M, 7.2 pH). כל זחל יקבל 10 μl של השעית חיידקים בריכוז הרצוי.
  2. לחלופין, השעית נבג יכולה להיות מוכנה להדבקה. השג נבגים ידי culturing את החיידקים בנביגה הבינונית HCT (5 גר '/ L tryptone, 2 גרם / ליטר קזאין hydrolyzate, 12.5 המ"מ K 2 4 HPO, 12.5 המ"מ 4 MgSO, 0.05 המ"מ 4 MnSO, ​​1.2 המ"מ 4 ZnSO, 1.2 מ"מ פה 2 (SO 4) 3, 0.5% H 2 SO 4, 25 המ"מ CaCl 2) 20 ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. נבגי קציר על ידי צנטריפוגה (10000 XG, 15 דקות), ולשטוף פעמים במים מזוקקים סטריליים. Resuspend הנבג PELבואו במים מזוקקים סטריליים וחום במשך 15 דקות ב78 ° C כדי להסיר חיידקים וגטטיבי נותרים. מנות השעיה על ידי ציפוי דילולים סידוריים על צלחות אגרו LB. כל זחל יקבל 10 μl של השעית נבגים בריכוז הרצוי.

4. Cry הכנת רעלן

  1. הכן את רעל Cry1C מB. מתח thuringiensis 407 הפך עם pHTF31C 21 פלסמיד שנשאו את Cry1C הקידוד הגנטי. תרבות הזן במדיום 100 מ"ל HCT ב 30 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות עם אנטיביוטיקה (אריתרומיצין 10mg/ml) כדי לאפשר נביגה מלאה, ייצור הרעלן גביש ושחרור בsupernatant התרבות.
  2. לטהר את גבישים מאת supernatant על -79% 72% שיפוע סוכרוז. ראשית להוסיף 17 מ"ל של סוכרוז 79% בצינור מ"ל 40. זהירות 17 מיליליטר שכבה של סוכרוז 72% על גבי סוכרוז 79%. לבסוף, 5-6 מיליליטר השכבה של תרבות sporulated המרוכזת 10X ולסגור את הצינור. צנטריפוגה לצינור 14 שעות ב20,000 XG, 4 ° C, כדי להפריד את הגבישים מהנבגים. לאסוף את הגבישים בממשק שהשיפוע. Resuspend גביש הגלולה במים סטריליים קרים 25 מ"ל לשטוף אותו. צנטריפוגה XG ב 8000 עבור 20 דקות. צעד זה חוזר על עצמו שלוש פעמים כדי להסיר את כל סוכרוז היצמדות לגבישים. Resuspend את הגבישים במי 5 מ"ל סטרילי ולבחון תחת מיקרוסקופ להעריך טוהר.
  3. הערך את ריכוז חלבון רעלן על ידי צביעה הקלסית ברדפורד בפתרון הגביש presolubilized ב50 mM NaOH. גבישי רעלן ניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש.

5. Injector הכנה

  1. כדי לשלוט בעוצמת קול ההזרקה המדויקת, השתמש במשאבת מזרק אוטומטית (למשל KD המדעי KDS 100) עם מהירות התקנה לμl 1 / שני (איור 1 א).
  2. מלא מזרק 1 מיליליטר מזרק עם מי μl 300 או פתרון החיידקים (מזרק 1 לכל מצב) לזיהום של 20-25 זחלים. הסר את הבועות על ידי זהירות ת"אpping המזרק, אז לצרף מחט מ"מ 0.45 x 12 למזרק.
  3. הנח את המזרק במזרק.
  4. לבצע הזרקה ריקה של 10 μl בצינור ריק לשלוט נפח המוזרק.

