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Immunology and Infection

L'insetto doi: 10.3791/4392 Published: December 11, 2012

Summary

Orale e infezioni intra haemocolic di larve della tarma della cera maggiore

Abstract

Lo studio della virulenza batterica richiede spesso un modello animale adatto. Modelli mammiferi di infezione sono molto costosi e possono sollevare questioni etiche. L'uso di insetti come modelli di infezione fornisce una valida alternativa. Rispetto ad altri non vertebrati host modello come nematodi, insetti hanno un sistema relativamente avanzato di difesa antimicrobici e sono quindi più in grado di produrre informazioni rilevanti per il processo di infezione dei mammiferi. Come mammiferi, insetti possiedono un complesso sistema immunitario innato 1. Le cellule della emolinfa sono in grado di phagocytosing o riassume invasori microbici, e le risposte umorali includono la produzione di peptidi antibatterici inducibile lisozima e piccole 2,3. Inoltre, si riscontrano analogie tra le cellule epiteliali di insetto midguts larvali e cellule intestinali dei sistemi digestivi mammiferi. Infine, alcuni componenti di base essenziali per il processo di infezione batterica, come adesione cellulare, resistenzapeptidi antimicrobici, il degrado dei tessuti e l'adattamento allo stress ossidativo sono suscettibili di essere importante in entrambi i insetti e mammiferi 1. Così, gli insetti sono strumenti polivalenti per l'identificazione e la caratterizzazione di fattori di virulenza microbici coinvolti nelle infezioni mammiferi.

Larve di falena maggiore della cera Galleria mellonella hanno dimostrato di fornire una visione utile nella patogenesi di una vasta gamma di infezioni fungine microbiche inclusi mammiferi (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) e batteri patogeni, quali Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris , Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes o Enterococcus faecalis 4-7. Indipendentemente dalla specie batteriche, i risultati ottenuti con larve Galleria infettato da iniezione diretta attraverso la cuticola costantemente correlate con quelle di similar studi mammiferi: ceppi batterici che sono attenuati nei modelli mammiferi dimostrano minore virulenza in Galleria, e le tensioni che causano gravi infezioni umane sono altamente virulenti nel modello Galleria 8-11. Infezione orale della Galleria è molto meno usato e ulteriori composti, come le tossine specifiche, sono necessari per raggiungere la mortalità.

G. mellonella larve presentano diversi vantaggi tecnici: sono relativamente grandi (ultima larve instar prima pupation sono circa 2 cm e peso 250 mg), consentendo così l'iniezione di dosi prestabilite di batteri, possono essere allevati a diverse temperature (20 ° studi C a 30 ° C) e l'infezione può essere condotta tra 15 ° C al di sopra di 37 ° C 12,13, consentendo esperimenti che simulano un ambiente di mammifero. Inoltre, l'allevamento degli insetti è facile e relativamente a buon mercato. L'infezione delle larve permette di monitorare virulenza batterica in vari modi, sapcalcolo g di LD 50 14, la misura di sopravvivenza batterica 15,16 e l'esame del processo di infezione 17. Qui, descriviamo l'allevamento degli insetti, che copre tutte le fasi della vita di G. mellonella. Forniamo un dettagliato protocollo di infezione da due vie di inoculazione: haemocoelic orale e intra. Il modello batterica utilizzato in questo protocollo è Bacillus cereus, un patogeno Gram positivi implicati in gastrointestinale e in altre gravi infezioni locali o sistemiche opportunistiche 18,19.

Protocol

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1. Allevamento insetti

L'intero ciclo da uovo all'ultimo larve instar dura circa 5 settimane a 25 ° C. Uno o 2 settimane supplementari sono necessari per ottenere farfalle adulte.

  1. Inserire almeno 100 pupe o di nuova fusione adulto G. farfalle mellonella in un 5 litri maglia metallica gabbia. Farfalle maschio misurare 10 a 15 mm. La falena maschio adulto è beige con la luce debole e macchie scure. Donna misura farfalle di circa 20 mm. Le femmine sono più scure dei maschi con un marrone / grigio.
  2. Sospendere due pacchetti di quattro strati di carta nella gabbia per la deposizione delle uova. Dopo 2 giorni, la femmina adulta si depongono le uova sul bordo tra le carte.
  3. Due volte a settimana, posizionare le uova di carta confezioni in nuove scatole di allevamento di plastica con griglie per permettere all'aria di circolare, contenente polline e cera d'api. Le uova si schiudono in circa 3 giorni e piccole larve iniziano a sviluppare nutrendosi di cera e polline. In alternativa, le larve possono essere posizionati su una dieta artificiale consisting di una miscela di 500 g di miele liquido, glicerina 400 g, 100 g di lievito di birra essiccato, farina di frumento 250 g, 200 g di latte scremato in polvere e 400 g polenta. Per fornire il rapporto adeguato di cibo per larva, regolarmente separare le larve in scatole nuove e riempire il cibo ogni due giorni.
  4. Le larve sono allevati durante le sei fasi dello stadio larva. Ogni stadio è caratterizzato dalla slittamento della capsula testa di larve. Quando le larve raggiungono l'ultima tappa prima impupamento, smettono di alimentazione e iniziare a costruire un bozzolo di seta leggera.
  5. Nelle loro bozzoli protettivi, le larve si riposerà e si trasformano in pupe. Vermi di cera rimangono in fase di pupa per una o due settimane per emergere in falene adulte. Le falene adulte non bere né mangiare. L'accoppiamento avviene e il ciclo di vita dei vermi di cera 'ricomincia.
  6. Per uniformare il saggio patologia, prendere le larve durante l'ultimo stadio larvale. Durante questa fase si fermano alimentazione, spostare il coperchio della scatola di allevamento e iniziare a produrre la seta. Questo stage dura circa 5 giorni.

2. Selezione insetti per l'infezione

  1. Selezionare ultimo larve instar, che sono 2-3 cm di lunghezza e 180-250 mg di peso, 24 ore prima di infezioni e metterle in una scatola vuota per farli morire di fame.
  2. Rimuovere il bozzolo di seta attorno al nascente larve.

3. Preparazione batterica

  1. Preparare sospensioni batteriche Bacillus per ottenere concentrazioni finali che vanno da 10 4 unità formanti colonie (ufc) / ml a 10 8 cfu / ml per iniezione intra haemocoelic e da 3x10 6 cfu / ml a 1x10 8 cfu / ml per ingestione (la ufc per ottenere un LD 50 dipende dalla specie batterica). Nel nostro caso, B. cereus è coltivato in Luria-Bertani brodo (LB, 10 g / l triptone, 5 g / l di estratto di lievito, 10 g / l NaCl) a 37 ° C sotto agitazione fino all'entrata in fase stazionaria, corrispondente alla incurvation della crescita curva. Misurare le OD (600 nmtra 1 e 2 di B. cereus) e usarlo per valutare la concentrazione batterica, utilizzando una curva di titolazione precedentemente fatto. Batteri raccolto per centrifugazione a 5000 xg per 10 min a temperatura ambiente e risospendere in tampone fosfato isotonico (PBS: 1M KH 2 PO 4, 1M K 2 HPO 4, 5M NaCl, pH 7,2). Ogni larva riceverà 10 ml di sospensione batterica alla concentrazione desiderata.
  2. In alternativa, sospensione di spore può essere preparato per l'infezione. Ottenere spore coltivando i batteri nella sporulazione mezzo HCT (5 g / L triptone, 2 g / L caseina idrolizzato, 12,5 mm K 2 HPO 4, 12.5 mM MgSO4, 0.05 mM MnSO 4, 1,2 mm ZnSO 4, 1.2 mM Fe 2 (SO 4) 3, 0,5% H 2 SO 4, 25 mM CaCl 2) 20 a 30 ° C per 3 giorni. Harvest spore mediante centrifugazione (10.000 xg, 15 min), e lavare due volte in acqua distillata sterile. Risospendere il pel sporelasciate in acqua distillata sterile e calore per 15 min a 78 ° C per rimuovere residui batteri vegetativi. Numerare la sospensione da placcatura diluizioni seriali su piastre di agar LB. Ogni larva riceverà 10 pl di sospensione di spore alla concentrazione desiderata.

4. Cry Preparazione Tossina

  1. Preparare la tossina Cry1C dal B. ceppo thuringiensis 407 trasformato con il plasmide pHTF31C 21 portando la Cry1C gene codificante. Coltura del ceppo in mezzo HCT 100 ml a 30 ° C per 72 ore con antibiotici (eritromicina 10mg/ml) per consentire sporulazione completa, cristallo produzione della tossina e liberazione nel supernatante di coltura.
  2. Purificare cristalli dal supernatante su un gradiente di saccarosio 72% -79%. Prima aggiungere 17 ml di 79% saccarosio in una provetta 40 ml. Attentamente strato 17 ml di saccarosio 72% sopra il 79% di saccarosio. Infine, strato 5-6 ml della coltura concentrato 10X sporigeni e chiudere il tubo. Centrifugare la provetta per 14 ore a 20,000 xg, a 4 ° C, per separare i cristalli dalle spore. Raccogliere i cristalli all'interfaccia gradiente. Risospendere il pellet di cristallo in 25 ml di acqua fredda sterile per lavarlo. Centrifugare a 8000 xg per 20 min. Questo passaggio viene ripetuto tre volte per rimuovere tutti saccarosio aderiscano alle cristalli. Risospendere i cristalli in 5 ml di acqua sterile ed osservare al microscopio per valutare la purezza.
  3. Valutare la concentrazione di proteine ​​tossina mediante colorazione classica Bradford sulla soluzione a cristalli presolubilized in 50 mM NaOH. Cristalli tossina può essere conservato a -20 ° C fino all'uso.

5. Iniettore Preparazione

  1. Per controllare il volume esatto di iniezione, utilizzare una pompa automatizzato siringa (es Scientific KDS KD 100) con velocità di installazione a 1 ml / sec (Figura 1A).
  2. Riempire una siringa da 1 ml ipodermica con 300 microlitri di acqua o la soluzione batterica (1 siringa per condizione) per l'infezione di 20-25 larve. Rimuovere le bolle con cura tapping la siringa, quindi fissare un x 0.45 12 ferri alla siringa.
  3. Posizionare la siringa nell'iniettore.
  4. Effettuare un'iniezione vuoto di 10 microlitri in un tubo vuoto per controllare il volume iniettato.

6. Insetto iniezione Intrahaemocoelic

  1. Posizionare l'insetto manualmente tra il pollice e l'indice. Quindi inserire l'ago fissato l'iniettore nella pelle larva (cuticola) (Figura 1C).
  2. Tenere l'insetto in posizione durante l'iniezione di 10 ul di soluzione batterica (batteri spore o vegetativa).
  3. Rimuovere con cautela l'insetto dall'ago.
  4. Posizionare l'insetto infetto in una piccola scatola di Petri (5 cm di diametro), 5 larve per piatto.
  5. Infect almeno 20 larve per ogni condizione sperimentale.
  6. Porre le capsule a 37 ° C in un incubatore per 48 ore.

7. Forza alimentazione degli insetti (Ingestione)

  1. In una provetta Eppendorf da 2 ml, miscelare 0,2 mg / m &u; l di tossina Cry1C sia con sospensione cellulare spore o vegetativa ottenere concentrazioni finali che vanno da 3x10 a 1x10 4 7 per 10 pl.
  2. Riempire una siringa da 1 ml con una 30G, 25 ago ipodermico mm con 300 microlitri della soluzione batterica-Cry1C tossina per l'infezione di 20-25 larve. Rimuovere le bolle dalla siringa.
  3. Posizionare l'insetto manualmente in modo che la sua bocca entra l'ago fissato l'iniettore (Figura 1D), e forzarlo a mangiare con 10 pl della soluzione batterica utilizzando la pompa automatizzato siringa.
  4. Infect almeno 20 larve per ogni condizione sperimentale.
  5. Posizionare l'insetto infetto in un piccolo 5 centimetri Petri (5 larve per piatto). Porre le capsule a 37 ° C in un incubatore per 48 ore.

8. Registrazione Insetto Mortalità

  1. Dopo gli esperimenti di ingozzatura o iniezione, mantenere le larve nella scatola di Petri senza cibo a 25 ° C o 37 ° C. Controllare larvale mortality regolarmente per un periodo di 48 ore. Larve morte sono inerti e di solito diventa nero (Figura 1B).
  2. I dati di mortalità possono essere analizzati utilizzando il log-probit programma 14. Questo programma collauda la linearità delle curve di mortalità dose e fornisce dosi letali (LD 50). In alternativa, altri programmi, come Prism (grafico Pad), analizzando la sopravvivenza o dati di mortalità possono essere utilizzati.

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Representative Results

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Intra haemocoelic iniezione di batteri in G. mellonella è stato dimostrato molto utile per l'identificazione di fattori di virulenza molti occupano di danno tissutale e resistenza a fattori immuni innate di diversi agenti patogeni umani. Come esempio, la figura 2A rappresenta la mortalità insetto dopo iniezione di varie dosi di B. batteri cereus (wild type e mutanti) 22. figura 2B rappresenta la sopravvivenza dopo l'infezione batterica di G. mellonella da Pseudomonas aeruginosa 4.

L'uso di Galleria come un modello di infezione orale per B. cereus e B. thuringiensis si basa sulla valutazione dell'effetto sinergico dei batteri vegetativi o spore sull'attività insetticida della tossina Cry1C 10. Le larve sono sensibili alla ingestione di spore / tossina miscela ma sono solo debolmente suscettibile alla ingestione di Cry1C tossina alone. I risultati di morte delle larve di setticemia dopo i batteri hanno raggiunto la haemocoel in seguito alla rottura delle barriere intestinali. Figura 3 rappresenta la mortalità larvale dopo l'ingestione dei cristalli e sia wild type o mutanti di batteri Bacillus 10.

Pochi i batteri sono stati testati per l'infezione orale in Galleria. Tra i patogeni umani testati, B. ceppi cereus con tossina Cry1C erano più virulenti di G. mellonella dopo l'infezione per via orale 24. Questo metodo può essere utilizzato per monitorare l'infezione / colonizzazione del tratto gastro intestinale. Infatti, come mostrato in figura 4, il tratto digestivo larva può essere estratto dopo l'infezione, e modificazioni della cellula ospite nonché colonizzazione batterica può essere visualizzato su sezioni in paraffina istologiche. Inoltre, l'ingestione di batteri fluorescenti può essere utilizzata per seguire la traiettoria e la pro colonizzazioneCESS lungo i diversi compartimenti delle larve. Infine, l'espressione di un gene specifico nei diversi comparti di insetto possono essere monitorate da microscopia fluorescente 25.

Figura 1
Figura 1. (A) Automated siringa iniettore pompa. (B) Dead (in alto, nero) e vivo (in basso, bianco) G. mellonella larve. (C) I batteri vengono iniettati nella haemocoel di G. mellonella larve. (D) G. larve mellonella sono alimentati forzatamente con la preparazione batterica: l'ago entra nella bocca del larve di insetti.

Figura 2
Figura 2. Risultati dopo l'iniezione intra haemocoelic. (A) virulenza CwpFM contro G. mellonella larve 22. Varie concentrazioni di B. cereus wild-type (Bt 407) e ΔcwpFM ceppi mutanti sono stati inoculati nella haemocoel del 20 G. mellonella larve. La mortalità è stata registrata dopo 24 ore a 37 ° C. (B) Naturalmente il tempo di Pseudomonas aeruginosa PA14 infezione in G. mellonella 4. Venticinque batteri per larva stato iniettato al tempo zero. Le larve sono stati schiacciati al momento indicato punti di post-infezione e conte batteriche sono stati determinati mediante placcatura. Ciascun punto di dati rappresenta la media e la deviazione standard della conta batterica da 10 gruppi di 10 larve. Le larve è morto circa 48 ore dopo l'iniezione, quando le concentrazioni batteriche raggiunto il 10 9 / g.

Figura 3
Figura 3. Sinergismo di spore e cristalli tossina Cry1C come una valutazione della patogenicità in G. larve mellonella dopo l'ingestione orale 10. G. mellonella larvae sono stati infettati per via orale sia con cristalli tossina Cry1C (1 pg per larva), o con 10 6 B. spore thuringiensis, o con un mix di tossina Cry1C e B. thuringiensis spore. Mortalità larve è stata valutata dopo 48 ore a 25 ° C.

Figura 4
Figura 4 l'infezione orale di larve:. Colonizzazione e localizzazione dei tessuti di batteri. (A) 10 pl di soluzione di colorante blu è stato introdotto da alimentazione forzata nella bocca di un G. mellonella larva. La larva è stato sezionato per rivelare l'intestino riempito con il colorante blu. (B) Una miscela di 407 Bt ceppo e tossina Cry1C stato introdotto in G. larve mellonella di alimentazione forzata. Dopo 24 ore, le larve generale erano inclusi in paraffina, tagliato e fissato. Istologiche sezioni longitudinali sono state colorate (ematossilina & Eosina e Gram sforzo). La fotografia al microscopio ottico (400X) mostra l'intestino (viola scuro) e il Bacillus Gram tinto (viola scuro) localizzata sulla superficie intestinale. (C) Una miscela di 407-Bt Gfp ceppo fluorescente e tossina Cry1C stato introdotto in G. larve mellonella di alimentazione forzata. Dopo 24 ore, i batteri hanno raggiunto la haemocoel e il cadavere è pieno di insetti B. cereus esprimenti la proteina fluorescente verde. (D) Analisi dell'espressione ILSA in vivo 25. Osservazioni microscopiche di epifluorescenza sono stati eseguiti su B. cereus che trasportano pHT315-pilsA'gfp. I batteri sono stati isolati dal hemocoel di larve morti 24 ore dopo l'infezione orale. Batteri verdi indicano espressione di GFP causa l'attivazione del promotore ILSA. Questo dimostra l'espressione specifica di questo gene (ILSA), quando i batteri hanno raggiunto la haemocoel.

Movie 1. Diffusione di soluzione nell'intestino dell'insetto dopo orale ingerireione. 10 ml di soluzione di colorante blu è stato introdotto da alimentazione forzata in bocca europea larva piralide Ostrinia nubilalis. Il colorante riempie rapidamente nel lume intestinale delle larve di insetti. Clicca qui per visualizzare filmati .

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Discussion

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L'uso di insetti e in particolare la fase larvale, come modelli di infezione per i patogeni più, sta diventando frequente. Un modello di scelta per alcuni aspetti è Drosophila (il modello di volo) utilizzato come adulti e 1,2 stadio larvale. L'insetto lepidotteri G. mellonella stato anche utilizzato principalmente per saggiare la virulenza batterica per iniezione. Il vantaggio di tollerare temperature più elevate (oltre i 37 ° C) rispetto Drosophila (massimo 25 ° C) è importante quando patogeni mammiferi sono da studiare. Anche la dimensione della Galleria è più conveniente per studiare cinetiche infezioni e danni ai tessuti. Infine, il nostro protocollo descrive la possibilità di utilizzare per Galleria infezione orale, che è un vantaggio per studi relativi al tratto digerente. Analogamente, lo stadio larvale di un altro grande bruco, Manduca sexta, viene utilizzato per studiare le infezioni mediante iniezione nel haemocoel e più recentemente per infezione orale 26.B. mori e specie Spodoptera, che genomi sequenziati sono 27 offrono anche alternative interessanti, e geni dell'organismo ospite può essere spento con metodi RNAi o manipolazioni genetiche di altri 28. Qui, descriviamo in modo semplice, come allevare larve di Galleria, come di infettare loro e alcuni esempi su come seguire il processo di infezione e mortalità punteggio, al fine di mostrare le potenzialità di tali modelli.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Elisabeth Guillemet, Christophe Buisson e Ludovic Bridoux per un'eccellente assistenza tecnica. Siamo molto in debito con Sylvie Salamitou e Sinda Fedhila per la configurazione iniziale del sistema.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wax and pollen La Ruche Roanaise 303000 Any honey producer
Automated syringe pump KD Scientific KDS 100
Syringe 1 ml Terumo BS 01T
Needle 0.45 x 12 mm Terumo NN 2613R
Petri dish 5 cm VWR 89000-300
Needle 30G, 25 mm hypodermic Burkard Mfg. Co. Ltd. PDE0005

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References

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L&#39;insetto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come un modello di infezione potente per Indagare Patogenesi batterica
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Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).More

Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).

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