Summary
大きいワックス蛾の幼虫の経口およびイントラhaemocolic感染
Abstract
細菌の病原性の研究は、多くの場合、適切な動物モデルを必要とします。感染の哺乳動物モデルは高価であり、倫理的な問題が発生することがあります。感染モデルとして昆虫の使用は貴重な代替手段を提供します。このような線虫のような他の非脊椎動物モデルのホストに比べ、昆虫は、抗菌防御の比較的高度なシステムを持って、その結果、より多くの哺乳類の感染過程に関連する情報を生成する可能性があります。哺乳類と同様に、昆虫は、複雑な自然免疫系1を所有しています 。体液中の細胞は、微生物の侵略を貪食または封入することが可能であり、かつ体液性応答はリゾチームと小さな抗菌ペプチド2,3の誘導生産を含む。また、アナロジーは昆虫幼虫中腸および哺乳類消化器系の腸細胞の上皮細胞間に発見されています。このような細胞接着などの細菌感染過程に不可欠な最後に、いくつかの基本的なコンポーネントへの抵抗抗菌ペプチド、組織の劣化や酸化ストレスへの適応は、昆虫や哺乳類1の両方で重要であると思われる。このように、昆虫は哺乳類の感染症に関与微生物の病原因子の同定および特徴付けのための多価ツールです。
大きいワックス蛾ハチノスツヅリガの幼虫は、 黄色ブドウ球菌 、 プロテウス·ブルガリなどの哺乳動物の真菌（ フザリウム·オキシスポルム 、 アスペルギルスフミガタ 、 カンジダ·アルビカンス ）および細菌性病原体を含む微生物感染症の広い範囲の病因に有用な洞察を提供することが示されている、 セラチア、緑膿菌 、 リステリア菌や腸球菌 4-7。かかわらず、細菌種の、キューティクルを通して直接注入することにより感染ガレリア幼虫を用いて得られた結果は、一貫してシミのそれらと相関LAR哺乳類研究：哺乳動物モデルで減衰された細菌株は、 ガレリアの低い病原性を示すもので、重篤なヒトへの感染を引き起こす株は、 ガレリアモデル8-11の強毒性である。 ガレリアの経口感染が化合あまり使用され、追加され、特定の毒素のように、死亡率に到達するために必要とされています。
G. mellonella幼虫存在するいくつかの技術的な利点：彼らはこのように細菌の定義された用量の注入を可能にする、（蛹化前の終齢幼虫が250ミリグラム約2cm長いとウェイトです）比較的大である、彼らは、様々な温度（20℃で飼育することができる30℃〜C）と感染症研究は、哺乳類の環境を模倣した実験を可能にする、37℃12,13の上に15℃の間で行うことができる。また、昆虫の飼育は簡単で、比較的安価です。幼虫の感染症はいくつかの手段、includinによって細菌の病原性を監視することができますLD 50 14グラムの計算では、細菌の生存15,16および感染過程17の検査の測定。ここでは、Gのすべてのライフステージをカバーする、昆虫の飼育を記述mellonella。口腔内およびhaemocoelic：我々は、接種の2つのルートによる感染の詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルに使用される細菌のモデルは、 セレウス菌 、胃腸にだけでなく、他の重篤な局所または全身性日和見感染18,19に関与グラム陽性病原体である。
Protocol
1。昆虫飼育
卵から終齢幼虫への全サイクルは、25℃で約5週間です1つまたは2つの追加の週は、大人の蝶を得るために必要とされている。
- 少なくとも100蛹または新しくマージされた大人のGを置く5リットルの金網ケージ内mellonella蝶 。男性蝶は10〜15 mmを測定します。成人男性蛾がかすかな光と闇のマーキングとベージュです。 20ミリメートルの周りの女性の蝶対策。雌は茶色/グレー色で、男性よりも暗くなります。
- 産卵用ケージに4層の紙の2つのパックを一時停止します。 2日後、成人女性は、論文間の端に卵を産むでしょう。