6. הזרקת Intrahaemocoelic חרקים

  1. הנח את החרקים באופן ידני בין האגודל לאצבע. לאחר מכן, הכנס את מחט המזרק קבוע בעור הזחל (קוטיקולה) (התרשים 1C).
  2. שמור את החרק במקום בזמן הזרקת 10 פתרון חיידקי μl (חיידקי נבגים או צמח).
  3. מוציא בזהירות את החרק מהמחט.
  4. הנח את החרק הנגוע בצלחת פטרי קטנה (5 סנטימטרי קוטר), 5 זחלים למנה.
  5. להדביק לפחות 20 זחלים לכל תנאי ניסוי.
  6. מניח את המנות על 37 מעלות צלזיוס בחממה על 48 שעות.

7. הלעטת חרקים (בליעה)

  1. בצינור 2 מ"ל אפנדורף, לערבב 0.2 מיקרוגרם / & מ 'u; הליטר של רעל Cry1C גם עם השעית תא נבג או צמח להשיג ריכוזים סופיים הנעים בין 4 ל 3x10 1x10 7 לכל 10 μl.
  2. מלא מזרק 1 מ"ל עם 30G, מזרק 25 מ"מ עם 300 μl של פתרון רעלן של חיידקים-Cry1C להדבקת 20-25 זחלים. הסר את הבועות מהמזרק.
  3. הנח את החרקים באופן ידני, כך שהפה שלו נכנס המחט קבועה במזרק (1D איור), ולהאכיל אותו בכוח עם 10 μl של פתרון החיידקים באמצעות משאבת המזרק האוטומטית.
  4. להדביק לפחות 20 זחלים לכל תנאי ניסוי.
  5. הנח את החרק הנגוע בקטנה 5 סנטימטר צלחת פטרי (5 זחלים למנה). מניח את המנות על 37 מעלות צלזיוס בחממה על 48 שעות.

8. תמותת חרקי הקלטה

  1. לאחר ניסויי כוח האכלה או הזרקה, לשמור את הזחלים בצלחת פטרי בלי אוכל ב 25 ° C או 37 ° C. בדקו הזחל מוrtality אופן קבוע על פני תקופת שעה 48. זחלי מלח הם אינרטי ובדרך כלל הופכים שחור (האיור 1B).
  2. נתוני תמותה ניתן לנתח באמצעות תכנית היומן Probit-14. תכנית זו בוחנת את הליניאריות של עקומות תמותת מינון ומספקת כמות קטלנית (LD 50). לחלופין, תוכניות אחרות, כמו פריזמה (הגרף Pad), ניתוח נתוני תמותה או הישרדות יכולות לשמש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הזרקה תוך haemocoelic של חיידקים לג mellonella הוכח שימושי מאוד לזיהוי גורמים ארסיים רבים העוסקים בניזק לרקמות והתנגדות לגורמים חיסוניים מולדים של כמה פתוגנים אנושיים. כדוגמה, 2A הדמות מייצג תמותת חרקים לאחר הזרקה של מינונים שונים של B. חיידקי cereus (סוג פרוע וזנים מוטנטים) 22. 2B האיור מייצגים הישרדות חיידקים לאחר הדבקה של ג mellonella ידי Pseudomonas aeruginosa 4.

השימוש בגלריה כמודל לזיהום אוראלי ב ' cereus וB. thuringiensis מסתמך על הערכת האפקט סינרגיסטי של החיידקים וגטטיבי או נבגים על פעילות החרקים של רעלן Cry1C 10. הזחלים רגישים לבליעה של תערובת נבג / רעל אלא רק בחולשה רגישה לבליעה של Cry1רעלן C בלבד. תוצאות מות הזחל מהרעלת הדם, לאחר חיידקים הגיעו haemocoel בעקבות ההתמוטטות של מחסומי המעיים. איור 3 מייצג תמותת זחל לאחר בליעה של גבישים וגם סוג בר או זנים מוטנטים של חיידקי Bacillus 10.

