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Immunology and Infection

Das Insekt Published: December 11, 2012 doi: 10.3791/4392
Automatic Translation
1, 1, 1
1INRA, Micalis UMR1319, France

Summary

Mündliche und intra haemocolic Infektion der Larven der größeren Wachsmotte

Abstract

Das Studium der bakteriellen Virulenz erfordert oft einen geeigneten Tiermodell. Mammalian Modelle Infektion sind kostspielig und können ethische Probleme aufwerfen. Die Verwendung von Insekten-Infektion Modelle bietet eine wertvolle Alternative. Im Vergleich zu anderen nicht-Vertebraten Modell Hosts wie Nematoden, Insekten haben ein relativ fortgeschrittenes System der antimikrobiellen Abwehr und sind somit eher einschlägigen Informationen zu den Säugetieren Infektion herzustellen. Wie bei Säugetieren besitzen Insekten eine komplexe angeborene Immunsystem 1. Zellen in der Hämolymphe der Lage sind, phagozytierenden oder Einkapseln mikrobielle Invasoren und humorale Reaktionen gehören die induzierbare Produktion von Lysozym und kleine antibakterielle Peptide 2,3. Darüber hinaus werden Analogien zwischen den Epithelzellen von Insekten Larven Mitteldärmen und Darmzellen von Säugetieren Verdauungssystem gefunden. Schließlich mehreren Basiskomponenten essentiell für die bakterielle Infektion Verfahren wie Zelladhäsion, Resistenz gegenantimikrobielle Peptide, Gewebeabbau und Anpassung an oxidativem Stress sind wahrscheinlich in beiden Insekten und Säugern 1 wichtig. Somit sind Insekten polyvalenten Werkzeuge für die Identifizierung und Charakterisierung mikrobieller Virulenzfaktoren in Säugetier Infektionen beteiligt.

Larven des größeren Wachsmotte Galleria mellonella ist gezeigt worden, um eine nützliche Einblick in die Pathogenese einer Vielzahl von mikrobiellen Infektionen, einschließlich Säuger-Pilz (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) und bakterieller Pathogene, wie Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris bereitzustellen , Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes oder Enterococcus faecalis 4-7. Unabhängig von den Bakterienarten, die Ergebnisse mit Galleria Larven durch direkte Injektion durch die Kutikula infiziert konsistent mit denen von simi korrelieren erhaltenlar Säugetieren Studien: Bakterienstämme, die gedämpft in Säugetierzellen Modelle sind zu demonstrieren niedrigerer Virulenz in der Galleria und Stämme verursacht schwere Infektionen beim Menschen sind auch sehr virulent in der Galleria-Modell 8-11. Oral Infektion Galleria ist viel weniger genutzt und zusätzliche Verbindungen, wie bestimmte Toxine, sind erforderlich, um die Sterblichkeit zu erreichen.

G. mellonella Larven vorhanden mehrere technische Vorteile: Sie sind relativ groß (letzten Larvenstadium vor der Verpuppung sind etwa 2 cm lang und Gewicht 250 mg), so dass die Injektion von definierten Dosen von Bakterien, sie können bei verschiedenen Temperaturen gehalten werden (20 ° C bis 30 ° C) und Infektionsstudien kann zwischen 15 ° C werden über 37 ° C 12,13 durchgeführt, so dass Versuche, das eine Säuger-Umgebung nachahmen. Darüber hinaus ist Insekt Aufzucht leicht und relativ billig. Infektion der Larven ermöglicht die Überwachung bakteriellen Virulenz durch verschiedene Mittel, including Berechnung der LD 50 14, Messung der Überlebensrate der Bakterien 15,16 und Prüfung der Infektion 17. Hier beschreiben wir die Aufzucht der Insekten, die alle Lebensphasen von G. mellonella. Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll der Infektion auf zwei Wegen der Impfung: mündliche und intra haemocoelic. Die bakterielle Modell in diesem Protokoll ist Bacillus cereus, einem Gram-positive Erreger in gastrointestinalen sowie in andere schwere lokale oder systemische opportunistische Infektionen 18,19 verwickelt.

