Summary
Dit protocol geeft een volledige en gedetailleerde procedure voor RNA-seq, een krachtige volgende generatie DNA sequencing technologie, toepassing profiel transcriptomen in menselijke long microvasculaire endotheliale cellen met of zonder behandeling trombine. Dit protocol is generaliseerbaar verschillende cellen of weefsels die door verschillende reagentia of ziekten.
Abstract
De karakterisering van genexpressie in cellen via meting van de mRNA niveaus is een nuttig hulpmiddel bij het bepalen hoe de transcriptionele machinerie van de cel wordt beïnvloed door externe signalen (bijv. behandeling met geneesmiddelen), of hoe cellen verschillen tussen een gezonde toestand en een zieke toestand. Met de komst en continue verfijning van de volgende generatie DNA-sequencing technologie, heeft RNA-sequencing (RNA-seq) uitgegroeid tot een steeds populaire methode van transcriptoom analyse van alle soorten van transcripten in de catalogus van de transcriptionele structuur van alle uitgedrukte genen te bepalen en te kwantificeren de veranderende expressie van het geheel van transcripten in een bepaalde cel, weefsel of organisme 1,2. RNA-seq vervangt geleidelijk DNA microarrays een voorkeurswerkwijze voor transcriptoom omdat het de voordelen van profileren is volledig transcriptoom, die een digitaal type datum (kopienummer van elke transcript) en niet vertrouwen op bekende genomische sequence 3.
Hier presenteren we een volledig en gedetailleerd protocol om RNA-seq van toepassing op het profiel transcriptomen in de menselijke long microvasculaire endotheelcellen met of zonder trombine behandeling. Dit protocol is gebaseerd op recent gepubliceerde studie getiteld "RNA-seq onthult Novel Transcriptome van genen en hun isovormen in menselijke pulmonaire microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine" 4 waarbij we succesvol uitgevoerde eerste volledige transcriptoomanalyse van menselijke long microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine met RNA-seq. Het leverde ongekende bronnen voor verdere experimenten om inzicht te krijgen in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan trombine gemedieerde endotheel dysfunctie in de pathogenese van inflammatoire aandoeningen, kanker, diabetes en hart-en vaatziekten, en biedt potentiële nieuwe aanknopingspunten voor therapeutische doelen voor deze ziekten.
De beschrijvende tekst van dit protocolis verdeeld in vier delen. Het eerste deel beschrijft de behandeling van menselijke long microvasculaire endotheelcellen met trombine en RNA isolatie, kwaliteit en kwantificering. Het tweede deel beschrijft bibliotheek bouw en sequencing. Het derde deel beschrijft de data-analyse. Het vierde deel beschrijft een RT-PCR-validatie test. Representatieve resultaten van een aantal belangrijke stappen worden weergegeven. Nuttige tips of voorzorgsmaatregelen voor succes in belangrijke stappen te stimuleren worden in de discussie sectie. Hoewel dit protocol gebruikt de menselijke long microvasculaire endotheelcellen behandeld met trombine kan worden gegeneraliseerd naar profiel transcriptomen in zowel zoogdieren en niet-zoogdiercellen en in weefsels behandeld met verschillende stimuli of inhibitoren of transcriptomen vergelijken in cellen of weefsels van een gezonde toestand en een ziektetoestand.
Protocol
Een stroomdiagram waarin dit protocol wordt weergegeven in figuur 1.
1. Behandeling van cellen met trombine, RNA-isolatie, kwaliteitsbeoordeling en Kwantificering van RNA
- Cultuur humane long microvasculaire endotheelcellen (HMVEC-LBL) tot 90-100% confluentie in 6-well platen in EGM-2 medium met 5% FBS, groeifactoren en antibiotica (Lonza, cat # CC-3202).
- Veranderingsmedia de honger media (0% FBS) 30 min vóór de behandeling met trombine.
- Behandel de cellen met 0,05 U / ml trombine of laat onbehandeld als controle gedurende 6 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Isoleer totaal RNA uit de behandelde en controle cellen met de Ambion mir Vana kit volgens instructies van de fabrikant.
- De kwaliteit van het RNA met een Experion StdSense eukaryote RNA chip volgens het standaard protocol van de Experion Automated Electrophoresis Station (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
- Kwantificeren van het RNA met behulp van een standaard spectrofotometrische methode.
2. Bibliotheek Bouw en Sequencing
- Gebruik 1 ug totaal RNA kwaliteit per sample als uitgangsmateriaal.
- Om de bibliotheek te bouwen, volg dan de standaard procedure van Illumina (protocol # 15008136 Rev A). In dit protocol twee ronden van poly (A) mRNA bevattende selecties uitgevoerd om rRNA verwijderen om de rRNA sequentie minimaliseren.
- Beoordeel de kwaliteit van de bibliotheken met behulp van een Experion DNA 1K-chip volgens het standaardprotocol van de Experion Automated Electrophoresis Station ( www.bio-rad.com ).
- Kwantificeren de bibliotheek door qPCR: Een bibliotheek die eerder de sequentie als een standaardcurve en primers specifiek voor de geligeerde adapters. Gebruik verschillende verdunningen van het onbekende bibliotheken (bijvoorbeeld 1:100, 1:500 en 1:1000). Voer de qPCR According de SyberGreen MM-protocol en bereken de oorspronkelijke stam concentratie van elke bibliotheek.
- Verdun de bibliotheek voorraden 10 nM en bij -20 ° C tot gebruik cluster een stroomcel.
- Als u klaar bent om cluster een flow cel, ontdooi de CBOT reagens plaat in een waterbad. CBOT is een Illumina instrument dat wordt gebruikt om het cluster generatie proces te stroomlijnen.
- Was de CBOT instrument.