- 週2回、花粉や蜜ろうを含んだ空気が循環するようにグリッドを使用して、新しいプラスチックの飼育箱で卵の紙パックを置く。卵は約3日で孵化し、小さな幼虫は、ワックスや花粉を食べて開発を開始。あるいは、幼虫は人工飼料consistin上に配置することができます500グラムの液体蜂蜜のミックスのグラム、400グラムグリセリン、100グラム、乾燥ビール酵母、250グラムの小麦粉、200グラム脱脂粉乳と400グラムポレンタ。幼虫当たりの食品の適切な比率を提供するために、定期的に新しい箱に幼虫を分離し、2日おきに餌を補給してください。
- 幼虫は幼虫スタジアムの6段階で飼育されています。各スタジアムは幼虫の頭部カプセルの滑りによって特徴づけられる。幼虫は蛹化前の最後の段階に到達するとき、彼らは摂食を停止し、光絹繭の構築を開始。
- その保護繭では、幼虫は休もうと蛹に変身。ワックスワームは、成人蛾に出てくるまで1〜2週間の蛹の段階で残っています。大人の蛾は飲みも食べません。合が発生し、ワックスワームのライフサイクルが再び開始されます。
- 病理アッセイを標準化するために、最後の幼虫期幼虫を取る。この段階では、彼らが供給を停止し、飼育箱のカバーに移動して、絹の生産を開始。このsタジさんは5日程度かかります。
2。感染症のための昆虫セレクション
- 2〜3センチ、重量が180から250ミリグラムアール終齢幼虫を選択感染前24時間およびそれらを飢えさせる空のボックスに入れます。
- 幼虫の周りに生まれたばかりのシルクの繭を削除します。
3。細菌の準備
- 経口摂取について10 4コロニー形成単位（cfu）から/ mlのイントラhaemocoelic注射用10 8 cfu / mlにとcfu / mlで3×10 6〜1×10 8 cfu / mlの範囲の最終濃度（取得するCFUを取得するためにバチルス菌懸濁液を調製LD 50）は、細菌種に依存しています。我々の場合、B.でセレウス菌は、ルリア-ベルターニブロス培地で栽培されている（LB、10g / lのトリプトン、5 g / l酵母エキス、10g / lのNaCl）で37℃で攪拌下になるまでの成長の湾曲に対応した固定相への参入、カーブ。 OD 600 nmを測定する（Bの1と2の間セレウス菌 ）と以前に作成した滴定曲線を用いて、細菌濃度を評価するためにそれを使用します。室温とリン酸に再懸濁し、10分間5000×gで遠心分離によって収穫細菌は（：1MのKH 2 PO 4、1M K 2 HPO 4、5MのNaCl、pH7.2のPBS）緩衝生理食塩水。各幼虫は所望の濃度で細菌懸濁液10μlを受け取ることになります。
- 代わりに、胞子懸濁液が感染して調製することができる。胞子形成培地HCT（5g / Lのトリプトン、2g / Lのカゼイン加水分解物、12.5 mMのK 2 HPO 4、12.5 mMの硫酸マグネシウム 、0.05mMののMnSO 4、1.2mMのZnSO 4を 、1.2mMのFeの中の細菌を培養して胞子を得る30℃2（SO 4）3、0.5％H 2 SO 4、25mMのCaCl 2）を20℃で3日間。収穫遠心分離により胞子（10,000×gで、15分間）し、滅菌蒸留水で2回洗浄する。胞子PELを再懸濁し°Cの残りの栄養型細菌を除去するために78℃で15分間滅菌蒸留水と熱でみましょう。 LB寒天プレート上で連続希釈液をメッキすることにより懸濁液を数え上げる。各幼虫は所望の濃度で胞子懸濁液10μlを受け取ることになります。
4。毒素製剤を叫ぶ
- BからCry1C毒素を準備チューリンゲンシス菌株407をコードする遺伝子を有するプラスミドCry1C pHTF31C 21で形質転換された。 30℃で100mlのHCTの培地で培養菌株°と72時間Cフル胞子形成、培養上清中の毒素結晶製造と解放を可能にする（エリスロマイシン10mg/mlの）抗生物質。
- 72パーセント-79％ショ糖勾配上清から結晶を精製する。最初の40 mlチューブの79％ショ糖の17ミリリットルを追加します。 79％ショ糖の上に72％のスクロースを注意深く層17ミリリットル。最後に、層10倍濃縮胞子形成培養の5-6 mlおよびチューブを閉じます。 20,00で14時間チューブを遠心0×gで、4℃、胞子から結晶を分離する。勾配界面で結晶を集める。それを洗うために25ミリリットル冷滅菌水で結晶ペレットを再懸濁します。 20分間8000 xgで遠心分離します。このステップは、結晶に付着するすべてのスクロースを削除するには、3回繰り返されます。 5ミリリットル滅菌水の結晶を再懸濁し、純度を評価するために、顕微鏡下で観察する。