חיידקים כמה נבדקו לדלקת פה בגלריה. בין פתוגנים האנושיים נבדקו, ב ' זני cereus עם רעל Cry1C היו ארסי ביותר לג mellonella לאחר הדבקה אוראלית 24. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לפקח על זיהום / קולוניזציה של מעי גסטרו. ואכן, כפי שמוצג באיור 4, מערכת עיכול הזחל ניתן לחלץ לאחר הדבקה, ושינויי תא מארח, כמו גם קולוניזציה חיידקים יכולים להיות דמיינו בסעיפי פרפין היסטולוגית. בנוסף, בליעה של חיידקי ניאון יכול לשמש כדי לעקוב אחר המסלול והפר קולוניזציהCess לאורך התאים השונים של הזחלים. לבסוף, הביטוי הספציפי של גנים בתאי החרקים השונים יכול להיות פיקוח על ידי ניאון מיקרוסקופיה 25.

איור 1
איור 1. () מזרק אוטומטית משאבת הזרקה. (ב) מלח (עליון, שחור) וחיים (תחתון, לבן) ג זחלי mellonella. (ג) חיידקים מוזרקים בhaemocoel של ג זחלי mellonella. (ד) ג זחלי mellonella הם כפייה את הכנה עם חיידקים: המחט נכנסת לפה של זחלי חרקים.

איור 2
איור 2. תוצאות לאחר הזרקת haemocoelic פן. () ארסי CwpFM נגד G. זחלי mellonella 22. ריכוזים שונים של B. cereus wilD-Type (BT 407) וזני ΔcwpFM מוטנטים היו מחוסנים לhaemocoel של 20 ג' זחלי mellonella. תמותה נרשמה לאחר 24 שעות ב 37 ° C. (ב) כמובן זמן של PA14 זיהום Pseudomonas aeruginosa בג mellonella 4. עשרים וחמישה חיידקים לזחל הוזרקו בזמן אפס. זחלים נמחצו בנקודות לאחר פגיעת הזמן המצוין וספירת חיידקים נקבעו על ידי ציפוי. כל נקודת נתונים מייצגת את הסטייה הממוצעת וסטנדרטית של ספירת חיידקים מ10 קבוצות של 10 זחלים. זחלים מתו כ 48 שעות לאחר הזרקה, כאשר ריכוזי חיידקים הגיעו 10 9 / g.

איור 3
איור 3. סינרגיזם של נבגים וגבישי הרעלן Cry1C כהערכת פתוגניות בג זחלי mellonella לאחר בליעה אוראלית 10. ג זחל mellonellaהדואר היה נגוע בעל פה עם או גבישי הרעלן Cry1C (מיקרוגרם 1 לזחל), או עם 10 6 ב ' נבגי thuringiensis, או בתערובת של רעל Cry1C וB. נבגי thuringiensis. תמותת זחלים הוערכה לאחר 48 שעות ב 25 ° C.

איור 4
איור 4 זיהום אוראלי של זחלים:. הקולוניזציה ולוקליזציה רקמה של חיידקים. () 10 μl של פתרון צבע כחול הוצג על ידי האכלה בכפייה לתוך הפה של ז זחל mellonella. הזחל היה גזור כדי לחשוף את המעי מלא בצבע הכחול. (ב) תערובת של 407 מתח ורעל Bt Cry1C הוכנסה ג זחלי mellonella ידי האכלה בכפייה. לאחר 24 שעות, כל הזחלים היו מוטבעים פרפין, לגזור וקבועים. חלקים אורכיים היסטולוגית הוכתמו (hematoxylin & Eosine וגראם מאמץ). התמונה המיקרוסקופית האור (400X) מראה את הבטן (סגול כהה) והמוכתם צילוס גראם (סגול כהה) מקומי על פני שטח המעי. (ג) תערובת של Bt מתח 407-Gfp ניאון ורעל Cry1C הוכנס ג זחלי mellonella ידי האכלה בכפייה. לאחר 24 שעות, החיידקים הגיעו haemocoel ופגר חרקים מלאים בB. cereus מבטא את החלבון פלואורסצנטי הירוק. (ד) ניתוח של ביטוי אילזה ב25 vivo. תצפיות מיקרוסקופיות ידי epifluorescence בוצעו על B. cereus נושאים pHT315-pilsA'gfp. חיידקים בודדו מhemocoel של 24 שעתי זחלים מתות לאחר הדבקה דרך פה. חיידקים ירוקים מציינים ביטוי של GFP בשל ההפעלה של אמרגן אילזה. זה מראה את הביטוי הספציפי של גן זה (אילזה) כאשר החיידקים הגיעו haemocoel.