Protocol

Ein. Insect Aufzucht

Der gesamte Zyklus vom Ei bis zum letzten Larvenstadium dauert ca. 5 Wochen bei 25 ° C. Ein oder zwei zusätzliche Wochen sind nötig, um erwachsenen Schmetterlinge zu erhalten.

  1. Zeigen mindestens 100 Puppen oder neu fusionierten erwachsenen G. mellonella Schmetterlinge in einem 5-Liter-wire-mesh Käfig. Männlich Schmetterlinge messen 10 bis 15 mm. Der erwachsene männliche Motte ist beige mit schwachen hellen und dunklen Markierungen. Weibliche Schmetterlinge Maß um 20 mm. Die Weibchen sind dunkler als die Männchen mit einem braun / grau.
  2. Suspend zwei Packungen vierschichtigen Papier in den Käfig für Eiablage. Nach 2 Tagen wird das erwachsene Weibchen Eier auf der Kante zwischen den Papieren lag.
  3. Zweimal in der Woche, legen Sie die Ei-Papier Packs in neue Kunststoff-Aufzucht-Boxen mit Gittern zu lassen Luft zirkulieren, die Pollen und Bienenwachs. Eier brüten in ungefähr 3 Tage und kleine Larven beginnen, indem auf Wachs und Pollen zu entwickeln. Alternativ können Larven auf einer künstlichen Diät consistin platziert werdeng einer Mischung aus 500 g flüssiger Honig, 400 g Glycerin, 100 g getrocknete Bierhefe, 250 g Weizenmehl, 200 g Magermilchpulver und 400 g Polenta. Um eine angemessene Verhältnis der mit Lebensmitteln pro Larve bieten regelmäßig trennen die Larven in neue Boxen und füllt die Lebensmittel alle zwei Tage.
  4. Larven werden in den sechs Etappen der Larve Stadion aufgezogen. Jedes Stadion wird vom Schlupf des Kopfkapsel der Larven ist. Wenn Larven die letzte Stufe zu erreichen vor der Verpuppung, stoppen sie Fütterung und dem Bau einer leichte Seide Kokon.
  5. In ihrer schützenden Kokons, werden die Larven Ruhe und verwandeln sich in Puppen. Wachs Würmer verbleiben im Puppenstadium für ein bis zwei Wochen, in Falter entstehen. Die Falter nicht trinken noch essen. Die Paarung erfolgt und das Wachs Würmer Lebenszyklus beginnt von neuem.
  6. Um die Pathologie Assay zu standardisieren, nehmen die Larven im letzten Larvenstadium. Während dieser Phase diese Fütterung zu stoppen, an der Abdeckung der Aufzucht zu verschieben und starten, um Seide zu produzieren. Diese stage dauert ca. 5 Tage.

2. Insect Selection für Infektionsforschung

  1. Wählen letzten Larvenstadium, die 2-3 cm lang und 180-250 mg im Gewicht sind, 24 Stunden vor Infektionen und steckte sie in ein leeres Feld, um sie verhungern.
  2. Entfernen Sie die entstehenden Seidenkokon um die Larven.

3. Bakterielle Zubereitung

  1. Planen Bacillus Bakteriensuspensionen um Endkonzentrationen im Bereich von 10 4 koloniebildenden Einheiten (KBE) / ml bis 10 8 KBE / ml für intra haemocoelic Injektion und von 3x10 6 CFU / ml bis 1x10 erhalten 8 KBE / ml bei Einnahme (die cfu zu erhalten ein LD 50 hängt von den bakteriellen Spezies). In unserem Fall, B. cereus wird in Luria-Bertani broth Medium (LB, 10 g / l Trypton, 5 g / l Hefeextrakt, 10 g / l NaCl) bei 37 ° C unter Rühren bis zum Eintritt in die stationäre Phase, entsprechend der Einwärtskrümmung des Wachstums Kurve. Messen Sie die OD 600 nm (zwischen 1 und 2 für B. cereus) und es verwenden, um bakterielle Konzentration zu bewerten, mit einem bisherigen Titrationskurve. Ernte Bakterien durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 10 min bei Raumtemperatur und resuspendieren in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS: 1 M KH 2 PO 4, 1 M K 2 HPO 4, 5 M NaCl, pH 7,2). Jede Larve wird 10 ul Bakteriensuspension in der gewünschten Konzentration erhalten.
  2. Alternativ können Sporensuspension für eine Infektion vorbereitet werden. Sporen erhalten durch Kultivieren der Bakterien in dem Sporulationsmedium HCT (5 g / l Trypton, 2 g / L Caseinhydrolysat, 12,5 mM K 2 HPO 4, 12,5 mM MgSO4, 0,05 mM MnSO 4, 1,2 mM ZnSO 4, 1,2 mM Fe 2 (SO 4) 3, 0,5% H 2 SO 4, 25 mM CaCl 2) 20 bis 30 ° C für 3 Tage. Ernte Sporen durch Zentrifugation (10.000 xg, 15 min) und waschen zweimal in sterilem destilliertem Wasser. Resuspendieren spore pelreinlassen sterilem destilliertem Wasser und Wärme für 15 min bei 78 ° C, um die verbleibenden vegetativen Bakterien zu entfernen. Numerate die Suspension durch Ausplattieren serielle Verdünnungen auf LB-Agarplatten. Jede Larve wird 10 ul Sporensuspension in der gewünschten Konzentration erhalten.

4. Cry Toxin Vorbereitung

  1. Bereiten Sie die Cry1C Toxin aus dem B. thuringiensis Stamm 407 mit dem Plasmid pHTF31C 21, die das Gen kodiert Cry1C transformiert. Kultur der Stamm in 100 ml HCT-Medium bei 30 ° C für 72 Stunden mit Antibiotika (Erythromycin 10mg/ml) in voller Sporulation, Toxin crystal Produktion und Befreiung in den Kulturüberstand zu ermöglichen.
  2. Entschlacken Kristalle aus der Überstand auf 72% -79% Saccharose-Gradienten. Fügen Sie zunächst 17 ml 79% Saccharose in einer 40 ml Tube. Vorsichtig 17 ml 72% Saccharose auf dem 79% Saccharose. Schließlich schließen Schicht 5-6 ml des 10X konzentrierter sporulierten Kultur und das Rohr. Zentrifugieren für 14 h bei 20,000 × g, 4 ° C, um die Kristalle von den Sporen getrennt. Sammle die Kristalle bei der Gradient-Schnittstelle. Resuspendieren des Kristalls Pellet in 25 ml kaltem sterilem Wasser zu waschen. Zentrifuge bei 8.000 xg für 20 min. Dieser Schritt wird dreimal wiederholt, um alle Saccharose Kleben an den Kristallen zu entfernen. Resuspendieren die Kristalle in 5 ml sterilem Wasser und beobachten unter dem Mikroskop, um die Reinheit zu bewerten.
  3. Bewerten Toxinprotein Konzentration durch klassische Bradford Färbung auf Kristall-Lösung in 50 mM NaOH presolubilized. Toxin Kristalle können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.

5. Injector Vorbereitung

  1. Um die genaue Injektionsvolumen steuern, verwenden Sie eine automatisierte Spritzenpumpe (zB KD Scientific KDS 100) mit dem Setup auf 1 ul / sec (Abbildung 1A).
  2. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 300 ul Wasser oder die bakterielle Lösung (1 Spritze pro Bedingung) für die Infektion von 20-25 Larven. Entfernen Sie die Luftblasen durch vorsichtiges tapping der Spritze, dann fügen Sie eine 0,45 x 12 mm Nadel an der Spritze.
  3. Legen Sie die Spritze in den Injektor.
  4. Führen Sie eine leere Injektion von 10 ul in einem leeren Rohr, um das injizierte Volumen steuern.

6. Insect Intrahaemocoelic Injection

  1. Legen Sie die Insekten manuell zwischen Daumen und Zeigefinger. Dann führen Sie die Nadel im Injektor in der Larve Haut (Epidermis) (1C) fixiert.
  2. Halten Sie das Insekt an Ort und Stelle während der Injektion die 10 ul bakterieller Lösung (Sporen oder vegetativen Bakterien).
  3. Entfernen Sie vorsichtig das Insekt von der Nadel.
  4. Legen Sie die infizierten Insektenzellen in einer kleinen Petrischale (5 cm Durchmesser), 5 Larven pro Gericht.
  5. Infect mindestens 20 Larven für jede experimentelle Bedingung.
  6. Die Schalen werden bei 37 ° C im Brutschrank für 48 Stunden.

7. Insect Zwangsernährung (Verschlucken)

  1. In einem 2 ml Eppendorf-Röhrchen, mischen 0,2 ug / & mu; l Cry1C Toxin entweder mit Sporen oder vegetative Zellsuspension in Endkonzentrationen im Bereich von 3x10 4 bis 1x10 7 je 10 ul erhalten.
  2. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit einer 30G, 25 mm Injektionsnadel mit 300 ul des bakteriellen Cry1C Toxinlösung für die Infektion von 20-25 Larven. Entfernen Sie die Luftblasen aus der Spritze.
  3. Legen Sie die Insekten manuell, so dass der Mündung der Nadel fixiert im Injektor (1D) und Kraft-füttern mit 10 ul der bakteriellen Lösung unter Verwendung der automatischen Spritzenpumpe betritt.
  4. Infect mindestens 20 Larven für jede experimentelle Bedingung.
  5. Legen Sie die infizierten Insektenzellen in einem kleinen 5 cm Petrischale (5 Larven pro Gericht). Die Schalen werden bei 37 ° C im Brutschrank für 48 Stunden.

8. Recording Insektenmortalität

  1. Nach der Zwangsernährung oder Injektion Versuche, halten die Larven in der Petrischale ohne Nahrung bei 25 ° C oder 37 ° C. Überprüfen Larven mortality regelmäßig über einen 48-Stunden-Zeitraum. Tote Larven sind inert und in der Regel schwarz werden (Abbildung 1B).
  2. Mortality Daten können analysiert mit Hilfe des Log-Probit Programm 14 werden. Dieses Programm testet die Linearität der Dosis Sterblichkeit Kurven und bietet letalen Dosen (LD 50). Alternativ können auch andere Programme, wie Prism (Graph Pad), Analyse Überleben oder Mortalität Daten verwendet werden.

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Representative Results

Intra haemocoelic Injektion von Bakterien in G. mellonella ist erwiesen sehr nützlich für die Identifizierung vieler Virulenzfaktoren Umgang mit Gewebebeschädigung und Beständigkeit gegen angeborene Immunsystem Faktoren mehrerer menschlicher Pathogene. Als Beispiel stellt Figur 2A Insektenmortalität nach Injektion von verschiedenen Dosen von B. cereus Bakterien (Wildtyp und Mutanten) 22. 2B stellt die Überlebensrate der Bakterien nach der Infektion G. mellonella durch Pseudomonas aeruginosa 4.