- 50 mMのNaOHにpresolubilized結晶ソリューション上の古典的なブラッドフォード染色によって毒素タンパク質濃度を評価する。毒素結晶は使用するまで-20℃で保存することができます。
5。インジェクターの準備
- 正確な注入量を制御するには、1μL/秒（ 図1A）に設定速度で自動化されたシリンジポンプ（ 例えば 、KD科学KDS 100）を使用します。
- 300μlの水、または20から25の幼虫の感染の菌液（条件当たり1シリンジ）を1mlの皮下注射器を埋める。慎重TAによって気泡を除去シリンジpping、その後シリンジに0.45×12 mmの針を取り付けます。
- 注射器で注射器を置きます。
- 注入量を制御するために、空のチューブに10μlのブランク注入を実行します。
6。昆虫Intrahaemocoelicインジェクション
- 親指と人差し指の間に手動で昆虫を置きます。その後幼虫皮膚におけるインジェクタ（キューティクル）（ 図1C）で固定針を挿入します。
- 10μLの菌液を（胞子または栄養細菌）を注入しながら所定の位置に昆虫を保つ。
- 慎重に針から昆虫を削除します。
- 小さなペトリ皿（直径5cm）、皿あたり5幼虫に感染した昆虫を置きます。
- 各実験条件のために少なくとも20の幼虫に感染します。
- 48時間インキュベーター内で37℃で皿を置きます。
7。昆虫強制給餌（摂取）
- 2ミリリットルエッペンドルフチューブに、0.2μgの/＆mを混ぜるU; 3×10 4〜10μlあたり1×10 7の範囲の最終濃度を得るためにいずれかの胞子又は栄養細胞懸濁液とCry1C毒素のリットル。
- 20から25までの幼虫の感染の細菌Cry1C毒素溶液300μlで、30Gと25mmの皮下注射針を1mlシリンジを埋める。シリンジから気泡を除去する。
- 手動ので、その口はインジェクタ（ 図1D）で固定針を入力すると、自動化されたシリンジポンプを用いて細菌溶液10μlとそれを強制的に食べさせることが虫を置きます。
- 各実験条件のために少なくとも20の幼虫に感染します。
- 小5センチメートルペトリ皿（シャーレ当たり5幼虫）に感染した昆虫を置きます。 48時間インキュベーター内で37℃で皿を置きます。
8。記録昆虫死亡
- 強制給餌又は注射の実験の後、25℃フードなしでシャーレ内の幼虫を保つ℃または37℃幼虫のmoをチェック48時間の期間にわたって定期的にrtality。死んだ幼虫は不活性であり、通常は黒を（ 図1B）を入れます。
- 死亡率のデータは、log-プロビット·プログラム14を用いて分析することができる。このプログラムは、線量の死亡曲線の直線性をテストし、致死量（LD 50）を提供しています。あるいは、生存または死亡データを分析するようなプリズム（グラフパッド）などの他のプログラムを使用することができる。
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Representative Results
G.に細菌のイントラhaemocoelic注入mellonellaは、いくつかのヒト病原体の自然免疫因子に対する組織損傷および抵抗を扱う多くの病原因子の同定のために非常に有用であることが証明されています。例として、 図2A は Bの様々な用量の注射後、昆虫の死亡率を表すセレウス菌 （野生型と変異株）22は、 図2Bは、Gの感染後の細菌の生存を表す緑膿菌で4 mellonella。
Bの経口感染モデルとしてガレリアの使用セレウス菌およびB. thuringiensisの毒素は Cry1C 10の殺虫活性に栄養型細菌や芽胞の相乗効果の評価に依存しています。幼虫は胞子/毒素の混合物の摂取の影響を受けやすいだけCry1の摂取に弱く敏感であるC単独毒素。敗血症から幼虫の死亡の結果細菌は、腸の壁の崩壊後体腔に到達した後、 図3は、結晶の摂取と野生型またはバチルス属細菌の変異株10のいずれか後の幼虫の死亡率を表しています。
