Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Насекомые doi: 10.3791/4392 Published: December 11, 2012

Summary

Устные и внутри haemocolic заражения личинок восковой моли больше

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Разведение насекомых

Весь цикл от яйца до личинки последнего возраста длится около 5 недель при температуре 25 ° C. Один или 2 дополнительных недель, необходимых для получения взрослых бабочек.

  1. Разместите по меньшей мере 100 куколок или вновь объединились для взрослых G. mellonella бабочек в 5-литровых сетчатые клетки. Мужской бабочек измерения от 10 до 15 мм. Взрослый самец моли является бежевый с легким светлые и темные отметины. Женский мера бабочек около 20 мм. Самки темнее, чем у мужчин с коричневый / серый цвет.
  2. Приостановить две пачки из четырех слоев бумаги в клетку для откладки яиц. Через 2 дня, взрослая самка откладывает яйца на грани между бумагами.
  3. Два раза в неделю, поместите яйцо бумаги пакеты в новой пластиковой коробки воспитания с сетками для циркуляции воздуха, содержащие пыльцу и пчелиный воск. Яиц вылупляются примерно в 3 дня и мелкие личинки начинают развиваться, питаясь воском и пыльцой. Кроме того, личинки могут быть размещены на искусственной диете consistinг смеси из 500 г жидкого меда, 400 г глицерина, 100 г сушеных пивных дрожжей, 250 г пшеничной муки, 200 г сухого обезжиренного молока и 400 г поленты. Для обеспечения соответствующего соотношения продуктов на личинку, регулярно отделить личинок в новых коробках и пополнения пищи каждые два дня.
  4. Личинки выращиваются в течение шести стадий личинки стадиона. Каждый стадион характеризуется проскальзывания головной капсулы личинок. Когда личинки достигают последней стадии перед окукливания, они прекращают кормление и начать строить света шелковый кокон.
  5. В их защитные коконы, личинки будут отдыхать и превращаются в куколок. Воск черви остаются в стадии куколки в течение одной-двух недель выйти во взрослой моли. Взрослые моли не пить, ни есть. Спаривание происходит и жизненный цикл воска червей начинается снова.
  6. Для стандартизации патологии анализа, принимают личинок в течение последних личиночной стадии. На этом этапе они перестают питаться, двигаться к крышке коробки воспитания и начать производить шелк. Это сTage длится около 5 дней.

2. Насекомое выбор для инфекции

  1. Выбор последнего возраста личинок, которые в 2-3 см в длину и 180-250 мг в весе, до 24 часов инфекций и положить их в пустую коробку голодать им.
  2. Удалить зарождающейся шелковый кокон вокруг личинок.

3. Бактериального препарата

  1. Подготовка Bacillus бактериальной суспензии для получения конечной концентрации в диапазоне от 10 4 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл до 10 8 КОЕ / мл для инъекций внутри haemocoelic и от 3x10 6 КОЕ / мл до 1х10 8 КОЕ / мл для приема внутрь (КОЕ получить LD 50 в зависимости от вида бактерий). В нашем случае, B. сегеиз выращивают в Лурия-Бертани бульон (LB, 10 г / л триптон, 5 г / л дрожжевого экстракта, 10 г / л NaCl) при 37 ° С при перемешивании до вступления в стационарную фазу, соответствующий изгиб роста кривую. Измерьте наружный диаметр 600 нм (между 1 и 2 B. Cereus) и использовать его для оценки концентрации бактерий, используя ранее сделанные кривой титрования. Урожай бактерий путем центрифугирования при 5000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре и ресуспендируют в фосфатным буферным раствором (PBS: 1M KH 2 PO 4, 1M К 2 НРО 4, 5 М NaCl, рН 7,2). Каждая личинка будет получать 10 мкл бактериальной суспензии в нужной концентрации.
  2. Кроме того, суспензии спор может быть подготовлен к инфекции. Получить спор путем культивирования бактерий в среде споруляции HCT (5 г / л триптон, 2 г / л гидролизата казеина, 12,5 мМ К 2 НРО 4, 12,5 мМ MgSO 4, 0,05 мМ MnSO 4, 1,2 ммоль ZnSO 4, 1,2 ммоль Fe 2 (SO 4) 3, 0,5% H 2 SO 4, 25 мМ CaCl 2) 20 при 30 ° С в течение 3 дней. Урожай спор путем центрифугирования (10.000 XG, 15 мин), и мыть два раза в стерильной дистиллированной воде. Ресуспендируют спор PELПусть в стерильной дистиллированной воды и тепла в течение 15 мин при 78 ° C, чтобы удалить остатки вегетативных бактерий. Нумеровать подвески при посеве серийных разведений на пластинах LB агар. Каждая личинка будет получать 10 мкл суспензии спор в нужной концентрации.