סרט 1. הפצה של פתרון במעיים בעקבות חרקי פה להיבלעיון. 10 μl של פתרון צבע כחול הוצג על ידי האכלה בכפייה לתוך הפה של הזחל האירופי תירס דקור Ostrinia nubilalis. הצבע ממלא במהירות בחלל המעי של זחלי חרקים. לחץ כאן לצפייה בסרט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השימוש בחרקים ובמיוחד בשלב הזחל, כמודלים לזיהום כמה פתוגנים, הופך תכוף. מודל של בחירה בהיבטים מסוימים הוא דרוזופילה (מודל הזבוב) משמשת כמבוגרים ו1,2 שלב זחל. Lepidopteran החרקים ג mellonella גם שמש בעיקר לassaying ארסיות חיידקים בהזרקה. היתרון של לסבול טמפרטורות גבוהות (מעל 37 מעלות צלזיוס) מאשר דרוזופילה (מקסימום 25 מעלות צלזיוס) הוא חשוב כאשר פתוגנים יונקים הם כדי להיחקר. גם הגודל של גלריה הוא נוח יותר ללימוד קינטיקה זיהום וניזק לרקמות. לבסוף, הפרוטוקול שלנו מתאר את האפשרות להשתמש בגלריה לדלקת פה, דבר המהווה יתרון ללימודים הקשורים למערכת העיכול. בדומה לכך, בשלב הזחל של זחל גדול אחר, Manduca סקסטה, משמש ללמוד זיהומים על ידי הזרקה לתוך haemocoel ולאחרונה לדלקת פה 26.מיני Spodoptera, שהגנום שלהם רצף 27 ב המורי וגם להציע אלטרנטיוות מעניינות, וגני מארח ניתן לסגור על ידי שיטות RNAi או מניפולציות גנטיות אחרות 28. כאן, אנו מתארים בצורה פשוטה, איך לגדל את זחלי Galleria, איך להדביק אותם וכמה דוגמאות על איך לבצע את תהליך ההדבקה ותמותת ניקוד כדי להראות את הפוטנציאל של דגמים כאלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לאליזבת Guillemet, כריסטוף בואסון ולודוויק Bridoux לקבלת סיוע טכני מעולה. אנחנו חוב גדולים לסילבי Salamitou וSinda Fedhila להתקנת המערכת הראשונית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wax and pollen La Ruche Roanaise 303000 Any honey producer
Automated syringe pump KD Scientific KDS 100
Syringe 1 ml Terumo BS 01T
Needle 0.45 x 12 mm Terumo NN 2613R
Petri dish 5 cm VWR 89000-300
Needle 30G, 25 mm hypodermic Burkard Mfg. Co. Ltd. PDE0005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
  2. Vodovar, N., Acosta, C., Lemaitre, B., Boccard, F. Drosophila: a polyvalent model to decipher host-pathogen interactions. Trends Microbiol. 12, 235-242 (2004).
  3. Dalhammar, G., Steiner, H. Characterization of inhibitor A, a protease from Bacillus thuringiensis which degrades attacins and cecropins, two classes of antibacterial proteins in insects. Eur. J. Biochem. 139, 247-252 (1984).
  4. Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
  5. Purves, J., Cockayne, A., Moody, P. C., Morrissey, J. A. Comparison of the regulation, metabolic functions, and roles in virulence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase homologues gapA and gapB in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78, 5223-5232 (2010).
  6. Chadwick, J. S. Serological responses of insects. Fed. Proc. 26, 1675-1679 (1967).
  7. Chadwick, J. S., Caldwell, S. S., Chadwick, P. Adherence patterns and virulence for Galleria mellonella larvae of isolates of Serratia marcescens. J. Invertebr. Pathol. 55, 133-134 (1990).
  8. Gao, W., et al. Two novel point mutations in clinical Staphylococcus aureus reduce linezolid susceptibility and switch on the stringent response to promote persistent infection. PLoS Pathog. 6, e1000944 (2010).
  9. Peleg, A. Y., et al. Reduced susceptibility to vancomycin influences pathogenicity in Staphylococcus aureus infection. J. Infect. Dis. 199, 532-536 (2009).
  10. Salamitou, S., et al. The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects. Microbiology. 146, 2825-2832 (2000).