いくつかの細菌はガレリアで経口感染するかテストされています。人間の病原体は、B.、テストの間でCry1C毒素によるセレウス菌株はGの最も病原性を示した経口感染後24 mellonella。このメソッドは、胃腸管の感染/保菌を監視するために使用できます。 図4に示すように、実際、幼虫の消化管は、感染後に抽出することができ、宿主細胞の変更だけでなく、細菌のコロニー形成は、組織学的パラフィン切片上で可視化することができる。また、蛍光菌の摂取は、軌道と植民地化のプロをフォローするために使用することができ幼虫の異なる区画に沿って目的税。最後に、別の昆虫のコンパートメント内での遺伝子の特異的発現を蛍光顕微鏡25により監視することができます。
図1（A）は、自動化されたシリンジポンプインジェクター。 （B）がデッド（トップ、黒）と生きている（下、白）·G mellonellaの幼虫。 （C）は細菌がGの体腔に注入されるmellonellaの幼虫。 （D）のG. mellonellaの幼虫は細菌の準備を無理やり食べさせられたとおりです。針は昆虫の幼虫の口に入った。
図2内haemocoelic注射後の結果。 G.に対して、（A）CwpFM毒性mellonella幼虫 22。 B.種々の濃度セレウス菌ウィルDタイプ（BT 407）、ΔcwpFM変異株はG. 20の体腔内に接種したmellonellaの幼虫。死亡率は、37℃で24時間後に記録されたGの緑膿菌感染のPA14（B）の時間経過mellonella 4。幼虫当たり二十五細菌はゼロ時間で注入した。幼虫を示した時点で、感染後に破砕し、細菌数は、めっきによって決定された。各データポイントは、10幼虫の10グループからの細菌数の平均値と標準偏差を表しています。細菌の濃度が10 9 / gに達したときに、幼虫は、注射後約48時間後に死亡した。
図3 Gにおける病原性の評価など、胞子とCry1C毒素結晶の相乗効果経口摂取後10 mellonellaの幼虫。G. mellonella幼虫eは経口Cry1C毒素結晶（幼虫当たり1μg）のいずれかを、または10 6 Bに感染していたチューリンゲンシス菌の胞子、またはCry1C毒素A と Bのミックスでチューリンゲンシス菌の胞子。幼虫の死亡率は25℃で48時間後に評価した
図4幼虫の経口感染：細菌のコロニー形成および組織局在。 （A）が青色色素溶液の10μlをGの口に強制給餌によって導入されましたmellonella幼虫 。幼虫は青色の色素で充填した腸管を明らかにするために切開した。 （B）はBtを407株とCry1C毒素の混合物はG.に導入された強制給餌によってmellonellaの幼虫。 24時間後、全体の幼虫は、パラフィン、埋め込まれたカットと固定した。組織学的縦切片（ヘマトキシリン＆エオシン及びグラムいきみ）染色した。光顕微鏡写真（400X）は、腸（濃い紫色）と腸の表面に局在グラム染色バチルス （ダークバイオレット）を示しています。 （C）は、Btの混合物407-GFP蛍光ひずみとCry1C毒素はG.に導入された強制給餌によってmellonellaの幼虫。 24時間後、細菌が体腔に達していると昆虫の死体は Bで満たされている緑色蛍光タンパク質を発現するセレウス 。 生体 25 のILSA式 （D）の分析。落射蛍光顕微鏡による観察はBで行われたpHT315-pilsA'gfpを運ぶセレウス 。細菌が経口感染後に死んだ幼虫が24時間の血体腔から分離された。緑色細菌はILSAプロモーターの活性化のためにGFPの発現を示す。細菌が体腔に到達したとき、これは、この遺伝子の特異的発現（ILSA）を示しています。
ムービー1。経口摂取後に昆虫腸内の溶液の拡散イオン。青色色素溶液の10μlをアワノメイガアワノメイガnubilalis幼虫の口の中に強制給餌によって導入されました。染料はすぐに昆虫の幼虫の腸内腔を埋めます。 ムービーを見るにはここをクリック 。
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Discussion
昆虫、特に幼虫期の使用は、いくつかの病原体の感染モデルとして、頻繁になってきています。いくつかの側面のための選択のモデルは、大人と幼虫期の1,2の両方として使用ショウジョウバエ （フライモデル）です。鱗翅目昆虫G. mellonellaも主に注射することにより細菌の病原性を検定するために使用されています。哺乳類の病原体が研究されている場合ショウジョウバエよりも大目に高温（37℃以上）（最大25℃）の利点は重要です。またガレリアのサイズが感染動態および組織損傷を研究するためのより便利である。最後に、我々のプロトコルは、消化管に関連する研究のための利点である口腔感染症のためにガレリアを使用する可能性を説明しています。同様に、別の大きな毛虫、たばこスズメガの幼虫は、体腔に注入することによって感染症を勉強して、もっと最近経口感染26にするために使用されます。27ゲノム配列決定されるカイコおよびハスモンヨトウの種は、また興味深い選択肢を提供し、ホストの遺伝子がRNAiのメソッドやその他の遺伝子操作28でシャットダウンすることができます。ここで、我々は彼らとこのようなモデルの可能性を示すために、感染過程とスコア死亡率に追随する方法についていくつかの例を感染させる方法、 ガレリアの幼虫を育てる方法を、簡単な方法で説明します。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、優れた技術支援のためにエリザベートギュメ、クリストフ·ビュイソンとルドビクBridouxに感謝したいと思います。我々は、システムの初期設定のためのシルヴィーSalamitouとSINDA Fedhilaに大いに世話になっています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax and pollen | La Ruche Roanaise | 303000 | Any honey producer |
| Automated syringe pump | KD Scientific | KDS 100 | |
| Syringe 1 ml | Terumo | BS 01T | |
| Needle 0.45 x 12 mm | Terumo | NN 2613R | |
| Petri dish 5 cm | VWR | 89000-300 | |
| Needle 30G, 25 mm hypodermic | Burkard Mfg. Co. Ltd. | PDE0005 |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Vodovar, N., Acosta, C., Lemaitre, B., Boccard, F. Drosophila: a polyvalent model to decipher host-pathogen interactions. Trends Microbiol. 12, 235-242 (2004).
- Dalhammar, G., Steiner, H. Characterization of inhibitor A, a protease from Bacillus thuringiensis which degrades attacins and cecropins, two classes of antibacterial proteins in insects. Eur. J. Biochem. 139, 247-252 (1984).
- Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
- Purves, J., Cockayne, A., Moody, P. C., Morrissey, J. A. Comparison of the regulation, metabolic functions, and roles in virulence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase homologues gapA and gapB in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78, 5223-5232 (2010).
- Chadwick, J. S. Serological responses of insects. Fed. Proc. 26, 1675-1679 (1967).
- Chadwick, J. S., Caldwell, S. S., Chadwick, P. Adherence patterns and virulence for Galleria mellonella larvae of isolates of Serratia marcescens. J. Invertebr. Pathol. 55, 133-134 (1990).
- Gao, W., et al. Two novel point mutations in clinical Staphylococcus aureus reduce linezolid susceptibility and switch on the stringent response to promote persistent infection. PLoS Pathog. 6, e1000944 (2010).
- Peleg, A. Y., et al. Reduced susceptibility to vancomycin influences pathogenicity in Staphylococcus aureus infection. J. Infect. Dis. 199, 532-536 (2009).
- Salamitou, S., et al. The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects. Microbiology. 146, 2825-2832 (2000).
- Cadot, C., et al. InhA1, NprA and HlyII as candidates to differentiate pathogenic from non-pathogenic Bacillus cereus strains. J. Clin. Microbiol. 48, 1358-1365 (2010).
- Rejasse, A., et al. Temperature-dependent production of various PlcR-controlled virulence factors in Bacillus weihenstephanensis strain KBAB4. Appl. Environ. Microbiol. 78, 2553-2557 (2012).
- Jones, R. T., et al. Photorhabdus adhesion modification protein (Pam) binds extracellular polysaccharide and alters bacterial attachment. BMC Microbiol. 10, 141 (2010).
- Finney, D. J. Probit analysis. , Cambridge University Press. (1971).
- Fedhila, S., Nel, P., Lereclus, D. The InhA2 metalloprotease of Bacillus thuringiensis strain 407 is required for pathogenicity in insects infected via the oral route. J. Bacteriol. 184, 3296-3304 (2002).
- Guillemet, E., et al. The InhA metalloproteases of Bacillus cereus contribute concomitantly to virulence. J. Bacteriol. 192, 286-294 (2010).
- Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lereclus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Curr. Opin. Microbiol. 15, 1-12 (2012).
- Bottone, E. J. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 23, 382-398 (2010).
- Stenfors Arnesen, L., Fagerlund, A., Granum, P. From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Rev. 32, 579-606 (2008).
- Lecadet, M., Blondel, M. O., Ribier, J. Generalized transduction in Bacillus thuringiensis var. berliner 1715, using bacteriophage CP54. Ber. J. Gen. Microbiol. 121, 203-212 (1980).
- Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J., Lereclus, D. Construction of new insecticidal Bacillus thuringiensis recombinant strains by using the sporulation non-dependent expression system of cryIIIA and a site specific recombination vector. J. Biotechnol. 48, 81-96 (1996).
- Tran, S. L., Guillemet, E., Gohar, M., Lereclus, D., Ramarao, N. CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation and virulence. J. Bacteriol. 192, 2638-2642 (2010).
- Tran, S. L., et al. Hemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages. Cell Microbiol. 13, 92-108 (2011).
- Fedhila, S., et al. Comparative analysis of the virulence of invertebrate and mammalian pathogenic bacteria in the oral insect infection model Galleria mellonella. J. Invertebr. Pathol. 103, 24-29 (2010).
- Daou, N., et al. IlsA, a unique surface protein of Bacillus cereus required for iron acquisition from heme, hemoglobin and ferritin. PLoS Pathog. 5, e1000675 (2009).
- Mason, K. L., et al. From commensal to pathogen: translocation of Enterococcus faecalis from the midgut to the hemocoel of Manduca sexta. MBio. 2, e00065-00011 (2011).
- Goldsmith, M. R., Shimada, T., Abe, H. The genetics and genomics of the silkworm, Bombyx mori. Annu. Rev. Entomol. 50, 71-100 (2005).
- Fraser, M. J. Insect transgenesis: current applications and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 57, 267-289 (2012).