Die Verwendung von Galleria als orale Infektion Modell für B. cereus und B. thuringiensis beruht auf der Auswertung der synergistische Effekt der vegetativen Bakterien oder Sporen auf der insektiziden Aktivität des Toxins Cry1C 10. Die Larven sind anfällig für die Aufnahme von Sporen / Toxin Mischung sind aber nur schwach empfindlich auf die Einnahme von Cry1C-Toxin allein. Die zum Tod der Larve Ergebnisse aus Septikämie nach Bakterien in die haemocoel nach dem Zusammenbruch der intestinalen Barrieren erreicht. Abbildung 3 stellt Larvenmortalität nach der Einnahme von Kristallen und entweder Wildtyp-oder mutierten Stämmen von Bacillus Bakterien 10.

Wenige Bakterien für die orale Infektion in Galleria getestet. Unter den humanpathogenen getestet, B. cereus-Stämme mit Cry1C Toxin waren die virulenten für G. mellonella nach oraler Infektion 24. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Infektion / Besiedlung des Magen-Darm-Trakt zu überwachen. Tatsächlich, wie in 4 gezeigt, kann die Larve Verdauungstraktes nach der Infektion extrahiert und Wirtszelle Modifikationen sowie bakterielle Besiedlung kann visualisiert auf histologischen Paraffinschnitten. Zudem kann die Aufnahme von fluoreszierenden Bakterien verwendet werden, um die Flugbahn und die Besiedelung Pro folgenCess entlang der verschiedenen Fächer der Larven. Schließlich kann die Expression eines Gens in den verschiedenen Abteilen Insekt durch Fluoreszenzmikroskopie 25 überwacht werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. (A) Automated Spritzenpumpe Injektor. (B) Dead (oben, schwarz) und lebendig (unten, weiß) G. mellonella Larven. (C) Bakterien sind in der haemocoel von G. injiziert mellonella Larven. (D) G. mellonella Larven sind zwangsernährt mit bakteriellen Zubereitung: die Nadel in die Mündung der Insektenlarven.

Abbildung 2
Abbildung 2. Ergebnisse nach intra haemocoelic Injektion. (A) CwpFM Virulenz gegen G. mellonella Larven 22. Verschiedene Konzentrationen von B. cereus wild-Typ (Bt 407) und ΔcwpFM Mutanten wurden in den haemocoel von 20 G. beimpft mellonella Larven. Die Mortalität wurde nach 24 h bei 37 ° C aufgezeichnet (B) Zeitverlauf der Pseudomonas aeruginosa PA14 Infektion in G. mellonella 4. Fünfundzwanzig Bakterien pro Larven wurden zum Zeitpunkt Null injiziert. Larven wurden bei den angegebenen Zeitpunkten nach Infektion zerkleinert und Keimzahlen wurden durch Ausplattieren bestimmt. Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert und die Standardabweichung der Keimzahlen von 10 Gruppen von jeweils 10 Larven. Larven starben rund 48 Stunden nach der Injektion, wenn bakterielle Konzentrationen erreicht 10 9 / g.

Abbildung 3
Abbildung 3. Synergismus von Sporen und Cry1C Toxin Kristalle als einer Evaluierung der Pathogenität in G. mellonella Larven nach oraler Aufnahme 10. G. mellonella LarveE wurden oral mit entweder Cry1C Toxin-Kristalle (1 ug pro Larve) infiziert oder mit 10 6 B. thuringiensis Sporen, oder mit einer Mischung aus Cry1C Toxin und B. thuringiensis Sporen. Larven Mortalität wurde nach 48 h bei 25 ° C beurteilt

Abbildung 4
Abbildung 4 Oral Infektion der Larven:. Kolonisierung und Gewebe Lokalisation von Bakterien. (A) 10 ul blauen Farbstoff Lösung wurde durch Zwangsernährung in den Mund eines G. eingeführten mellonella Larve. Die Larve wurde seziert, um den Darm mit dem blauen Farbstoff gefüllt offenbaren. (B) Ein Gemisch aus 407 Bt-Stamm und Cry1C Toxin wurde in G. eingeführten mellonella Larven durch Zwangsernährung. Nach 24 Stunden waren ganze Larven Paraffin eingebettet, geschnitten und fixiert. Histologische Längsschnitte wurden gefärbt (Hämatoxylin & Eosin und Gram belasten). Das Licht mikroskopische Aufnahme (400X) zeigt den Darm (dark purple) und der Gram gefärbten Bacillus (dunkelviolett) an der Darmoberfläche lokalisiert. (C) Eine Mischung aus 407-Bt-Stamm und fluoreszierende GFP Cry1C Toxin wurde in G. eingeführten mellonella Larven durch Zwangsernährung. Nach 24 h wurden die Bakterien die haemocoel erreicht und das Insekt kadaver ist mit B aufgefüllt cereus Exprimieren des grün fluoreszierenden Proteins. (D) Analyse der Expression in vivo Ilsa 25. Mikroskopische Beobachtungen durch Epifluoreszenz wurden am B. durchgeführt cereus Durchführung pHT315-pilsA'gfp. Die Bakterien wurden aus dem Hämocoel der toten Larven 24 Stunden nach der oralen Infektion isoliert. Grünen Bakterien geben Expression von GFP durch die Aktivierung des Promotors Ilsa. Dies zeigt die spezifische Expression dieses Gens (ILSA), wenn die Bakterien in die haemocoel erreicht.

Movie 1. Verbreitung der Lösung im Insektendarm nach oraler IngestIon. 10 ul blauen Farbstoff Lösung wurde durch Zwangsernährung in die Mündung des Maiszünsler Ostrinia nubilalis Larve eingeführt. Der Farbstoff schnell füllt im Darmlumen der Insektenlarven. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .

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Discussion

Der Einsatz von Insekten und vor allem das Larvenstadium, wie Infektionen Modelle für mehrere Erreger, wird immer häufiger. Ein Modell der Wahl für einige Aspekte ist Drosophila (die Fliege Modell) und Erwachsene Larvenstadium 1,2 verwendet. Die Lepidoptera G. mellonella wurde auch hauptsächlich zum Testen bakteriellen Virulenz durch Injektion verwendet. Der Vorteil tolerieren höheren Temperaturen (über 37 ° C) als Drosophila (maximal 25 ° C) ist wichtig, wenn Säuger Erreger zu untersuchen sind. Auch die Größe der Galleria ist bequemer zu studieren Infektion Kinetik und Gewebeschäden. Schließlich beschreibt unser Protokoll die Möglichkeit, Galleria für die orale Infektion, was ein Vorteil für Studien im Zusammenhang mit dem Verdauungstrakt zu verwenden. In ähnlicher Weise ist das Larvenstadium eines anderen großen Raupe, Manduca sexta, zur Behandlung von Infektionen durch Injektion in den haemocoel studieren und neuerdings zur oralen Infektion 26.B. mori und Spodoptera Arten, die Genome 27 sequenziert werden auch interessante Alternativen, und Host-Gene können sich durch RNAi-Verfahren oder andere Genmanipulationen 28 abgeschaltet werden. Hier beschreiben wir in einer einfachen Art und Weise, wie man Galleria Larven, wie sie infizieren und einige Beispiele auf, wie die Infektion Prozess und Ergebnis Sterblichkeit zu folgen, um das Potenzial solcher Modelle zeigen zu erziehen.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir möchten Elisabeth Guillemet, Christophe Buisson und Ludovic Bridoux für hervorragende technische Unterstützung danken. Wir sind zu großem Dank verpflichtet Sylvie Salamitou und Sinda Fedhila für die erste System-Setup.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wax and pollen La Ruche Roanaise 303000 Any honey producer
Automated syringe pump KD Scientific KDS 100
Syringe 1 ml Terumo BS 01T
Needle 0.45 x 12 mm Terumo NN 2613R
Petri dish 5 cm VWR 89000-300
Needle 30G, 25 mm hypodermic Burkard Mfg. Co. Ltd. PDE0005

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