4. Cry токсинного подготовка

  1. Подготовка Cry1C токсинов из B. Thuringiensis штамм 407 трансформировали плазмидой pHTF31C 21 несущего ген, кодирующий Cry1C. Культура напряжение в 100 средних HCT мл при 30 ° C в течение 72 ч с антибиотиками (эритромицин 10мг/мл) для обеспечения полного спорообразования, токсинов кристалла и освобождение в супернатант культуры.
  2. Очисти кристаллы из супернатанта на 72% -79% градиенте сахарозы. Сначала добавьте 17 мл 79% сахарозы в 40 мл трубки. Осторожно слоя 17 мл 72% сахарозы в верхней части 79% сахарозы. Наконец, слой 5-6 мл концентрированного 10X спорулированных культуры и закрыть трубу. Центрифуга трубку в течение 14 часов при 20,000 мкг, 4 ° C, чтобы отделить кристаллы из спор. Сбор кристаллов на градиент интерфейс. Ресуспендируют кристалла гранул в 25 мл холодной стерильной воды, чтобы вымыть его. Центрифуга при 8000 х г в течение 20 мин. Этот шаг повторяется три раза, чтобы удалить все сахарозы придерживаться кристаллов. Ресуспендируют кристаллов в 5 мл стерильной воды и наблюдать под микроскопом, чтобы оценить чистоту.
  3. Оценка концентрации токсина белка классический Bradford пятна на кристалле решение presolubilized в 50 мМ NaOH. Токсин кристаллы могут храниться при температуре от -20 ° C до использования.

5. Инжектор подготовка

  1. Для контроля точный объем инъекции, использование автоматизированных шприцевой насос (например, KD Научно KDS 100) с настройкой скорости в 1 мкл / сек (рис. 1А).
  2. Заполнить 1 мл шприца для подкожных инъекций 300 мл воды или бактериального раствора (1 шприц в состоянии) для заражения 20-25 личинок. Удалить пузырьки тщательно таpping шприца, затем приложите 0,45 х 12 мм иглой шприца.
  3. Поместите шприц в инжектор.
  4. Выполнять пустой инъекции 10 мкл в пустой трубе для контроля вводили объеме.

6. Насекомое Intrahaemocoelic инъекций

  1. Поместите насекомых вручную, между большим и указательным пальцами. Затем вставьте иглу зафиксирован в инжектор в личинку кожи (кутикулы) (рис. 1С).
  2. Держите насекомого на месте во время инъекции 10 мкл бактериальной решение (спор или вегетативных бактерий).
  3. Осторожно удалите насекомое от иглы.
  4. Поместите инфицированных насекомых в небольшой чашке Петри (5 см в диаметре), 5 личинок на блюдо.
  5. Infect по меньшей мере 20 личинок на каждом экспериментальном состоянии.
  6. Поместите блюд при 37 ° C в инкубаторе в течение 48 часов.

7. Насекомое кормления Force (проглатывании)

  1. В 2-х трубной мл Eppendorf, смешать 0,2 мкг / м иU; л Cry1C токсин либо спор или вегетативных клеточной суспензии для получения конечной концентрации в диапазоне от 3х10 4 до 1х10 7 за 10 мкл.
  2. Заполнить 1 мл шприц с 30G, 25 мм, иглы для подкожных инъекций по 300 мкл бактериального токсина-Cry1C решение для заражения 20-25 личинок. Удалить пузырьки из шприца.
  3. Поместите насекомых вручную, так что ее рот входит игла фиксируется в инжектор (рис. 1D), и насильно кормить его с 10 мкл бактериальной решения с использованием автоматизированной шприцевой насос.
  4. Infect по меньшей мере 20 личинок на каждом экспериментальном состоянии.
  5. Поместите инфицированных насекомых в небольшом 5 см чашки Петри (5 личинок на блюдо). Поместите блюд при 37 ° C в инкубаторе в течение 48 часов.