  11. Cadot, C., et al. InhA1, NprA and HlyII as candidates to differentiate pathogenic from non-pathogenic Bacillus cereus strains. J. Clin. Microbiol. 48, 1358-1365 (2010).
  12. Rejasse, A., et al. Temperature-dependent production of various PlcR-controlled virulence factors in Bacillus weihenstephanensis strain KBAB4. Appl. Environ. Microbiol. 78, 2553-2557 (2012).
  13. Jones, R. T., et al. Photorhabdus adhesion modification protein (Pam) binds extracellular polysaccharide and alters bacterial attachment. BMC Microbiol. 10, 141 (2010).
  14. Finney, D. J. Probit analysis. , Cambridge University Press. (1971).
  15. Fedhila, S., Nel, P., Lereclus, D. The InhA2 metalloprotease of Bacillus thuringiensis strain 407 is required for pathogenicity in insects infected via the oral route. J. Bacteriol. 184, 3296-3304 (2002).
  16. Guillemet, E., et al. The InhA metalloproteases of Bacillus cereus contribute concomitantly to virulence. J. Bacteriol. 192, 286-294 (2010).
  17. Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lereclus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Curr. Opin. Microbiol. 15, 1-12 (2012).
  18. Bottone, E. J. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 23, 382-398 (2010).
  19. Stenfors Arnesen, L., Fagerlund, A., Granum, P. From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Rev. 32, 579-606 (2008).
  20. Lecadet, M., Blondel, M. O., Ribier, J. Generalized transduction in Bacillus thuringiensis var. berliner 1715, using bacteriophage CP54. Ber. J. Gen. Microbiol. 121, 203-212 (1980).
  21. Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J., Lereclus, D. Construction of new insecticidal Bacillus thuringiensis recombinant strains by using the sporulation non-dependent expression system of cryIIIA and a site specific recombination vector. J. Biotechnol. 48, 81-96 (1996).
  22. Tran, S. L., Guillemet, E., Gohar, M., Lereclus, D., Ramarao, N. CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation and virulence. J. Bacteriol. 192, 2638-2642 (2010).
  23. Tran, S. L., et al. Hemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages. Cell Microbiol. 13, 92-108 (2011).
  24. Fedhila, S., et al. Comparative analysis of the virulence of invertebrate and mammalian pathogenic bacteria in the oral insect infection model Galleria mellonella. J. Invertebr. Pathol. 103, 24-29 (2010).
  25. Daou, N., et al. IlsA, a unique surface protein of Bacillus cereus required for iron acquisition from heme, hemoglobin and ferritin. PLoS Pathog. 5, e1000675 (2009).
  26. Mason, K. L., et al. From commensal to pathogen: translocation of Enterococcus faecalis from the midgut to the hemocoel of Manduca sexta. MBio. 2, e00065-00011 (2011).
  27. Goldsmith, M. R., Shimada, T., Abe, H. The genetics and genomics of the silkworm, Bombyx mori. Annu. Rev. Entomol. 50, 71-100 (2005).
  28. Fraser, M. J. Insect transgenesis: current applications and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 57, 267-289 (2012).

Tags

זיהום גיליון 70 מיקרוביולוגיה אימונולוגיה ביולוגיה מולקולרית בקטריולוגיה אנטומולוגיה חיידקים, עש שעווה גדול יותר זחלי חרקים הזרקת haemocoelic פנים בליעה מודל חיה אינטראקציות מאכסן לפתוגן
החרקים<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; כדגם זיהום רב עצמה כדי לחקור פתוגנזה קטריאלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C.,… More

Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter