Summary
大蜡蛾幼虫的口腔内和haemocolic的感染
Abstract
细菌毒力的研究，往往需要一个合适的动物模型。哺乳动物感染模型是昂贵的，并且可能引发的伦理问题。利用害虫感染模型提供了一个有价值的替代方案。相比其他无脊椎动物型号的主机，如线虫，昆虫有比较先进的抗菌防御系统，因而更容易产生哺乳动物感染过程中的相关信息。像哺乳动物，昆虫具有一个复杂的先天免疫系统1。血淋巴中的细胞能够吞噬或微生物入侵封装，和体液免疫应答的诱导生产的溶菌酶和小抗菌肽2,3。此外，昆虫的幼虫中肠哺乳动物的消化系统和肠道细胞的上皮细胞被发现之间的类比。最后，如细胞粘附，抗细菌感染的过程中必需的几个基本元件抗菌肽，组织退化和适应氧化应激是在昆虫和哺乳动物1可能是重要的。因此，昆虫是多价的工具，参与哺乳动物感染的微生物毒力因子的识别和表征。
已经示出的大蜡蛾蜡螟幼虫提供一个有用的洞察发病机制中的范围广泛的包括哺乳动物真菌（ 尖孢镰孢 ， 烟曲霉 ， 白色念珠菌 ）和细菌病原体的微生物感染，如金黄色葡萄球菌 ， 变形杆菌粘质沙雷氏菌绿脓杆菌 ， 单核细胞增生李斯特氏菌或粪肠球菌 4-7的 。无论是细菌种类，得到的结果与广场通过直接注射感染的幼虫通过角质层不断与那些相似LAR哺乳动物研究：在哺乳动物模型是减毒的细菌菌株，表现出较低的广场 ，并造成了严重的人类感染菌株的毒力也非常致命的广场模型8-11。口腔感染的广场是不常用的和额外的化合物，如特定的毒素，需要达到的死亡率。
蜡螟幼虫本几个技术的优点：它们是比较大的（末龄幼虫化蛹前约2厘米长，重250毫克），使定义的注射剂量的细菌，它们可以被饲养在不同温度下（20° C至30℃）和感染的研究可以进行15℃之间，以上述37℃，12,13，允许模仿的哺乳动物的环境的实验。此外，养虫很容易和相对便宜的。感染的幼虫可以通过以下几种方式，其中包括监测细菌的毒力LD 50 14克计算，测量的细菌存活15,16和检查感染过程17。在这里，我们描述了饲养的昆虫，覆盖所有生命阶段的G.大蜡螟 。通过两种途径接种：口腔内haemocoelic我们提供了一个详细的协议的感染。在该协议中使用的细菌模型是蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），革兰氏阳性病原体在胃肠道，以及在其他严重的局部或全身的机会性感染18,19牵连。
Protocol
1。养虫
末龄幼虫从卵到整个周期持续大约5个星期，在25°C。需要一个或2个星期获得成年蝴蝶。
- 将至少100蛹或新合并的成人G.中大蜡螟的蝴蝶在一个5升的金属丝网笼。雄性蝴蝶测量10到15毫米。成年的雄蛾是米色微弱的灯光和深色斑纹。约20毫米的女蝴蝶措施。女性比男性与棕色/灰色暗。
- 在产蛋笼换暂停四层两包纸。术后第2天，成年女性会下蛋的边缘之间的文件。
- 一个星期两次，将在新的塑料饲养盒蛋纸包装网格，让空气流通，含有花粉和蜂蜡。在3天左右孵出小幼虫开始发展的蜡和花粉为食。另外，幼虫的人工饲料consistin可以放置在克的混合液体蜂蜜500克，甘油400克，100克干燥啤酒酵母，250克小麦面粉，200克脱脂奶粉和400克玉米粥。要提供适当的比例，每幼虫的食物，定期到新的箱子中分离出来的幼虫，每两天补充食品。
- 幼虫的饲养过程中的六个阶段的幼虫体育场。每个体育场的特征在于由头壳幼虫的滑移。当幼虫达到化蛹前的最后阶段，他们停止摄食，并开始了建设一支轻型茧丝绸。
- 在他们的保护茧，幼虫会休息，转换成蛹。蜡虫留在一到两个星期出现成蛾蛹的阶段。成蛾，不喝酒，也不吃。交配发生，蜡虫的生命周期又重新开始。
- 为了规范病理分析，在过去的幼虫阶段的幼虫。在这个阶段，他们停止摄食，移动到饲养箱的盖子，并开始生产丝绸。在这踏歌持续时间大约为5天。
2。感染昆虫选择：
- 末龄幼虫，长2-3厘米，重量在180-250毫克，24小时前感染的选择，并把它们放到一个空框，饿死他们。
- 删除新生的茧丝绸左右的幼虫。
3。细菌制剂
- 准备芽孢杆菌的细菌悬浮液，得到的最终浓度范围从10 4菌落形成单位（cfu）/ ml的10 8菌落形成单位/毫升帧内haemocoelic注射，从3×10 6菌落形成单位/毫升至1×10 8菌落形成单位/ ml的摄取（菌落形成单位，得到的LD 50取决于细菌物种）。在我们的例子中，B.蜡状芽孢杆菌生长的Luria-Bertani肉汤培养基（LB，10克/升胰化蛋白胨，5克/升酵母提取物，10克/升的NaCl）中于37℃搅拌下，直到进入固定相，对应于向内弯曲的增长曲线。测量外径600纳米（为 B 1和2之间蜡状芽孢杆菌 ），并使用它来 评估细菌的浓度，使用以前所做的滴定曲线。通过离心收获细菌以5,000 xg离心10分钟，在室温下和重新悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS：1M KH 2 PO 4，1M，K 2 HPO 4，5M的NaCl，pH 7.2）中。每个幼虫将获得所需浓度的细菌悬浮液的10微升。
- 另外，孢子悬浮液可以准备感染。获取在产孢培养基HCT（5克/升胰化蛋白胨，2克/升酪蛋白水解物，12.5 mM的K 2 HPO 4，12.5 mM的用MgSO 4，0.05 mM的水硫酸锰4，1.2毫摩尔的ZnSO 4，1.2 mM的铁通过培养的细菌的孢子2（SO 4）3，0.5％的H 2 SO 4，25mM的CaCl 2的 ）20在30℃下3天。收获孢子，通过离心（10,000 xg离心，15分钟），并在无菌蒸馏水中洗两次。重悬孢子像素让在无菌蒸馏水中和热，在78℃，持续15分钟，以除去剩余的植物性细菌。且具通过电镀LB琼脂平板上的连续稀释的悬浮液中。每个幼虫将获得所需浓度的孢子悬浮液的10微升。
4。 Cry毒素准备
- 准备的Cry1C的毒素从B.转化的苏云金芽孢杆菌菌株407的的质粒pHTF31C 21携带的基因编码Cry1C。文化在100毫升HCT介质的压力在30°C，72小时与抗生素（红霉素10mg/ml的），以便能完整的孢子，培养上清中的毒素晶体生产和人民解放。
- 从上清液中提纯晶体在72％-79％的蔗糖密度梯度。首先，添加17毫升79％的蔗糖在40毫升的试管。小心层17毫升72％蔗糖的79％蔗糖的顶部。最后，层5-6毫升10X浓缩形成孢子的培养和关闭管。在20,00离心管14小时0×g离心，4℃，以分离从孢子晶体。收集晶体的梯度接口。重悬的晶体颗粒在25毫升冷无菌水来清洗。 8,000 xg离心20分钟，离心。此步骤重复三次，以除去所有坚持的晶体的蔗糖。重悬在5ml无菌水的结晶，并在显微镜下观察，以评价纯度。
- 评估经典布拉德福德水晶的解决方案presolubilized在50 mM NaOH溶液染色的毒蛋白浓度。毒素晶体可以被存储在-20℃直至使用。
5。喷油器准备
- 要控制的精确的注射量，使用自动注射器泵（ 例如 KD科学KDS 100）与设置速度为1微升/秒（ 图1A）。
- 填写300μl水1毫升注射器20-25幼虫感染或细菌溶液（1注射器每个条件）。除去气泡，仔细TApping注射器，然后将一个0.45×12毫米针头的注射器。
- 放置在喷射器的注射器。
- 在空管控制注射量，注射10微升执行空白。
6。昆虫Intrahaemocoelic注射液
- 手工将昆虫的拇指和食指之间。然后插入针固定在喷射器中的幼虫的皮肤（角质层）（ 图1C）。
- 保持昆虫的地方，而注射10微升菌液（无性孢子或细菌）。
- 小心地取出昆虫针。
- 放置在一个小的陪替氏培养皿（直径5厘米），每皿5幼虫感染的昆虫。
- 感染每个实验条件下至少20个幼虫。
- 将菜在37°C，在48小时的孵化器。
7。昆虫灌食（摄入）
- 在2 ml Eppendorf管中，混合0.2微克/＆MU;升Cry1C毒素，无论是孢子或植物细胞悬液，以获得最终浓度为每10微升3×4×10 7。
- 填充一个1ml注射器，30G，25毫米皮下注射针，用300μl的20-25幼虫感染细菌Cry1C毒素溶液。删除从注射器中的气泡。
- 手动昆虫放置，使得它的嘴进入针固定在所述喷射器（ 图1D），和力与10μl的细菌溶液使用自动化的注射器泵喂养它。
- 感染每个实验条件下至少20个幼虫。
- 将感染的昆虫在一个小5厘米的培养皿（5幼虫每道菜）。将菜在37°C，在48小时的孵化器。
8。拍摄昆虫死亡
- 灌食或注射实验后，保持在25°C或37°C的培养皿中，没有食物的幼虫检查幼虫个月rtality经常在48小时内。死亡的幼虫都是有惰性的，通常变成黑色（ 图1B）。
- 死亡率数据进行分析程序使用的日志概率14。此程序测试的剂量死亡率曲线的线性，并提供了致死剂量（LD 50）。另外，其他程序，如棱镜（图表垫），分析生存或死亡的数据可以使用。
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Representative Results
细菌的内部haemocoelic注射到G.蜡螟已被证明是非常有用的许多毒力因子的识别处理与组织损伤和抗几种人类病原体的先天免疫因素。作为一个例子， 图2A表示B 的各种剂量注射后的昆虫死亡率蜡状芽孢杆菌菌（野生型和突变株）22。 图2B表示细菌感染后存活的G.蜡螟由铜绿假单胞菌 4。
使用口腔感染模型B.广场蜡样芽胞杆菌和 B。 苏云金芽孢杆菌营养细菌或孢子Cry1C毒素10的杀虫活性的协同效应，依赖于评价。幼虫很容易摄入孢子/毒素混合物，但只有微弱的容易摄入CRY1单独Ç毒素。败血症后细菌的幼虫死亡的结果已经达到了血腔的肠道屏障的崩溃。 图3表示幼虫死亡后，摄入的晶体，无论是野生型和突变株芽孢杆菌属细菌10。
一些细菌已经过测试，口服感染广场 。其中的人类病原体测试，B.蜡样芽胞杆菌株与Cry1C毒素是最致命的G.大蜡螟口腔感染后24。此方法可用于监视的胃肠道感染/定植。事实上，正如图4中所示，可以幼虫消化道感染后提取，和对组织学石蜡切片可以被可视化的宿主细胞，修改以及细菌定植。此外，摄入的荧光的细菌可以被用来追踪的轨迹和定植亲塞斯的幼虫沿着不同的车厢。最后，特异性表达的基因在不同的昆虫室可以监视由荧光显微镜25。
图1（A）自动注射泵喷射。 （B）死（顶部，黑色），充满活力（底部，白）G.大蜡螟幼虫。 （C）注入细菌在血腔G 的大蜡螟幼虫。 （D）G.大蜡螟的幼虫强行喂食细菌制剂：针进入口腔的幼虫。
图2结果后帧内haemocoelic注射。 （A）对G. CwpFM毒力大蜡螟幼虫22。各种浓度的B。蜡样芽胞杆菌西港岛线d-型（Bt基因407）和ΔcwpFM突变菌株接种到20 G.血腔大蜡螟幼虫。在37℃下24小时后记录死亡率（B）的时间过程中， 铜绿假单胞菌 PA14 在 G中感染大蜡螟 4。二十五个细菌每幼虫注射在时间为零。在指定的时间点后感染幼虫被粉碎，并通过电镀确定细菌计数。每个数据点代表的细菌的数量从10个组的10个幼虫的平均值和标准偏差。幼虫死亡约48小时后注射，当细菌浓度达到10 9 /克。
图3 在 G中的致病性作为评价的孢子和Cry1C毒素晶体中的协同作用。口服后10 大蜡螟幼虫。G.大蜡螟幼虫e的口服感染任Cry1C毒素晶体（1微克每幼虫），或与10 6 B.苏云金芽孢杆菌的孢子，或与Cry1C毒素和 B的混合苏云金芽孢。幼虫死亡率进行了评估48小时后，在25°C
图4。口腔感染的幼虫：定植的细菌和组织定位。 （A）10μl的蓝色染料溶液是由口灌食的G.大蜡螟幼虫。解剖的幼虫以显示肠道填充用的蓝色染料。 （B）的Bt 407应变和Cry1C毒素的混合物引入G.大蜡螟幼虫灌食。 24小时后，整个幼虫，石蜡包埋，切割和固定。组织学的纵向切片进行染色（苏木精和曙红和革兰氏束紧）。光学显微照片（400X）肠（深紫色），革兰氏染色芽孢杆菌 （暗紫色）定位在肠表面。 （C）的甲的Bt的混合物407-GFP广告荧光的应变和Cry1C毒素引入G.大蜡螟幼虫灌食。 24小时后，细菌已达到血腔和昆虫的尸体填充带有 B表达绿色荧光蛋白的蜡状 。 （D）的伊尔莎表达分析体内 25。由萤光显微镜观察B.蜡样芽胞杆菌携带pHT315-pilsA'gfp。口腔感染后24小时死亡的幼虫血淋巴中分离出细菌。绿色细菌表示因的伊尔莎启动子的激活的gfp表达。这显示出特异表达的基因（ILSA）时，细菌已经达到了血腔。
动画1。在昆虫肠道传播的解决方案，口服摄取离子。蓝染料溶液的10μl的欧洲玉米螟玉米螟幼虫进入口引入的力馈送。染料迅速填补在肠腔内的幼虫。 点击这里观看电影 。
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Discussion
的昆虫，特别是幼虫阶段，对多种致病菌的感染模型，使用频繁。一个模式的选择是果蝇的某些方面（飞行模式），用于成人和幼虫期1,2。鳞翅目昆虫G.蜡螟也已主要通过注射用于测定细菌的毒力。承受较高的温度（高于37℃）比果蝇 （最多25℃）的优点是很重要的，当哺乳动物病原体以进行研究。此外，大小广场更方便的感染动力学研究和组织损伤。最后，我们的协议描述了使用口腔感染，这是一个优势研究相关 的消化道广场的可能性。同样，另一家大型烟草天蛾的毛毛虫，幼虫阶段的研究感染的血腔注射到最近的口腔感染26。家蚕和甜菜的基因组被测序27种，还提供有趣的选择，并通过RNAi方法或其他基因操作28宿主基因被关闭。这里，我们描述在一个简单的方法，如何抚养广场幼虫，如何感染它们如何遵循感染过程和得分死亡率为了说明这种模型的潜力和一些例子。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们想，克里斯托夫·比松感谢伊丽莎白Guillemet的优秀的技术援助和Ludovic Bridoux。我们非常感激西尔维Salamitou和Sinda Fedhila的初始系统设置。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax and pollen | La Ruche Roanaise | 303000 | Any honey producer |
| Automated syringe pump | KD Scientific | KDS 100 | |
| Syringe 1 ml | Terumo | BS 01T | |
| Needle 0.45 x 12 mm | Terumo | NN 2613R | |
| Petri dish 5 cm | VWR | 89000-300 | |
| Needle 30G, 25 mm hypodermic | Burkard Mfg. Co. Ltd. | PDE0005 |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Vodovar, N., Acosta, C., Lemaitre, B., Boccard, F. Drosophila: a polyvalent model to decipher host-pathogen interactions. Trends Microbiol. 12, 235-242 (2004).
- Dalhammar, G., Steiner, H. Characterization of inhibitor A, a protease from Bacillus thuringiensis which degrades attacins and cecropins, two classes of antibacterial proteins in insects. Eur. J. Biochem. 139, 247-252 (1984).
- Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
- Purves, J., Cockayne, A., Moody, P. C., Morrissey, J. A. Comparison of the regulation, metabolic functions, and roles in virulence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase homologues gapA and gapB in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78, 5223-5232 (2010).
- Chadwick, J. S. Serological responses of insects. Fed. Proc. 26, 1675-1679 (1967).
- Chadwick, J. S., Caldwell, S. S., Chadwick, P. Adherence patterns and virulence for Galleria mellonella larvae of isolates of Serratia marcescens. J. Invertebr. Pathol. 55, 133-134 (1990).
- Gao, W., et al. Two novel point mutations in clinical Staphylococcus aureus reduce linezolid susceptibility and switch on the stringent response to promote persistent infection. PLoS Pathog. 6, e1000944 (2010).
- Peleg, A. Y., et al. Reduced susceptibility to vancomycin influences pathogenicity in Staphylococcus aureus infection. J. Infect. Dis. 199, 532-536 (2009).
- Salamitou, S., et al. The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects. Microbiology. 146, 2825-2832 (2000).
- Cadot, C., et al. InhA1, NprA and HlyII as candidates to differentiate pathogenic from non-pathogenic Bacillus cereus strains. J. Clin. Microbiol. 48, 1358-1365 (2010).
- Rejasse, A., et al. Temperature-dependent production of various PlcR-controlled virulence factors in Bacillus weihenstephanensis strain KBAB4. Appl. Environ. Microbiol. 78, 2553-2557 (2012).
- Jones, R. T., et al. Photorhabdus adhesion modification protein (Pam) binds extracellular polysaccharide and alters bacterial attachment. BMC Microbiol. 10, 141 (2010).
- Finney, D. J. Probit analysis. , Cambridge University Press. (1971).
- Fedhila, S., Nel, P., Lereclus, D. The InhA2 metalloprotease of Bacillus thuringiensis strain 407 is required for pathogenicity in insects infected via the oral route. J. Bacteriol. 184, 3296-3304 (2002).
- Guillemet, E., et al. The InhA metalloproteases of Bacillus cereus contribute concomitantly to virulence. J. Bacteriol. 192, 286-294 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lereclus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Curr. Opin. Microbiol. 15, 1-12 (2012).
- Bottone, E. J. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 23, 382-398 (2010).
- Stenfors Arnesen, L., Fagerlund, A., Granum, P. From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Rev. 32, 579-606 (2008).
- Lecadet, M., Blondel, M. O., Ribier, J. Generalized transduction in Bacillus thuringiensis var. berliner 1715, using bacteriophage CP54. Ber. J. Gen. Microbiol. 121, 203-212 (1980).
- Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J., Lereclus, D. Construction of new insecticidal Bacillus thuringiensis recombinant strains by using the sporulation non-dependent expression system of cryIIIA and a site specific recombination vector. J. Biotechnol. 48, 81-96 (1996).
- Tran, S. L., Guillemet, E., Gohar, M., Lereclus, D., Ramarao, N. CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation and virulence. J. Bacteriol. 192, 2638-2642 (2010).
- Tran, S. L., et al. Hemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages. Cell Microbiol. 13, 92-108 (2011).
- Fedhila, S., et al. Comparative analysis of the virulence of invertebrate and mammalian pathogenic bacteria in the oral insect infection model Galleria mellonella. J. Invertebr. Pathol. 103, 24-29 (2010).
- Daou, N., et al. IlsA, a unique surface protein of Bacillus cereus required for iron acquisition from heme, hemoglobin and ferritin. PLoS Pathog. 5, e1000675 (2009).
- Mason, K. L., et al. From commensal to pathogen: translocation of Enterococcus faecalis from the midgut to the hemocoel of Manduca sexta. MBio. 2, e00065-00011 (2011).
- Goldsmith, M. R., Shimada, T., Abe, H. The genetics and genomics of the silkworm, Bombyx mori. Annu. Rev. Entomol. 50, 71-100 (2005).
- Fraser, M. J. Insect transgenesis: current applications and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 57, 267-289 (2012).