8. Смертность Запись насекомых

  1. После насильственного кормления или инъекции экспериментов, держать личинок в чашку Петри без пищи при температуре 25 ° C или 37 ° C. Проверьте личиночной движенияrtality регулярно в течение 48 часов периода. Мертвые личинки являются инертными и обычно становятся черными (рис. 1б).
  2. Смертность данные могут быть проанализированы с помощью лог-пробит программы 14. Эта программа проверяет линейность кривых доза смертности и дает летальные дозы (LD 50). Кроме того, другие программы, такие как Prism (Graph Pad), анализ выживаемости и смертности, данные могут быть использованы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Внутри haemocoelic введения бактерий в G. mellonella была доказана очень полезны для идентификации многих факторов вирулентности дело с повреждением тканей и устойчивость к врожденной иммунной факторов несколько человеческих патогенов. Например, фигура 2А представляет насекомых смертности после введения различных доз B. сегеиз бактерий (дикого типа и мутантных штаммов) 22. рис. 2В представляет выживаемости бактерий после заражения G. mellonella от синегнойной палочки 4.

Использование Galleria как устное модели инфекции B. сегеиз и B. Thuringiensis опирается на оценки синергетического эффекта вегетативные бактерии или споры на инсектицидной активности токсина Cry1C 10. Личинки чувствительны к проглатывания спор / токсин смеси, но слабо восприимчивы к приема Cry1C токсина в одиночку. Личиночной результаты смерть от сепсиса после того, как бактерии достигли гемоцеля после распада кишечных барьеров. Рисунок 3 представляет личиночной смертность после приема кристаллов и либо дикого типа или мутантного штамма Bacillus бактерий 10.

Мало бактерии были протестированы на устные инфекции в Galleria. Среди патогенных для человека испытания, B. сегеиз штаммов с Cry1C токсина были наиболее опасных для G. mellonella после перорального инфекции 24. Этот метод может быть использован для мониторинга инфекции / колонизации желудочно-кишечного тракта. Действительно, как показано на рисунке 4, тракт личинки пищеварительной могут быть извлечены после заражения клетки-хозяина и изменения, а также бактериальной колонизации могут быть визуализированы на гистологических срезов парафином. Кроме того, употребление флуоресцентных бактерии могут быть использованы для отслеживания траектории и колонизации пропроцессом по различным отсекам личинок. Наконец, конкретные экспрессии гена в различных насекомых отсеки можно контролировать с помощью флуоресцентной микроскопии 25.

Рисунок 1
Рисунок 1. (А) Автоматизированный шприцевой насос форсунки. (B) Dead (верх, черный) и живой (низ, белый) G. mellonella личинок. (C) Бактерии вводят в гемоцеля Г. mellonella личинок. (D) G. mellonella личинки насильно кормят с бактериальным препаратом: игла входит в уста личинки насекомых.

Рисунок 2
Рисунок 2. Результаты после внутри haemocoelic инъекций. (A) CwpFM вирулентность против G. mellonella личинок 22. Различные концентрации B. сегеиз ВильD-типа (Bt 407) и ΔcwpFM мутантных штаммов высевали в гемоцель из 20 G. mellonella личинок. Смертность была зафиксирована после 24 ч при 37 ° C. (B) Время хода синегнойной инфекцией в PA14 G. mellonella 4. Двадцать пять бактерий на личинке вводили в нулевой момент времени. Личинки были разгромлены в указанные моменты времени после инфекции и бактерий определяли путем посева. Каждая точка представляет собой среднее значение и стандартное отклонение бактерий из 10 групп из 10 личинок. Личинки умер примерно 48 часов после инъекции, когда концентрация бактериальных достигло 10 9 / г.

Рисунок 3
Рисунок 3. Синергизм споры и кристаллы Cry1C токсина в качестве оценки патогенности G. mellonella личинки после перорального приема 10. G. mellonella личинкае были устными инфицированы либо Cry1C кристаллов токсина (1 мкг на личинку), или с 10 6 B. Thuringiensis спор, или со смесью Cry1C токсинов и B. Thuringiensis споры. Личинки смертности оценивался после 48 часов при 25 ° C.

Рисунок 4
Рисунок 4 Устные инфекции личинок. Колонизации и тканей локализации бактерий. (A) 10 мкл синий раствор красителя было введено принудительное кормление в рот G. mellonella личинки. Личинка была рассечена, чтобы показать кишечник заполнены с синим красителем. (B) Смесь Bt 407 процедить и Cry1C токсин был введен в G. mellonella личинок насильственного кормления. После 24 часа в сутки, все личинки были парафин, вырезать и исправлены. Гистологическое продольные срезы (гематоксилин и эозин и грамотрицательных напрягаясь). Световой микроскопии фотографии (400X) показывает кишечника (темно-фиолетовый) и окрашивали по Грамму Bacillus (темно-фиолетовый), локализованных на поверхность кишечника. (C) смеси Bt 407-Gfp флуоресцентные деформации и Cry1C токсин был введен в G. mellonella личинок насильственного кормления. После 24 часов, бактерии достигли гемоцеля и насекомых трупа наполнена B. сегеиз экспрессией зеленого флюоресцентного белка. (D) Анализ выражения Ильза в естественных условиях 25. Микроскопические наблюдения эпифлуоресцентной были проведены на B. сегеиз проведения pHT315-pilsA'gfp. Бактерии были выделены из hemocoel мертвых личинок через 24 часа после устного инфекции. Зеленые бактерии указывают выражения GFP в связи с активизацией промоутер Ильза. Это показывает конкретные экспрессии этого гена (ILSA), когда бактерии достигли гемоцеля.

