Summary
Muntlig och inom haemocolic infektion av larver av större vax mal
Abstract
Studiet av bakteriell virulens kräver ofta en lämplig djurmodell. Mammalian modeller av infektion är kostsamma och kan ge upphov till etiska frågor. Användningen av insekter som infektionsmodeller ger ett värdefullt alternativ. Jämfört med andra ryggradslösa modell värdar som nematoder, insekter har en relativt avancerat system av antimikrobiella försvar och därmed mer benägna att producera information som är relevant för däggdjur infektionsprocessen. Liksom däggdjur, insekter har ett komplext medfödda immunsystemet 1. Celler i hemolymfa är kapabla phagocytosing eller inkapsling mikrobiella inkräktare, och humorala svar inkluderar inducerbara produktionen av lysozym och små antibakteriella peptider 2,3. Dessutom finns analogier finns mellan epitelceller insekter larver midguts och intestinala celler av däggdjur tarmsystem. Slutligen, flera grundläggande komponenter som är nödvändiga för den bakteriella infektionen processen såsom celladhesion, beständighet motantimikrobiella peptider, vävnadsnedbrytning och anpassning till oxidativ stress kommer sannolikt att vara viktiga i både insekter och däggdjur 1. Således insekter är polyvalenta verktyg för identifiering och karakterisering av mikrobiella virulensfaktorer inblandade i däggdjur infektioner.
Larver av större vax mal Galleria mellonella har visat sig ge en användbar inblick i patogenes av ett brett spektrum av mikrobiella infektioner inkluderande däggdjur svamp (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) och bakteriella patogener, såsom Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris , Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes eller Enterococcus faecalis 4-7. Oberoende av bakteriearter, resultat som erhållits med Galleria larver infekterade genom direkt injektion genom nagelband genomgående korrelerar med de liknande däggdjur studier: bakteriestammar som är försvagade i däggdjurs modeller visar lägre virulens i Galleria och stammar som orsakar allvarliga infektioner hos människa är också mycket virulenta i Galleria modell 8-11. Muntlig infektion av Galleria är mycket mindre använda och ytterligare föreningar, som vissa gifter, behövs för att nå dödlighet.
G. mellonella larver närvarande flera tekniska fördelar: de är relativt stora (sista stadiet larver innan förpuppning är ca 2 cm långa och vikten 250 mg), vilket möjliggör injektion av definierade doser av bakterier, de kan födas upp vid olika temperaturer (20 ° C till 30 ° C) och infektion studier kan utföras mellan 15 ° C och över 37 ° C 12,13, så att experiment som efterliknar en däggdjurs miljö. Dessutom, är insekter uppfödning lätt och relativt billigt. Infektion av larverna medger övervakning bakteriell virulens på olika sätt, including beräkning av LD 50 14, mätning av bakteriell överlevnad 15,16 och undersökning av infektionen processen 17. Här beskriver vi uppfödning av insekter, som omfattar alla stadier i G. mellonella. Vi erbjuder ett detaljerat protokoll av infektion av två vägar för ympning: muntlig och inom haemocoelic. Den bakteriella modell som används i detta protokoll är Bacillus cereus, en grampositiv patogener inblandad i mag liksom i andra svåra lokala eller systemiska opportunistiska infektioner 18,19.
Protocol
1. Insect Uppfödning
Hela cykeln från ägg till sista stadiets larver varar ca 5 veckor vid 25 ° C. En eller 2 extra veckor behövs för att få vuxna fjärilar.
- Placera minst 100 puppor eller nyligen sammanslagna vuxen G. mellonella fjärilar i en 5-liters trådnät bur. Manliga fjärilar mäter 10 till 15 mm. Den vuxna manliga fjäril är beige med svagt ljus och mörka markeringar. Kvinna fjärilar mäter omkring 20 mm. Honorna är mörkare än män med en brun / grå färg.
- Suspendera två förpackningar med fyra skikt papper i buren för äggläggning. Efter 2 dagar kommer den vuxna kvinnliga lägga ägg på kanten mellan tidningarna.
- Två gånger i veckan, placera ägg-papper förpackningar i nya plast uppfödning lådor med galler för att låta luft cirkulera, som innehåller pollen och bivax. Äggen kläcks i ca 3 dagar och små larver börjar utvecklas genom att mata på vax och pollen. Alternativt kan larver placeras på en konstgjord diet consisting av en blandning av 500 g flytande honung, 400 g glycerin, 100 g torkad öljäst, 250 g vetemjöl, 200 g skummjölkspulver och 400 g polenta. Att tillhandahålla lämpliga förhållandet mat per larv, regelbundet separera larverna till nya boxar och fylla maten varannan dag.
- Larver föds under de sex stegen i larv stadion. Varje stadion kännetecknas av glidning av huvudet kapseln av larver. När larverna når det sista steget före förpuppning, slutar de äta och börja bygga en ljus siden kokong.
- I sina skyddande kokonger kommer larverna vila och förvandlas till puppor. Vax maskar kvar i puppan scenen för 1-2 veckor att dyka in i vuxen nattfjärilar. De vuxna nattfjärilar dricker inte heller äta. Parning sker och vax maskar "livscykel börjar igen.
- Att standardisera patologi analysen ta larverna under den sista larvstadiet. Under detta skede de slutar utfodring, flytta till locket på uppfödning rutan och börja producera silke. Denna sTage varar cirka 5 dagar.
2. Insekt Val för Infection
- Välj förra stadiets larver, som är 2-3 cm långa och 180-250 mg i vikt, 24 timmar före infektioner och sätta dem i en tom låda att svälta dem.
- Ta bort den begynnande silke kokong runt larverna.
3. Bakteriell Framställning
- Förbered Bacillus bakteriesuspensioner att erhålla slutliga koncentrationer från 10 4 kolonibildande enheter (cfu) / ml till 10 8 cfu / ml för intra haemocoelic injektion och från 3x10 6 cfu / ml till 1x10 8 cfu / ml för förtäring (CFU att erhålla en LD 50 beror på de bakteriearter). I vårt fall, B. cereus odlas i Luria-Bertani-buljong-medium (LB, 10 g / l trypton, 5 g / l jästextrakt, 10 g / l NaCl) vid 37 ° C under omröring tills inträde i stationär fas, motsvarande BÖJNING av tillväxten kurva. Mät OD 600 nm (mellan 1 och 2 för B. cereus) och använda den för att utvärdera bakteriell koncentration, med användning av en tidigare gjord titrerkurva. Harvest bakterier genom centrifugering vid 5.000 xg i 10 minuter vid rumstemperatur och återsuspendera i fosfatbuffrad saltlösning (PBS: 1M KH 2 PO 4, 1 M K 2 HPO 4, 5M NaCl, pH 7,2). Varje larv får 10 pl bakteriell suspension vid den önskade koncentrationen.
- Alternativt kan sporsuspension vara beredd på infektion. Skaffa sporer genom att odla bakterierna i mediet sporbildningen HCT (5 g / L trypton, 2 g / L kaseinhydrolysat, 12,5 mM K 2 HPO 4, 12,5 mM MgSO 4, 0,05 mM MnSO 4, 1,2 mM ZnSO 4, 1,2 mM Fe 2 (SO 4) 3, 0,5% H 2 SO 4, 25 mM CaCl 2) 20 vid 30 ° C under 3 dagar. Harvest sporer genom centrifugering (10.000 x g, 15 minuter), och tvätta två gånger i sterilt destillerat vatten. Resuspendera spor pellåt i sterilt destillerat vatten och värm i 15 minuter vid 78 ° C för att avlägsna återstående vegetativa bakterier. Räkneförmåga suspensionen genom utstrykning serieutspädningar på LB-agarplattor. Varje larv får 10 il sporsuspension vid den önskade koncentrationen.
4. Cry Toxin Förberedelser
- Förbered Cry1C toxin från B. thuringiensis-stam 407 transformerad med plasmiden pHTF31C 21 bär Cry1C gen som kodar. Kultur stammen i 100 ml HCT medium vid 30 ° C i 72 timmar med antibiotika (erytromycin 10mg/ml) för att tillåta fullt sporulering, toxin kristall produktion och frigörelse i odlingssupematanten.
- Rena kristaller från supernatanten på en 72% -79% sackarosgradient. Först lägga 17 ml 79% sackaros i en 40 ml rör. Försiktigt skiktet 17 ml 72% sackaros ovanpå 79% sackaros. Slutligen lager 5-6 ml 10X koncentrerade sporulerade kultur och stäng röret. Centrifugera röret i 14 h vid 20,000 xg, 4 ° C, för att separera kristallerna från sporerna. Samla kristallerna vid lutning gränsytan. Resuspendera kristallen pelleten i 25 ml kallt sterilt vatten för att tvätta den. Centrifugera vid 8.000 xg under 20 minuter. Detta steg upprepas tre gånger för att avlägsna all sackaros fastnar på kristallerna. Återsuspendera kristallerna i 5 ml sterilt vatten och observera under mikroskop för att utvärdera renhet.
- Utvärdera koncentration toxin protein genom klassisk Bradford färgning på kristall lösning presolubilized i 50 mM NaOH. Toxin kristaller kan lagras vid -20 ° C fram till användning.
5. Injektor Förberedelser
- För att styra den exakta injektionsvolym, använd en automatiserad sprutpump (t.ex. KD Scientific KDS 100) med installationen hastighet till 1 pl / sek (Figur 1A).
- Fyll en 1 ml injektionsspruta med 300 pl vatten eller den bakteriella lösningen (1 spruta per betingelse) för infektion på 20-25 larver. Ta bort bubblorna genom att försiktigt tapping sprutan, sedan bifoga en 0,45 x 12 mm nål till sprutan.
- Sätt sprutan på injektom.
- Utför en tom injektion av 10 pl i ett tomt rör för att styra den injicerade volymen.
6. Insekt Intrahaemocoelic Injektion
- Placera insekten manuellt mellan tummen och pekfingret. Sedan in nålen fast i injektorn i larven huden (nagelband) (Figur 1C).
- Håll insekten på plats medan injicera 10 ^ bakteriella lösning (spor eller vegetativt bakterier).
- Ta försiktigt bort insekten från nålen.
- Placera den infekterade insekten i en liten Petri-skål (5 cm i diameter), 5 larver per skål.
- Infect minst 20 larver för varje experimentell betingelse.
- Placera skålarna vid 37 ° C i en inkubator under 48 timmar.
7. Insect tvångsmatning (Förtäring)
- I ett 2 ml Eppendorf-rör, blanda 0,2 pg / & mU, l Cry1C toxin med antingen spor eller vegetativt cellsuspension för att få slutliga koncentrationer från 3x10 4 till 1x10 7 per 10 pl.
- Fyll en 1 ml spruta med en 30G, 25 st mm hypodermisk med 300 ul av den bakteriella-Cry1C toxin lösning för infektion av 20-25 larver. Avlägsna bubblor från sprutan.
- Placera insekten manuellt så att dess mynning kommer nålen fast i injektorn (figur 1D), och kraft-mata den med 10 | il av den bakteriella lösningen med användning av automatiserade sprutpump.
- Infect minst 20 larver för varje experimentell betingelse.
- Placera den infekterade insekten i en liten 5 cm petriskål (5 larver per maträtt). Placera skålarna vid 37 ° C i en inkubator under 48 timmar.
8. Inspelning Insekt Dödlighet
- Efter tvångsmatning eller injicering experiment, håll larver i petriskålen utan mat vid 25 ° C eller 37 ° C. Kontrollera larver MOrtality regelbundet under en 48 timmarsperiod. Döda larver är inerta och vanligtvis blir svart (Figur 1B).
- Dödlighet data kan analyseras med hjälp av log-probit-programmet 14. Detta program testar lineariteten hos dos-dödlighet och ger dödliga doser (LD 50). Alternativt kan andra program, till exempel Prism (Graph Pad), analysera överlevnad eller data dödlighet användas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intra haemocoelic injektion av bakterier i G. mellonella har visat mycket användbar för identifiering av många virulensfaktorer behandlar vävnadsskada och motstånd mot medfödda immun faktorer av flera humana patogener. Som ett exempel, representerar figur 2A insekt dödlighet efter injektion av olika doser av B. cereus bakterier (vildtyp och mutanta stammar) 22. Figur 2B representerar bakteriell överlevnad efter infektion av G. mellonella av Pseudomonas aeruginosa 4.
Användningen av Galleria som en oral infektion modell för B. cereus och B. thuringiensis bygger på utvärdering av den synergistiska effekten av de vegetativa bakterier eller sporer på insektsdödande aktivitet Cry1C toxin 10. Larverna är känsliga för intag av spor / toxin blandning, men är endast svagt mottagliga för intag av Cry1C-toxin enbart. De larver död resultat septikemi efter bakterier har nått haemocoel efter nedbrytning av intestinala hinder. Figur 3 visar larver dödlighet efter intag av kristaller och antingen vildtyp eller mutant stammar av Bacillus bakterier 10.
Få bakterier har testats för oral infektion i Galleria. Bland de humana patogener testade B. cereus stammar med Cry1C toxin var den mest virulenta för G. mellonella efter oral infektion 24. Denna metod kan användas för att övervaka infektion / kolonisering av mag-tarmkanalen. Faktiskt, såsom visas i fig 4, kan larven matsmältningskanalen extraheras efter infektion, och värdcellinjer ändringar liksom bakteriell kolonisering kan visualiseras på histologiska paraffinsektioner. Dessutom kan intag av fluorescerande bakterier kan användas för att följa banan och kolonisationen promusik, få tillgång längs de olika avdelningarna i larverna. Slutligen, kan den specifika expressionen av en gen i de olika facken insekters övervakas genom fluorescerande mikroskopi 25.
Figur 1. (A) Automatiserad sprutpump injektor. (B) Död (topp, svart) och levande (botten, vit) G. mellonella larver. (C) Bakterier injiceras i haemocoel av G. mellonella larver. (D) G mellonella larver är tvångsmatas med bakteriell förberedelse: nålen går in i mynningen av insektslarver.
Figur 2. Resultat efter intra haemocoelic injektion. (A) CwpFM virulens mot G. mellonella larver 22. Olika koncentrationer av B. cereus WilD-typ (Bt 407) och ΔcwpFM mutantstammarna inokulerades i haemocoel av 20 G. mellonella larver. Dödligheten registrerades efter 24 timmar vid 37 ° C. (B) Tid under Pseudomonas aeruginosa PA14 infektion i G. mellonella 4. Tjugofem bakterier per larv injicerades vid tiden noll. Larver krossades vid de angivna tidpunkterna efter infektion och bakterietal bestämdes genom plätering. Varje datapunkt representerar medelvärdet och standardavvikelsen för bakterietal från 10 grupper om 10 larver. Larver dog ungefär 48 timmar efter injektion, då bakteriella koncentrationer nådde 10 9 / g..
Figur 3. Synergism av sporer och Cry1C kristaller toxin som en utvärdering av patogenicitet i G. mellonella larver efter oralt intag 10. G. mellonella larve oralt infekterade med antingen Cry1C toxin kristaller (1 pg per larv) eller med 10 6 B. thuringiensis sporer, eller med en blandning av Cry1C toxin och B. thuringiensis sporer. Larver mortalitet utvärderades efter 48 timmar vid 25 ° C.
Figur 4 Oral infektion av larver:. Kolonisering och vävnadslokalisering av bakterier. (A) 10 pl av blått färgämne lösningen infördes genom tvångsmatning i munnen av ett G. mellonella larv. Larven dissekerades att avslöja tarmen fylld med det blåa färgämnet. (B) En blandning av Bt 407 stammen och Cry1C toxin infördes i G. mellonella larver genom tvångsmatning. Efter 24 timmar var hela larver paraffininbäddad, klippa och fasta. Histologiska längsgående sektioner färgades (hematoxylin & Eosin och Gram ansträngande). Ljuset mikroskopfotografi (400X) visar tarmen (mörklila) och Gram färgade Bacillus (mörk violett) lokaliserad vid intestinala ytan. (C) En blandning av Bt 407-GFP fluorescerande stam och Cry1C toxin infördes i G. mellonella larver genom tvångsmatning. Efter 24 timmar, har bakterierna nått haemocoel och insekten kadaver fylls med B. cereus uttrycker grönt fluorescerande protein. (D) Analys av Ilsa uttryck in vivo 25. Mikroskopiska iakttagelser av epifluorescens utfördes på B. cereus bär pHT315-pilsA'gfp. Bakterier isolerades från hemocoel döda larver 24 timmar efter oral infektion. Gröna bakterier indikerar uttryck av GFP på grund av aktiveringen av ILSA promotorn. Detta visar uttryck av denna gen (Ilsa) när bakterierna har nått haemocoel.
Film 1. Spridning av lösning i insekten tarmen efter oral äterjon. 10 pl av blå färglösning infördes genom tvångsmatning i munnen majsmott Ostrinia nubilalis larv. Färgämnet fyller snabbt i tarmen lumen insektslarver. Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av insekter och speciellt larvstadiet, som infektion modeller för flera patogener, blir vanligare. En modell av val för vissa aspekter är Drosophila (flyga modell) används som både vuxna och larvstadiet 1,2. Den lepidopteran insekt G. mellonella har också huvudsakligen använts för att analysera bakteriell virulens genom injektion. Fördelen med tolerera högre temperaturer (över 37 ° C) än Drosophila (max 25 ° C) är viktigt när däggdjur patogener ska studeras. Även storleken på Galleria är mer praktiskt för att studera infektion kinetik och vävnadsskada. Slutligen beskriver vår protokoll möjligheten att använda Galleria för oral infektion, vilket är en fördel för studier relaterade till mag-tarmkanalen. På liknande sätt är larvstadiet av en annan stor larv, Manduca sexta, används för att studera infektioner genom injektion i haemocoel och mer nyligen för oral infektion 26.B. mori och Spodoptera arter, vilket genomen sekvenseras 27 erbjuder även intressanta alternativ, och värdgener kan stängas av RNAi metoder eller andra manipulationer gen 28. Här beskriver vi på ett enkelt sätt, hur man uppfostra Galleria larver, hur man infektera dem och några exempel på hur man följa infektionen processen och poäng dödlighet för att visa potentialen i sådana modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Elisabeth Guillemet, Christophe Buisson och Ludovic Bridoux för utmärkt tekniskt stöd. Vi är mycket skuld till Sylvie Salamitou och Sinda Fedhila för den första systeminställningsprogrammet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax and pollen | La Ruche Roanaise | 303000 | Any honey producer |
| Automated syringe pump | KD Scientific | KDS 100 | |
| Syringe 1 ml | Terumo | BS 01T | |
| Needle 0.45 x 12 mm | Terumo | NN 2613R | |
| Petri dish 5 cm | VWR | 89000-300 | |
| Needle 30G, 25 mm hypodermic | Burkard Mfg. Co. Ltd. | PDE0005 |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Vodovar, N., Acosta, C., Lemaitre, B., Boccard, F. Drosophila: a polyvalent model to decipher host-pathogen interactions. Trends Microbiol. 12, 235-242 (2004).
- Dalhammar, G., Steiner, H. Characterization of inhibitor A, a protease from Bacillus thuringiensis which degrades attacins and cecropins, two classes of antibacterial proteins in insects. Eur. J. Biochem. 139, 247-252 (1984).
- Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
- Purves, J., Cockayne, A., Moody, P. C., Morrissey, J. A. Comparison of the regulation, metabolic functions, and roles in virulence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase homologues gapA and gapB in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78, 5223-5232 (2010).
- Chadwick, J. S. Serological responses of insects. Fed. Proc. 26, 1675-1679 (1967).
- Chadwick, J. S., Caldwell, S. S., Chadwick, P. Adherence patterns and virulence for Galleria mellonella larvae of isolates of Serratia marcescens. J. Invertebr. Pathol. 55, 133-134 (1990).
- Gao, W., et al. Two novel point mutations in clinical Staphylococcus aureus reduce linezolid susceptibility and switch on the stringent response to promote persistent infection. PLoS Pathog. 6, e1000944 (2010).
- Peleg, A. Y., et al. Reduced susceptibility to vancomycin influences pathogenicity in Staphylococcus aureus infection. J. Infect. Dis. 199, 532-536 (2009).
- Salamitou, S., et al. The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects. Microbiology. 146, 2825-2832 (2000).
- Cadot, C., et al. InhA1, NprA and HlyII as candidates to differentiate pathogenic from non-pathogenic Bacillus cereus strains. J. Clin. Microbiol. 48, 1358-1365 (2010).
- Rejasse, A., et al. Temperature-dependent production of various PlcR-controlled virulence factors in Bacillus weihenstephanensis strain KBAB4. Appl. Environ. Microbiol. 78, 2553-2557 (2012).
- Jones, R. T., et al. Photorhabdus adhesion modification protein (Pam) binds extracellular polysaccharide and alters bacterial attachment. BMC Microbiol. 10, 141 (2010).
- Finney, D. J. Probit analysis. , Cambridge University Press. (1971).
- Fedhila, S., Nel, P., Lereclus, D. The InhA2 metalloprotease of Bacillus thuringiensis strain 407 is required for pathogenicity in insects infected via the oral route. J. Bacteriol. 184, 3296-3304 (2002).
- Guillemet, E., et al. The InhA metalloproteases of Bacillus cereus contribute concomitantly to virulence. J. Bacteriol. 192, 286-294 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lereclus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Curr. Opin. Microbiol. 15, 1-12 (2012).
- Bottone, E. J. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 23, 382-398 (2010).
- Stenfors Arnesen, L., Fagerlund, A., Granum, P. From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Rev. 32, 579-606 (2008).
- Lecadet, M., Blondel, M. O., Ribier, J. Generalized transduction in Bacillus thuringiensis var. berliner 1715, using bacteriophage CP54. Ber. J. Gen. Microbiol. 121, 203-212 (1980).
- Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J., Lereclus, D. Construction of new insecticidal Bacillus thuringiensis recombinant strains by using the sporulation non-dependent expression system of cryIIIA and a site specific recombination vector. J. Biotechnol. 48, 81-96 (1996).
- Tran, S. L., Guillemet, E., Gohar, M., Lereclus, D., Ramarao, N. CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation and virulence. J. Bacteriol. 192, 2638-2642 (2010).
- Tran, S. L., et al. Hemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages. Cell Microbiol. 13, 92-108 (2011).
- Fedhila, S., et al. Comparative analysis of the virulence of invertebrate and mammalian pathogenic bacteria in the oral insect infection model Galleria mellonella. J. Invertebr. Pathol. 103, 24-29 (2010).
- Daou, N., et al. IlsA, a unique surface protein of Bacillus cereus required for iron acquisition from heme, hemoglobin and ferritin. PLoS Pathog. 5, e1000675 (2009).
- Mason, K. L., et al. From commensal to pathogen: translocation of Enterococcus faecalis from the midgut to the hemocoel of Manduca sexta. MBio. 2, e00065-00011 (2011).
- Goldsmith, M. R., Shimada, T., Abe, H. The genetics and genomics of the silkworm, Bombyx mori. Annu. Rev. Entomol. 50, 71-100 (2005).
- Fraser, M. J. Insect transgenesis: current applications and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 57, 267-289 (2012).