- Denaturatie van de libraries: Combineer 13 ul 1 x TE en 6 pi 10 pM bibliotheek en aan de zijkant van de buis, voeg 1 ui 1 N NaOH (door Illumina). Vortex, gaat draaien, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en plaats het gedenatureerde bibliotheken op ijs.
- Verdun de libraries: Verdun het gedenatureerde bibliotheken met voorgekoeld hybridisatiebuffer (HT1, door Illumina) door het combineren van 996 pl HT1 en 4 pi gedenatureerd bibliotheek voor een eindconcentratie van 12 pM. Plaats de gedenatureerde en verwaterde bibliotheken op ijs.
- Omkeren elke rij buisjes met CBOT plaat,zodat alle reagentia zijn ontdooid. Spin down van de plaat, verwijderen / doorboren de folie afdichtingen en laden op de CBOT.
- Aliquot 120 pl van de verdunde, gedenatureerd bibliotheken een strip buis gelabeld 1-8. Voeg 1,2 ul verdunde, gedenatureerd PhiX control library (van Illumina) in elke buis als een piek-in controle. Vortex en draaien langs de buizen en laadt ze op de CBOT in de juiste oriëntatie (buis # 1 naar rechts).
- Plaats een flow cel en spruitstuk op de CBOT.
- Vul de stroom te controleren en beginnen met de clustering run.
- Na de run is voltooid, controleert u reagens levering op alle rijstroken. Noteer eventuele afwijkingen. Hetzij onmiddellijk starten sequencing run of bewaar het in de doorstroomcel ontvangen buis bij 4 ° C.
- Ontdooi de sequentiebepaling-door-synthese (SBS, Illumina) reagentia.
- Laad de reagentia op de juiste plekken op het reagens trays, zorg ervoor dat u de andere reagentia te raken na het aanraken van de splitsing mix.
- Met een non-sequencing flow cel (dwz een die eerder werd de sequentie), prime het reagens lijnen twee keer.
- Reinig de sequencing doorstroomcel met 70% EtOH en Kimwipes, gevolgd door 70% EtOH en de lens papier. Controleer de flow cel voor eventuele strepen. Re-reinig deze indien nodig.
- Plaats de doorstroomcel op de sequencer en voert een stroom te controleren of de afdichting tussen de verdeelleidingen en stromingscel vastzit.
- Start de sequencing run.
- Beoordeel de kwaliteit metrics (bijvoorbeeld de cluster dichtheid, clusters passeren filter, Q30, intensiteit) zodra ze beschikbaar zijn tijdens de run.
- Monitor intensiteit gedurende de run.
- Na 101 cycli zijn voltooid, voert u turnaround chemie te voltooien de tweede lezen: Ontdooi de gepaarde einde reagentia en de tweede read Oprichting Buffer (ICB, een onderdeel van de SBS-reagentia, Illumina) en laad de reagentia.
- Ga door met de sequencing run, het beoordelen van 2 e gelezen intensiteit, Q30 eennd andere kwaliteit metrics zoals de run vordert.
3. Data-analyse
- Gebruik de nieuwste versie van Casava (Illumina, op dit moment 1.8.2) aan de basis oproep bestanden (. Bcl) bestanden te converteren naar. Fastq bestanden, het instellen van fastq-cluster-count op 0 tot de oprichting van een enkel fastq bestand zorgen voor elk monster . Pak het fastq bestanden voor downstream-analyse.
- Voer gepaarde einde uitlijning met behulp van de nieuwste versies van TopHat (1.4.1) 5, die prima RNA-seq leest van zoogdieren-en kleinbedrijf genomen met behulp van de ultra high-throughput korte read aligner (Bowtie, 0.12.7) 6 en SAMtools (0,1. 17) 7. SAMtools voert verschillende hulpprogramma's voor post-processing optimalisaties in de SAM-formaat. De verwijzing menselijk transcriptoom kan worden gedownload vanaf iGenomes ( www.illumina.com ). Bij het runnen van TopHat, gebruikten we alle standaard parameterinstellingen inclusief de bibliotheek soort optie fr-unstranded (standaard).
- Onsde Programma CuffDiff deel van de Manchetknopen (1.3.0) 8 softwarepakket, vergelijk trombine behandelde cellen de controles cellen screenen van de differentieel tot expressie gentranscripten in de eerste gebaseerd op het menselijk transcriptoom referentie. Deze vergelijking detecteert de differentiële expressie van bekende transcripten. Gebruik Microsoft Excel om het resultaat in tabelvorm te visualiseren. Bij het runnen van Manchetknopen programma, gebruikten we alle standaard parameterinstellingen. Deze gentranscripten met FPKM <0,05 en p> 0.05 worden uitgefilterd.
- Om nieuwe isovormen te detecteren, voert Manchetknopen zonder een verwijzing transcriptoom. Vergelijk het monster transcript bestanden naar de referentie-genoom met behulp van Cuffcompare en test de differentiële expressie met Cuffdiff met behulp van de gecombineerde trombine transcript bestanden als referentie genoom voor een analyse en de gecombineerde controle transcript bestanden als referentie genoom voor een tweede analyse. Gebruik Microsoft Excel om het resultaat in tabelvorm te visualiseren. Nogmaals, Those gentranscripten met FPKM <0,05 en p> 0.05 worden uitgefilterd. Na deze stap kan onderzoekers ervoor kiezen om een lijst met onlangs gemeld transcripten te uploaden naar de UCSC Genome Browser website ( http://genome.ucsc.edu/ ) om hun geldigheid te controleren door een handmatige inspectie.
- Indienen lijsten van differentieel tot expressie komende genen om Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com ) voor de karakterisering van de genen en pathways beïnvloed door de trombine behandeling. In deze stap kunnen onderzoekers kiezen buikband (gebruik http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), een R pakket dat is ontworpen om te helpen en te vereenvoudigen de analyse van RNA-seq Manchetknopen uitgang voor het beheren, visualiseren en integreren van alle gegevens die door een Cuffdiff analyse.
4. Validatie van de RNA-seq Resultaten op Kwantitatieve Real-time-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)
- Voer totaal RNA geïsoleerd van controle en trombine behandelde HMVEC-LBL cellen, RNA kwaliteitsbeoordeling en RNA kwantificering beschreven in stap 1.4 tot 1.6.
- Genereren complementair DNA van 1 ug totaal RNA van elk monster met SuperScript First-Strand III Synthesis System RT Kits volgens de instructies van de fabrikant (Invitrogen, 18,080-051).
- Voer qRT-PCR analyse op een Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR-systeem met behulp van Taqman assay-on-Demand ontworpen oligonucleotiden voor de detectie van CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -geassocieerde factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) en β-actine (ACTB, Hs99999903_m1). Elk monster had een template overeenkomt met 5 ng van totaal RNA. Meet kwantificatie met behulp van de werkwijze en DDCT normaliseren β-actine. Elke assay werd uitgevoerd in ten minste drie biologische repliceert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor Stap 1: de 28S: 18s verhouding wordt traditioneel gebruikt als indicator van RNA degradatie. Idealiter 28S piek moet ongeveer tweemaal het gebied van het 18S band (een verhouding van 2) hebben, maar dit is vaak niet ideale verhouding gezien in de praktijk. Bovendien 28s: 18s kan verkregen waarde van spectrofotometrische methoden onderschatten de hoeveelheid degradatie van het RNA. Nauwkeuriger kwantificeren de afbraak en dus de kwaliteit van het RNA monster Experion het systeem berekent een RNA kwaliteitsindicator (RQI) nummer. De RQI algoritme vergelijkt het elektroferogram van RNA monsters gegevens van een serie gestandaardiseerde, gedegradeerde RNA monsters en automatisch geeft een getal tussen 10 (intact RNA) en 1 (afgebroken RNA). De RNA kwaliteit moet een RQI van ten minste 7, bij voorkeur groter dan 8. Figuur 2 toont de Experion resultaten met een hoge kwaliteit RNA monster met een RQI van 8,4.
VoorStap 2: De bibliotheken moeten een brede band ten ongeveer 250-300 bp figuur 3 Experion resultaten van een hoogwaardige bibliotheek Figuur 4 toont de resultaten van qPCR standaardcurve monsters en een onbekende monster (in donkerblauw)... De voortgang en de kwaliteit van de sequencing run moet voortdurend worden geobserveerd gedurende de run Figuur 5 toont juiste cluster dichtheid tijdens de eerste cyclus beeldvorming stap;. Dit is de eerste indicatie van de run kwaliteit. Clusters moeten helder en geconcentreerd. Figuur 6 toont het eerste Basisrapportage gegenereerd nadat de eerste cyclus is voltooid. Het is belangrijk om de geschatte cluster dichtheid intensiteitsniveaus, en focus kwaliteit te beoordelen op dit punt. De volgende kwaliteit checkpoint na cyclus 4, is getoond in figuur 7. Dit toont de absolute cluster dichtheid voor elke baan. De dichtheid cluster mag niet boven 850 k / mm 2. Na cyclus 13,fasering (wanneer een base niet wordt toegevoegd tijdens een cyclus) en prephasing (wanneer twee basen worden toegevoegd tijdens een cyclus) statistieken worden berekend, zoals getoond in figuur 8. Typische getallen tussen 0,1 en 0,25. De belangrijkste kwaliteitsbeoordeling is mogelijk na cyclus 24, wanneer verschillende kwaliteit metrics worden berekend. Het percentage leest hierboven Q30, getoond in figuur 9, is een maat voor het vertrouwen in de basis bellen. Een lees met Q score van 30 betekent dat er een 1 op 1000 kans base call verkeerd. De Q scores zullen afnemen naarmate de run vordert, maar moet beginnen met meer dan 95% van de leest aan of hoger dan Q30. De clusters passeren filter (PF), getoond in figuur 10, zijn de clusters waarvan de feitelijke sequentie data worden genomen. Idealiter zou dit dan 85%. Het cluster PF is gebaseerd op vele factoren, waaronder fasering, prephasing, intensiteit en Q30. Het zal niet veranderen als de run vordert. Het percentage uitgelijnd ( Voor Stap 3: Tabel 1 geeft uitgedrukte genen en isovormen bij de controlegroep en trombine behandelde menselijke long microvasculaire endotheelcellen. Met name zijn er ongeveer 26.000 gedetecteerd nieuwe isovormen, die de kracht van illustreert RNA-seq-it kan identificeren onbekende RNA's, alternatief gesplitste transcripten en alternatieve promotor gebruik die niet detecteerbaar door middel van microarray technieken 3. RNA-seq kan ook de minder overvloedig transcripten die onnauwkeurig worden gekwantificeerd of niet door microarrays. Figuur 12 en Tabel 2 display differentially uitgedrukte genen in de thrombine signaleringsroute. Dit is een voorbeeld van de derde generatie kennis gebaseerde padenanalyse 9: pathway topologie benadering, met Ingenuity Pathway Analysis software. Blijkt dat een zes h trombine behandeling aanzienlijk up-regelt de trombinereceptor Par 4 en down-reguleert de trombinereceptor Par 3 terwijl er geen verandering in de expressie van de trombinereceptor Par 1. Expressie van NFkB1, NF KB2 en Src zijn ook significant up-gereguleerd. Sommige van Rho familie genen (Rho B, C, F en G) up-gereguleerd zijn, terwijl andere (Rho J, Q, T1, U en V) zijn down-gereguleerd (Tabel 4). Myosine lichte keten gen 9 (MYL9) is up-gereguleerd, terwijl MYL12B is down-gereguleerd. Expressie van andere genen down-gereguleerde of niet beïnvloed. Voor Stap 4: de RNA-seq resultaten een alternatieve benadering te valideren, we een qRT-PCR experiment assay drie diffehuur genen (Figuur 13). In RNA-seq data, TRAF1 was up-gereguleerd door 7,96 maal; CELF1 was down-gereguleerd door 1,16 maal, en FANCD2 werd down-gereguleerd door 1,70 maal. In qRT-PCR data, deze bijbehorende nummers zijn +7.25 vouwen, vouwen en -1,15 -2,07 respectievelijk een factor. De resultaten van deze drie genen geanalyseerd door RNA-seq en qRT-PCR in goede overeenkomst die de RNA-seq resultaten bevestigt. Tabel 1. Gene / Isoform Expression Samenvatting *. Deze tabel bevat genen, bekend isovormen en nieuwe isovormen uitgedrukt in controle en trombine-behandelde HMVEC-LBL cellen. De veelvoudverandering is de verhouding van trombine FragmentsPerKilobase van transcript perMillion fragmenten toegewezen (FPKM) aan FPKM controleren. Deze genen bekend isovormen en nieuwe isovormen met 2-voudig of groter verschil tussen beide groepen statistisch verschillend expressie (zoals bepaald na Benjamini-Hochberg correctie). * Deze tabel wordt weergegeven in tabel 2 in referentie 4. Tabel 2. Differentieel tot expressie Genen en isovormen in trombine signaalweg *. *, Deze tabel is overgenomen uit tabel S4 in referentie 4 met een kleine wijziging. **, Q-waarde, een valse ontdekking tarief aangepast p-waarde. 93/4393fig1.jpg "alt =" Figuur 1 "/> Genen Controle Trombine Totaal Genes Expressed 16.636 16.357 Controle Alleen 783 Trombine Alleen 504 Upgereguleerd (2-voudig of meer verschil) 152 Downgereguleerd (2-voudige of greater verschil) 2190 Bekende Isovormen Controle Trombine Totaal bekend Isovormen Uitgedrukt 26.807 26.300 Controle Alleen 1492 Trombine Alleen 985 Upgereguleerd (2-voudig of meer verschil) 480 Downgereguleerd (2-voudig of meer verschil) 3574 Novel Isovormen Controle Trombine Totaal Novel Isovormen Uitgedrukt 25.880 25.886 Controle Alleen 418 Trombine Alleen 424 Upgereguleerd (2-voudig of meer verschil) 1775 Downgereguleerd (2-voudig of meer verschil) 12.202 Down-gereguleerde genen Gene Symbol Algemeen voudige verandering Leden Individuele voudige verandering q_value ** FPKM Controle FPKM Trombine PLC -2,49 PLCB1 -2,97 0 6,75585 2,27611 PLCB2 -1,32 0.00183634 1,80892 1,36957 PLCB4 -10,04 6.28386E-14 0.682668 0,0679837 PLCL1 -2,53 5.26728E-09 0.602879 0.238017 GAQ -1,87 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 Gai -1,56 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 PKC -2,15 PRKCE -1,65 0 9,36364 5,67305 PRKCI -2,14 0 6,63566 3,09818 PRKD3 -2,61 0 16,0215 6,12878 IP3R -2,60 ITPR1 -1,39 0,000018734 1,51592 1,09009 ITPR2 -3,19 0 7,23283 2,26944 CREB -2,36 CREB1 -2,36 0 5,19117 2,2004 GATA -2,33 GATA3 -2,33 0.0228108 0.716773 0.307131 TBP -1,35 TBP -1,35 2.66E-05 8,48689 6,30476 G-eiwit Alpha -1,64 GNA14 -1,49 0,000122496 2,78076 1,86573 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 Par3 -1,87 F2RL2 -1,87 1.02474E-06 1,51286 0.810286 SOS1 SOS1 -2,27 0 8,94353 3,94679 Ras -1,69 KRAS -2,03 0 11,2766 5,5659 NRI's -1,61 0 38,0874 23,6491 AKT -1,77 Akt3 -1,77 0 15,8228 8,94223 MLCP -2,38 PPP1CB -2,10 0 39.585 18,8199 PPP1R12A -3,56 0 15,2274 4,27516 PPP1R12B -2,66 5.28466E-13 1,92123 0.722188 FAK -1,31 PTK2 -1,31 4.3856E-10 39,7935 30,3044 p70 S6K RPS6KB1 -1,99 0 8,46312 ROCK -3,68 Rock1 -3,54 0 19,5921 5,53112 Rock2 -3,86 0 16,0054 4,14759 CaMK -1,17 CAMK1 1,30 0,000255587 7,90794 10.296 CAMK2D -1,74 2.22911E-12 11,4497 6,56804 CAMK4 -2,58 0,000619045 0,62714 0.243277 Up-gereguleerde genen Symbool Algemeen voudige verandering Leden Individuele voudige verandering q_value ** FPKM Controle FPKM Trombine PAR4 1,59 F2RL3 1,59 9.19043E-13 4,99867 7,9253 Src 1,47 Src 1,47 0 14,1085 20,675 NF-kB 1,65 NFKB1 1,66 0 19,5113 32,3457 NFKB2 2,02 0 28,7563 58,1293 RELA 1,45 0 55,3482 80,28 Gedeeltelijke Up-/Partial Down-gereguleerde genen Symbool Algemeen voudige verandering Leden Individuele voudige verandering q_value ** FPKM Controle FPKM Trombine G-eiwit gamma 1,22 GNG10 -1,34 2.17216E-08 27.192 20,2206 GNG11 1,31 5.66209E-05 770.922 1011,05 GNG12 -1,44 5.11591E-13 112.397 78,3023 GNG2 2,43 6.38453E-09 0.465705 1,13132 G-eiwit beta 1,27 GNB2 1,36 1.91268E-10 137.786 187,43 GNB3 -2,69 4.71259E-11 2,58703 0.962504 GNB4 -1,61 0 15,8275 9,85484 Rho GEF -1,16 ARHGEF12 -1,67 0 30,6424 18,3015 ARHGEF2 1,33 5.80478E-08 27,6288 36.758 ARHGEF3 -1,48 0 20,3279 13,7813 ARHGEF6 -2,08 0 2,67944 1,28635 ARHGEF9 -1,54 0.00469498 1,56367 1,0159 PI3K -1,80 Geldautomaat -6,84 0 4,98972 0.729483 PIK3C2A -5,09 0 17,7894 3,49234 PIK3C3 -1,49 4.66294E-15 12,6504 8,50852 PIK3CA -3,14 0 16,8398 5,36228 PIK3CB -1,36 8.4357E-09 9,68516 7,12129 PIK3CD 1,86 0 5,6579 10,5507 PIK3CG -1,76 2.32945E-10 1,86962 1,06419 PIK3R1 -1,79 0 5,48118 3,06256 PIK3R3 -1,59 1.50915E-05 5,24549 3,30763 PIK3R4 -1,40 7.18425E-12 8,34176 5,97942 Rho 1,19 RHOB 1,31 9.48429E-06 232.232 304.587 RHOC 1,38 458.267 630.235 RHOF 1,65 0 8,29676 13,7268 RHOG 1,40 1.02141E-14 58,6003 82,0172 RHOJ -1,57 0 127.446 80,9317 RHOQ -1,52 0 16,4802 10,8122 RHOT1 -1,96 3.00071E-12 8,48834 4,33755 RHOU -1,54 0.00184367 0.900141 0.586092 RHOV -3,32 0.0056467 1 0.413912 0.124591 RND3 -1,95 0 58,0564 29,7075 MLC -1,06 MYL12B -1,43 4.87832E-11 872.075 608.472 MYL9 1,48 0 202.636 299.559
Figuur 1. Stroomschema van het protocol voor RNA-seq profilering van de trombine-gemedieerde transcriptoom in menselijke long microvasculaire endotheelcellen. Eerste behandelen cellen en isoleren en te kwantificeren RNA. Bereid bibliotheken van de hoge-kwaliteit RNA en beoordelen hun concentratie (via qPCR) en kwaliteit (via een Bioanalyzer), dan cluster op een flow cel. Start de sequencing run en analyseren van de kwaliteit van de gehele run. De belangrijkste kwaliteit checkpoints zijn cycli 1, 4, 13 en 24. Met behulp van Casava, converteert u de bcl bestanden naar fastq bestanden en lijn die naar het genoom met TopHat. Detecteer bekende en onbekende isovormen met manchetknopen en bepalen differentiële expressie met CuffDiff. De uitvoer in Excel en filteren genen die een expressieniveau minder dan 0,05 FPKM of een p-waarde groter dan 0,05 hebben. Dien de resterende genen te Ingenuity Pathway Analysis voor meer informatie over het gen functies en trajecten eenffected door trombine behandeling. Meestal geselecteerde set van differentieel tot expressie komende genen worden gevalideerd door een alternatieve aanpak, zoals qRT-PCR. 
Figuur 2. Een representatief monster met een RNA van 8,4 RQI zoals deze door het Experion Automated Electrophoresis Station A) De individuele sporen van hoogwaardige RNA -.. De x-as toont de tijd en de y-as van fluorescentiesignaal B) Het virtuele beeld gel van een hoogwaardige RNA monster. De intensiteit van de 28S piek groter dan 18S piek en geen verontreiniging wordt gezien. Beide bands zijn scherp en gedefinieerd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Hoogwaardige verzameling bereid uit RNA zoals deze door het Experion Automated Electrophoresis Station een brede piek tussen 250 en 300 bp wordt gedetecteerd en geen hoog molecuulgewicht DNA (contaminerende DNA) wordt waargenomen A) De individuele spoor van een hoogwaardige library.. - de x-as toont de tijd en de y-as van fluorescentiesignaal B) Het virtuele beeld van een gel hoogwaardige bibliotheek. Een brede piek tussen 250 en 300 bp wordt gedetecteerd en er geen hoog moleculair gewicht DNA (verontreinigende DNA) wordt waargenomen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
<strong> Figuur 4. qPCR resultaten met SyberGreen en primers specifiek voor Illumina geligeerde adapters. Een eerder geclusterd library wordt gebruikt als standaard curve om de optimale concentratie voor clustering de vers bereide bibliotheek bepalen. De verdunning van het onbekende bibliotheek onder de standaard curve concentraties. De standaard curve monsters die door het pijlen en het onbekende monster donkerblauw en aangegeven met een pijl.
Figuur 5. . Passende cluster dichtheid tijdens de eerste cyclus beeldvorming stap De clusters zijn helder, scherp en helder A) Basis A;. B) Basis C, C) Base G, D) Basis T.
| Metriek | Lane 1 | | Laan 3 | Lane 4 | Baan 5 | Laan 6 | Laan 7 | Laan 8 | |
| Cluster Dichtheid (k / mm 2) | 420,94 | 412,95 | 410,81 | 408,54 | 416,71 | 416,56 | 410,02 | 411,84 |
| Een Intensiteit | 25870,5 | 23886 | 23.891,38 | 23.735,83 | 23.949,38 | 24.933,08 | 24.305,79 | 23.950,29 |
| C Intensiteit | 21.559,62 | 19.822,33 | 19.759,33 | 19472 | 19.954,21 | 20.611,75 | <td> 1989219.438,29 | |
| G Intensiteit | 13.619,46 | 11.756,67 | 11.486,44 | 10.498,38 | 12.186,62 | 12195,5 | 11.826,88 | 11010,5 |
| T Intensiteit | 19.402,67 | 17.663,79 | 17.854,42 | 17.353,75 | 17.545,54 | 18.060,67 | 18.457,92 | 17.397,12 |
| Een Focus Score | 68,2 | 67,46 | 67,67 | 67,75 | 67,41 | 67,43 | 67,63 | 67,05 |
| C Focus Score | 67,93 | 67,33 | 67,56 | 67,66 | 67,33 | 67,39 | 67,46 | 66,9 |
| G Focus Score | 65,4 | 64,14 | 63,98 | 63,92 | 63,29 | 63,41 | 63,47 | 63,74 |
| T Focus Score | 66,45 | 65,57 | 65,5 | 65,49 | 65,03 | 65,23 | 65,57 | 65,59 |
Figuur 6. De eerste Basisrapportage gegenereerd na de eerste cyclus is voltooid. Het cluster dichtheid (hoewel onderschat in dit stadium) geschikt. De intensiteiten zien er goed uit (10,000-26,000, met G met de laagste intensiteit). De focus scores zijn ook geschikt, valt rond 65 tot 70, hoewel hogere waarden zijn ook geschikt.
g7.jpg "alt =" Figuur 7 "/>
Figuur 7. Het cluster dichtheid berekend na cyclus 4 Het cluster dichtheid lager dan 850 k / mm 2 en zelfs over alle rijstroken A) tabelvorm,... B) Grafiek formulier Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 8. Fasering (geen toevoeging van een base in een cyclus) en Pre-fasering (het toevoegen van twee bases tijdens een cyclus). Beide waarden worden op 0,25 of lager, wat aangeeft goede fasering / pre-fasering niveaus. A) De stopzetting en pre-fasering numerieke waarden . B) De stopzetting waarden in een grafiek. C) De pre-fasering waarden in een grafiek. Clic K hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 9. De verschillende representaties van Q30 scores na cyclus 24. Een score van 30 of hoger duidt op een 1 op de 1.000 kans dat base oproep verkeerd is. Ongeveer 90% van de Q scores zijn hoger dan 30 A) tabelvorm (Q30 scores hier zijn van het geheel van de run, via cyclus 24);. B) Q30 scores per fiets. Elke staaf vertegenwoordigt de verdeling van de leest die op of boven Q30 voor die bepaalde cyclus. C) Q30 score distributies door cyclus 24. De verdeling van Q scores op een cumulatieve basis door middel van cyclus 24. Q score op de x-as en miljoenen gelezen op de y-as. Leest met een Q30 boven de 30 zijn weergegeven in groen.oad/4393/4393fig9large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 10. De verschillende representaties van clusters passeren filter. Clusters passeren filter is gebaseerd op verschillende parameters, waaronder Q30, intensiteit en fasering / pre-fasering. Minstens 85% van de clusters filter passeren in elke baan A) tabelvorm;. B) Grafiek vorm, blauwe dozen vertegenwoordigen het totale aantal clusters, groene vakjes staan voor de clusters passeren filters. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 11. . Het percentage van de clusters afgestemd op de PhiX genoom Ongeveer 0,5% van de clusters aan te passen aan de PhiX genoom, die geschikt is voor de hoeveelheid PhiX spiked in de monsters A) tabelvorm;.. B) Grafiek formulier Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 12. Genen differentieel tot expressie door het trombine behandeling van HMVEC-LBL in de trombine signaalweg. De trombine signaleringsroute werd gebouwd door Ingenuity. In het pad, rode kleur geeft up-gereguleerde genen (3 1.3 voudig) en groene down-gereguleerde genen (
Figuur 13. qRT-PCR validatie van drie differentieel tot expressie genen van trombine-behandelde HMVEC-LBL RNA-seq data. qRT-PCR werd uitgevoerd zoals beschreven in het protocol. veelvoudveranderingen bepaald door de relatieve waarden van de Ct TaqMan Gene Expression assay voor CUGBP, Elav-like familielid 1 (CELF1), Fanconi-anemie, complementatie groep D2 (FANCD2) en TNF receptor-geassocieerde factor 1 (TRAF1)werden vergeleken met gedetecteerd door RNA-seq. Repliceert (n = 4) van elk monster werden uitgevoerd en de Ct-waarden worden gemiddeld. Alle Ct-waarden werden genormaliseerd β-actine. De foutbalken vertegenwoordigen het bereik van de veelvoudverandering zoals bepaald door de gegevens Assist software. p <0,05 werd als statistisch significant relatief veelvoudveranderingen tussen trombine-treat en controlegroep door zowel de RNA-seq en qRT-PCR assays. Het mRNA niveau controlegroepen door elke assay werd arbitrair als een, die niet getoond. *, P <0,05; ** p <0,01. Dit cijfer is overgenomen uit figuur 6 in referentie 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belangrijke stappen
RNA Handling: RNasen zal zelfs degraderen de meest hoogwaardige RNA, dus zorg moet genomen tijdens de isolatie, de opslag en het gebruik van RNA 10 worden. Handschoenen worden altijd gedragen om verontreiniging te voorkomen door RNasen gevonden op de menselijke handen. Handschoenen moeten vaak worden gewijzigd, met name na het aanraken van de huid, deurknoppen en andere gangbare ondergronden. Een set van pipetten dienen uitsluitend gewijd aan het werk RNA en alle tips en buizen moeten RNase-vrij. RNA-isolatie-en downstream-toepassing moet worden uitgevoerd bij weinig verkeer gebieden die routinematig worden gereinigd met een product zoals RNase-Zap. Afbraak kan ook optreden bij herhaalde vries-dooi cycli. Deze kunnen worden geminimaliseerd door aliquoteren RNA voor downstream toepassingen onmiddellijk na isolatie. Als alternatief kunnen cDNA worden gemaakt voor downstream toepassing zoals qRT-PCR direct na isolatie. RNA worden opgeslagen bij -80 ° C en op ijs gehouden tijdens gebruik. Het is ook important grondig ontdooien en vortex RNA monsters vóór en tijdens gebruik.
Het uitgangspunt kwaliteit van het RNA is essentieel voor het succes van dit protocol. Gebruik van aangetaste of op andere wijze van lage kwaliteit RNA kan de bibliotheek voorbereiding te mislukken of leiden tot een lage opbrengst die onvoldoende voor het rangschikken. Zelfs indien genoeg bibliotheek kan worden gemaakt van afgebroken of kwalitatief RNA, zal niet nauwkeurig de transcripten in het monster, waardoor onnauwkeurige kwantificering van expressie. Bovendien kunnen alle unremoved genomisch DNA in het RNA isolatie veroorzaken een overschatting van de hoeveelheid RNA die in het protocol, maar als een bedrag (bijvoorbeeld 1-2 pg) in het midden van de voorgestelde reeks (0.1-4 pg) wordt gebruikt, zal de werkelijke hoeveelheid RNA voldoende voor het protocol. Bovendien kan elk genomisch DNA is waarschijnlijk niet opgepikt door oligo (dT) primer based bibliotheekconstructie in het standaard protocol Illumina en dus geen schade downstream isswaarden uitgedrukt met mRNA transcript niveaus. De kwantificering van het uitgangsmateriaal RNA met reguliere spectrofotometrische metingen moet voldoende en er is geen noodzaak om zeer nauwkeurige kwantitatieve methoden zoals RiboGreen gebruiken omdat de bibliotheken nauwkeurig worden gemeten na bereiding en qPCR genexpressie niveaus ten opzichte van het totale aantal genormaliseerd leest tijdens de data-analyse stappen.
Bibliotheek Kwantificering. Nauwkeurige kwantificering van de bibliotheken is van vitaal belang om de juiste generatie van clusters. Alleen DNA moleculen met succes geligeerd adapters vormen clusters. Spectrofotometrische metingen wordt geen onderscheid gemaakt tussen DNA en DNA met adapters zonder, wat resulteert in een overschatting van de concentratie van de bibliotheek en uiteindelijk resulteren in onder-clustering van de doorstroomcel. De hoeveelheid DNA zonder geligeerde adapters verschilt van betreffende bibliotheek, zelfs indien dezelfde RNA werd gebruikt als starting materiaal, zodat men kan niet nauwkeurig aannemen dat een standaard percentage van de spectrofotometrische lezen is DNA met geligeerde adapters. Uitvoeren qPCR met primers specifiek voor de adapters detecteert alleen de DNA-moleculen met adapters succes geligeerd aan beide uiteinden van het molecuul. Dit maakt een absolute kwantificering van de bibliotheken en op zijn beurt een nauwkeurige cluster dichtheid. Beoordeling van de bibliotheken met een Experion instrument of Bioanalyzer is ook belangrijk. Hierdoor kan een visualisatie van de orde van grootte van de bibliotheek, wat belangrijk is bij de data analysestappen en zorgt ervoor dat er geen verontreiniging worden veroorzaakt die cluster generatie.
Data-analyse. In dit protocol passen we TopHat af te stemmen RNA-seq leest de menselijke referentie transcriptoom en manchetknopen tot transcripties monteren, hun abundanties schatten, en test voor differentiële expressie in trombine behandelde HMVEC-LBL cellen. TopHat en Manchetknopen zijn two populaire tools, en ze zijn gratis, open-source software 11. Een recente studie toonde aan dat Manchetknopen een hoge sensitiviteit en specificiteit hadden bij het opsporen van eerder geannoteerde introns 12. Echter, TopHat en manchetknopen niet alle toepassingen van RNA-seq, noch zijn zij de enige tools voor RNA-seq analyse 11. TopHat en Manchetknopen vereisen een sequentie verwijzing transcriptoom of genoom. Zij bijzonder geschikt voor de analyse van RNA-seq data gegenereerd van ofwel Illumina of vaste sequentie machines maar niet 454 of de klassieke capillaire elektroforese sequentie platform. Gebruikers werken zonder een sequentie referentie genoom kunnen overwegen het uitvoeren van de novo transcriptoom montage met behulp van een van de verschillende instrumenten, zoals Trinity ( http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), Trans-Abyss ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) of Oases ( http://www.ebi.ac.uk/ ~ Zerbino / oases / ). Veel alternatieve transcriptoom analyse programma's die nu bestaan. Voor een overzicht van verschillende programma's, kunnen lezers willen de studie van Garber et al. gelezen. 13 en de toetsing door Martin en Wang 14, die de comparatieve voordelen en nadelen en de theoretische overwegingen van de meeste huidige en algemeen gebruikte programma's te beschrijven. De keuze van transcriptoomanalyse strategieën (referentie-gebaseerde strategie, de novo strategie en gecombineerde strategie) en programma's afhankelijk van veel factoren, zoals het bestaan of de volledigheid van een referentie genoom, de beschikbaarheid van sequentie en computerbronnen, het type dataset gegenereerd en, belangrijker nog, het overkoepelende doel van de sequencing project 14.
Een ander punt moet worden gemaakt: computer programma's voor de transcriptoom analyse kan niet toegeven een 100% correctheid van de transcriptie rapportage. Sequencing fout is een ander probleem. Het is altijd aan te raden dat elke differentieel tot expressie transcript geïdentificeerd door RNA-seq worden gevalideerd door real-time PCR. TaqMan probe-gebaseerde chemie wordt beschouwd als de gouden standaard voor real-time PCR. Ook moet nieuw geïdentificeerde transcripten worden gevalideerd door de Sanger methode van DNA sequentiebepaling voor verdere experimenten.
Problemen oplossen
Bereiding bibliotheek: een uitstrijkje van hoog molecuulgewicht genomisch DNA bibliotheek na bereiding stappen kunnen worden veroorzaakt door een overdracht van de uiteindelijke korrel zuivering in de bibliotheek voorbereiding. Het terugbrengen van de bibliotheken om de magnetische standaard voor een volle vijf minuten kan het probleem oplossen. Zo niet, dan kan het probleem het gevolg zijn van onvolledige versnippering van de RNA tijdens de eerste stappen van de bibliotheek voorbereiding. Dit kan zich voordoen als low-kwaliteit RNA wordt gebruikt of als het protocol is niet precies gevolgd. Zo veranderen de incubatie tijd of temperatuur, toevoeging reagentia in de juiste volgorde of pauzeren tussen fragmentatie en de synthese van de eerste streng van het cDNA. Indien retournering de bibliotheken de magnetische standaard niet verwijderd hoge MW DNA, is het raadzaam om de bibliotheek preparaat herhalen met vers RNA monsters.
Lage intensiteit: Als de eerste cyclus intensiteit lager dan verwacht, is het mogelijk dat de primers niet goed hybridiseren aan de clusters tijdens de laatste stap van het cluster opwekking of de doorstroomcel is of te lang tussen clustering en het begin van de sequencing uit te voeren. In dit geval dient een primer rehybridization worden uitgevoerd met een primer rehyb kit van Illumina. Meestal is dit rehyb lost de intensiteit kwesties en de aanloop kan worden gestart over zonder enig probleem. Als na een rehyb, de intensiteiten zijn nog steeds laag is, kan het probleem wordenmet de bibliotheken of de sequentie door synthese (SBS) reagentia en Illumina technische dienst moet gecontacteerd worden voor verdere probleemoplossing. Wanneer de eerste uitleesmiddelen de intensiteiten zijn goed, maar de intensiteiten laag na omdraaien kan een primer rehyb van het tweede leesveld primer nodig. Dit wordt uitgevoerd op de sequencing instrument en Illumina technische dienst moet contact worden opgenomen voor de procedure.
High fasering / prephasing: Als hoger dan normaal fasering of prephasing wordt waargenomen, een mogelijke oorzaak is de besmetting van de andere reagentia met splitsing SBS buffer. Tijdens de SBS bereidingsstappen, is het essentieel om de splitsing behandelen buffer laatste en handschoenen tussen de behandeling van de splitsing buffer en andere reagentia wijzigen. Als decollete buffer contaminatie wordt vermoed, moet een primer rehyb van de stroom cel worden uitgevoerd en nieuwe SBS reagentia moeten worden voorbereid. Als alternatief zou er verontreiniging in de lijnen van de inst rument. Als dit wordt vermoed, het instrument een onderhoudswasbeurt (een waterwassing, gevolgd door een NaOH gewassen, gevolgd door een laatste waterwassing) ondergaan, moet een primer rehyb worden uitgevoerd op de doorstroomcel en nieuwe SBS reagentia moeten worden opgesteld. Als de fasering / prephasing waarden zijn matig hoog (~ 0,5), kan de run worden voortgezet totdat de Q30 scores en clusters passeren filter worden berekend. Deze niveaus kan nog steeds in aanvaardbare grenzen, zelfs met een hoge fasering en / of prephasing.
Generaliseerbaarheid van dit protocol
Terwijl het specifiek voor de Illumina HiScanSQ Dit protocol is toepasbaar op elk van de HiSeq familie of de Genome Analyzer II van Illumina instrumenten ( www.illumina.com ) met kleine modificaties van de cluster generatie stappen en sequentiebepalingsreagentia. Andere next-generation DNA-sequencing-platforms, zoals de Solid-serie ("_blank"> Www.lifetechnologies.com), het GS systeem ( www.454.com worden) en sommige opkomende nieuwe systemen ook toegepast met het oog op RNA-seq 11. Hoewel hun bibliotheekconstructie en sequencing procedures Afwijkingen de RNA behandeling tips, de gegevensanalyse gedeelten (stroomafwaarts van de Casava stappen) en de validering door RT-PCR in dit protocol van referentiewaarde hun RNA-seq toepassingen .
Ook moet worden opgemerkt dat dit protocol specifiek is voor RNA-seq op een tijdstip van trombine behandelde HMVEC-Lbl cellen, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan een multi-tijdstip studie of studies in andere cellen, weefsels behandeld met verschillende stimuli of remmers, of vergelijkingen van transcriptomen in cellen of weefsels tussen een gezonde toestand en een ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr Stephen Kingsmore en de Pediatric Genome Medicine Center bedanken Children's Mercy ziekenhuizen en klinieken voor het gebruik van hun computer clusters voor onze data-analyse, Illumina's field service team (Elizabeth Boyer, Scott Cook en Mark Cook) en technische consultant team voor hun snelle reacties en nuttige suggesties over de werking van de volgende generatie DNA-sequencing instrument, HiScanSQ, en kwaliteit van de gegevens-analyse. Dit werk werd mede ondersteund door National Institutes of Health Grant HL080042 (tot SQY) en start-up fonds en begiftiging van Children's Mercy ziekenhuizen en klinieken, Universiteit van Missouri in Kansas City (tot SQY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine - Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. | |||
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
- Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
- Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
- Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).