Фильм 1. Распространение решение в кишечнике насекомого после приема глотатьион. 10 мкл синий раствор красителя было введено принудительное кормление в рот личинки европейского кукурузного мотылька Ostrinia nubilalis. Краситель быстро заполняет просвет кишечника из личинок насекомых. Щелкните здесь для просмотра фильмов .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Использование насекомых и особенно в личиночной стадии, так как инфекция моделей для нескольких патогенов, становятся частыми. Модель выбора для некоторых аспектов Drosophila (Fly Model), используемая как взрослых, так и личиночные 1,2 сцене. Чешуекрылых насекомых G. mellonella также была в основном используется для опробования бактериальной вирулентности путем инъекций. Преимущество терпимо высокой температуре (выше 37 ° C), чем дрозофилы (максимум 25 ° С) играет важную роль при млекопитающих возбудителей должны быть изучены. Кроме того, размер Galleria более удобной для изучения инфекции кинетики и повреждение тканей. Наконец, наш протокол описывает возможность использовать Galleria для пероральной инфекции, что является преимуществом для исследований, связанных с пищеварительным трактом. Кроме того, личиночной стадии другая большая гусеница, Manduca Sexta, используется для изучения инфекции путем инъекции в гемоцель а в последнее время для ротовой полости 26.В. Мори и Spodoptera видов, геномы последовательность 27 также предлагают интересные альтернативы, и хозяин гены могут быть закрыты методов РНК-интерференции или другие манипуляции генов 28. Здесь мы описываем в простой способ, как выращивать личинок Galleria, как заразить их и некоторые примеры о том, как следить за процессом инфекции и оценка смертности для того, чтобы показать потенциал таких моделей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Элизабет Guillemet, Кристоф Buisson и Людовик Bridoux за отличную техническую помощь. Мы в большом долгу перед Сильви Salamitou и Синда Fedhila для начальной настройки системы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wax and pollen La Ruche Roanaise 303000 Any honey producer
Automated syringe pump KD Scientific KDS 100
Syringe 1 ml Terumo BS 01T
Needle 0.45 x 12 mm Terumo NN 2613R
Petri dish 5 cm VWR 89000-300
Needle 30G, 25 mm hypodermic Burkard Mfg. Co. Ltd. PDE0005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
  2. Vodovar, N., Acosta, C., Lemaitre, B., Boccard, F. Drosophila: a polyvalent model to decipher host-pathogen interactions. Trends Microbiol. 12, 235-242 (2004).
  3. Dalhammar, G., Steiner, H. Characterization of inhibitor A, a protease from Bacillus thuringiensis which degrades attacins and cecropins, two classes of antibacterial proteins in insects. Eur. J. Biochem. 139, 247-252 (1984).
  4. Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
  5. Purves, J., Cockayne, A., Moody, P. C., Morrissey, J. A. Comparison of the regulation, metabolic functions, and roles in virulence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase homologues gapA and gapB in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78, 5223-5232 (2010).
  6. Chadwick, J. S. Serological responses of insects. Fed. Proc. 26, 1675-1679 (1967).
  7. Chadwick, J. S., Caldwell, S. S., Chadwick, P. Adherence patterns and virulence for Galleria mellonella larvae of isolates of Serratia marcescens. J. Invertebr. Pathol. 55, 133-134 (1990).
  8. Gao, W., et al. Two novel point mutations in clinical Staphylococcus aureus reduce linezolid susceptibility and switch on the stringent response to promote persistent infection. PLoS Pathog. 6, e1000944 (2010).
  9. Peleg, A. Y., et al. Reduced susceptibility to vancomycin influences pathogenicity in Staphylococcus aureus infection. J. Infect. Dis. 199, 532-536 (2009).
  10. Salamitou, S., et al. The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects. Microbiology. 146, 2825-2832 (2000).
  11. Cadot, C., et al. InhA1, NprA and HlyII as candidates to differentiate pathogenic from non-pathogenic Bacillus cereus strains. J. Clin. Microbiol. 48, 1358-1365 (2010).
  12. Rejasse, A., et al. Temperature-dependent production of various PlcR-controlled virulence factors in Bacillus weihenstephanensis strain KBAB4. Appl. Environ. Microbiol. 78, 2553-2557 (2012).
  13. Jones, R. T., et al. Photorhabdus adhesion modification protein (Pam) binds extracellular polysaccharide and alters bacterial attachment. BMC Microbiol. 10, 141 (2010).
  14. Finney, D. J. Probit analysis. Cambridge University Press. (1971).
  15. Fedhila, S., Nel, P., Lereclus, D. The InhA2 metalloprotease of Bacillus thuringiensis strain 407 is required for pathogenicity in insects infected via the oral route. J. Bacteriol. 184, 3296-3304 (2002).
  16. Guillemet, E., et al. The InhA metalloproteases of Bacillus cereus contribute concomitantly to virulence. J. Bacteriol. 192, 286-294 (2010).
  17. Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lereclus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Curr. Opin. Microbiol. 15, 1-12 (2012).
  18. Bottone, E. J. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 23, 382-398 (2010).
  19. Stenfors Arnesen, L., Fagerlund, A., Granum, P. From soil to gut: Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Rev. 32, 579-606 (2008).
  20. Lecadet, M., Blondel, M. O., Ribier, J. Generalized transduction in Bacillus thuringiensis var. berliner 1715, using bacteriophage CP54. Ber. J. Gen. Microbiol. 121, 203-212 (1980).
  21. Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J., Lereclus, D. Construction of new insecticidal Bacillus thuringiensis recombinant strains by using the sporulation non-dependent expression system of cryIIIA and a site specific recombination vector. J. Biotechnol. 48, 81-96 (1996).
  22. Tran, S. L., Guillemet, E., Gohar, M., Lereclus, D., Ramarao, N. CwpFM (EntFM) is a Bacillus cereus potential cell wall peptidase implicated in adhesion, biofilm formation and virulence. J. Bacteriol. 192, 2638-2642 (2010).
  23. Tran, S. L., et al. Hemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages. Cell Microbiol. 13, 92-108 (2011).
  24. Fedhila, S., et al. Comparative analysis of the virulence of invertebrate and mammalian pathogenic bacteria in the oral insect infection model Galleria mellonella. J. Invertebr. Pathol. 103, 24-29 (2010).
  25. Daou, N., et al. IlsA, a unique surface protein of Bacillus cereus required for iron acquisition from heme, hemoglobin and ferritin. PLoS Pathog. 5, e1000675 (2009).
  26. Mason, K. L., et al. From commensal to pathogen: translocation of Enterococcus faecalis from the midgut to the hemocoel of Manduca sexta. MBio. 2, e00065-00011 (2011).
  27. Goldsmith, M. R., Shimada, T., Abe, H. The genetics and genomics of the silkworm, Bombyx mori. Annu. Rev. Entomol. 50, 71-100 (2005).
  28. Fraser, M. J. Insect transgenesis: current applications and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 57, 267-289 (2012).
Насекомые<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Как мощная модель инфекции по расследованию бактериального патогенеза
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).More

Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. (70), e4392, doi:10.3791/4392 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter