ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

Summary

Ce protocole présente une procédure complète et détaillée à appliquer ARN-seq, une puissante technologie de l'ADN de la prochaine génération de séquençage, de transcriptomes profil de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est généralisable à différentes cellules ou des tissus affectés par différents réactifs ou états pathologiques.

Abstract

La caractérisation de l'expression des gènes dans les cellules via la mesure des niveaux d'ARNm est un outil utile pour déterminer comment la machinerie transcriptionnelle de la cellule est affectée par des signaux externes (traitement médicamenteux, par exemple), ou comment les cellules diffèrent entre un état ​​sain et un état ​​pathologique. Avec l'avènement et le raffinement continu de la technologie de l'ADN de la prochaine génération de séquençage, séquençage de l'ARN (ARN-seq) est devenue une méthode de plus en plus populaire de l'analyse du transcriptome de cataloguer toutes les espèces de transcriptions, de déterminer la structure de la transcription de tous les gènes exprimés et à quantifier les niveaux d'expression de l'évolution de l'ensemble total de transcrits dans une cellule donnée ^1,2, tissu ou organisme. ARN-seq remplace progressivement les puces à ADN comme une méthode pratique pour l'analyse du transcriptome, car il a les avantages de profilage d'un transcriptome complet, offrant une donnée de type numérique (nombre de copies de la transcription) et ne comptez sur aucune séquentielle génomique connueCe ^3.

Ici, nous présentons un protocole complète et détaillée à appliquer ARN-seq pour transcriptomes profil de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est basé sur notre étude publiée récemment intitulé «RNA-seq révèle transcriptome Novel des gènes et de leurs isoformes de l'homme dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traités par la thrombine," ^4, dans lequel nous avons réussi a effectué la première analyse complète du transcriptome de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traité avec de la thrombine en utilisant l'ARN-seq. Elle a abouti à des ressources sans précédent pour de nouvelles expérimentations afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la thrombine dysfonction endothéliale dans la pathogénie des maladies inflammatoires, le cancer, le diabète et les maladies coronariennes, et fournit de nouvelles pistes potentielles pour cibles thérapeutiques pour ces maladies.

Le texte descriptif de ce protocoleest divisé en quatre parties. La première partie décrit le traitement de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec la thrombine et d'isolement d'ARN, analyse de la qualité et de quantification. La deuxième partie décrit la construction de bibliothèques et de séquençage. La troisième partie décrit l'analyse des données. La quatrième partie décrit un essai de validation par RT-PCR. Les résultats représentatifs de plusieurs étapes clés sont affichés. Conseils utiles ou les précautions à stimuler le succès dans les étapes clés sont fournis dans la section Discussion. Bien que ce protocole utilise de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traitées avec de la thrombine, elle peut être généralisée à transcriptomes de profil dans les deux cellules de mammifères et non mammifères et dans les tissus traités avec différents stimuli ou des inhibiteurs, ou pour comparer les transcriptomes dans des cellules ou des tissus entre un état de santé et un état de maladie.

Protocol

Un organigramme décrivant ce protocole est affiché à la figure 1.

1. Le traitement des cellules avec de la thrombine, RNA, évaluation de la qualité et la quantification de l'ARN

1. Culture cellules humaines endothéliales microvasculaires pulmonaires (HMVEC-LBL) à 90-100% de confluence dans des plaques 6 puits en milieu EGM-2 avec 5% de FBS, des facteurs de croissance et des antibiotiques (Lonza, chat # CC-3202).
2. Changer médias pour les médias famine (0% de FBS) 30 min avant le traitement avec de la thrombine.
3. Traiter les cellules avec 0,05 U / ml de thrombine ou de quitter traitée comme un contrôle pendant 6 heures à 37 ° C et 5% de CO _2.
4. Isoler l'ARN total des cellules traitées et témoins en utilisant le kit Ambion mir Vana selon les instructions du fabricant.
5. Évaluer la qualité de l'ARN avec une Experion eucaryote StdSense puce ARN selon le protocole standard sur la station Experion électrophorèse (Automated= "_blank"> Www.bio-rad.com).
6. Quantifier l'ARN en utilisant une méthode standard spectrophotométrique.

2. Construction Bibliothèque et de séquençage

1. Utilisez 1 ug d'ARN totaux de haute qualité par échantillon comme produit de départ.
2. Pour construire la bibliothèque, suivez la procédure standard d'Illumina (protocole # 15008136 Rev A). Dans ce protocole, deux séries de poly (A) ARNm contenant les sélections sont effectuées pour enlever ARNr de minimiser le séquençage ARNr.
3. Évaluer la qualité des bibliothèques à l'aide d'une puce ADN Experion 1K selon le protocole standard sur la station Experion électrophorèse automatique ( www.bio-rad.com ).
4. Quantifier la bibliothèque en utilisant qPCR: Utiliser une bibliothèque qui a déjà été séquencé par une courbe standard et des amorces spécifiques pour les adaptateurs ligaturés. Utiliser une gamme de dilutions des bibliothèques inconnus (c.-à 1:100, 1:500 et 1:1000). Exécutez l'acco qPCRrding au protocole Sybergreen MM et calculer la concentration de matière d'origine de chaque bibliothèque.
5. Diluer les stocks de bibliothèque à 10 nM et conserver à -20 ° C jusqu'au moment de pôle une cellule d'écoulement.
6. Lorsque vous êtes prêt à se regrouper une cellule d'écoulement, dégeler la plaque réactif CBOT dans un bain d'eau. CBOT est un instrument Illumina utilisée pour simplifier le processus de génération de cluster.
7. Laver l'instrument CBOT.
8. Dénaturer les bibliothèques: Mélanger 13 ul 1x TE et 6 ul de 10 uM bibliothèque et, sur le côté du tube, ajouter 1 ul de NaOH 1 N (fourni par Illumina). Vortex, centrifuger et incuber à température ambiante pendant 5 min et placer les bibliothèques dénaturées sur la glace.
9. Diluer les bibliothèques: Diluer les bibliothèques dénaturés avec un tampon d'hybridation pré-réfrigéré (HT1, fourni par Illumina) en combinant 996 ul HT1 et 4 pl dénaturé bibliothèque pour une concentration finale de 12 heures. Placez les bibliothèques dénaturées et dilué sur la glace.
10. Inverser chaque rangée de tubes de la plaque CBOT,faire en sorte que tous les réactifs sont décongelées. Centrifuger la plaque, enlever / percer les joints bandes et charger sur le CBOT.
11. Aliquote de 120 ul dilués et bibliothèques dénaturées à un tube de bande, étiqueté 1-8. Ajouter 1,2 ul diluée, bibliothèque dénaturé contrôle PhiX (à partir de Illumina) dans chaque tube comme un pic en contrôle. Vortex et centrifuger les tubes et les charger sur le CBOT dans le bon sens (tube n ° 1 à droite).
12. Chargez une cellule d'écoulement et le collecteur sur le CBOT.
13. Terminer le flux de vérifier et de commencer la course de clustering.
14. Après la course est terminée, vérifiez distribution de réactifs à travers toutes les voies. Prenez note de toutes les anomalies. Soit commencer l'exécution de séquençage immédiatement ou stocker la cellule d'écoulement dans le tube muni à 4 ° C.
15. Décongeler le séquençage par synthèse (SBS, Illumina) réactifs.
16. Chargez les réactifs aux endroits appropriés sur les plateaux de réactifs, en veillant à ne pas toucher les autres réactifs après avoir touché le mélange clivage.
17. L'utilisation d'un pascellule d'écoulement n-séquençage (celle qui a été séquencé précédemment), prime les lignes de réactifs à deux reprises.
18. Bien nettoyer la cellule d'écoulement séquençage avec EtOH à 70% et Kimwipes, suivie d'EtOH à 70% et du papier pour objectif. Inspectez la cellule d'écoulement pour d'éventuelles traces. Re-nettoyez-le si nécessaire.
19. Charger la cellule d'écoulement sur le séquenceur et effectuer un écoulement de vérifier que l'étanchéité entre le collecteur et la cuve à circulation est serré.
20. Lancer le cycle de séquençage.
21. Évaluer les mesures de qualité (par exemple, la densité du cluster, les grappes passent filtre, Q30, intensité) dès qu'ils sont disponibles pendant la course.
22. Contrôler l'intensité tout au long de la course.
23. Après 101 cycles sont terminés, effectuez la chimie de redressement pour terminer la deuxième lecture: Décongeler les réactifs finaux jumelés et le tampon seconde lecture Incorporation (ICB, une composante de l'réactifs SBS, Illumina) et charger les réactifs.
24. Continuer le long de séquençage, l'évaluation de 2 ^ème lecture d'intensité, un Q30nd mesures de qualité d'autres que l'on avance l'exécution.

3. Analyse des données

1. Utilisez la dernière version de CASAVA (Illumina, actuellement 1.8.2) pour convertir les fichiers d'appel de base (. Bcl) des fichiers à fichiers. Fastq, la mise en fastq-cluster-comptage à 0 pour assurer la création d'un fichier unique fastq pour chaque échantillon . Décompressez les fichiers fastq pour l'analyse en aval.
2. Effectuez un alignement fin jumelé avec les dernières versions de TopHat (1.4.1) ^5, qui aligne ARN-seq lit de mammifères de taille des génomes en utilisant l'ultra haut débit aligneur à court de lecture (Bowtie, 0.12.7) ⁶ et samtools (0,1. 17) ^7. Samtools met en œuvre divers utilitaires pour le post-traitement des alignements au format SAM. Le transcriptome humain de référence peuvent être téléchargés à partir iGenomes ( www.illumina.com ). En cours d'exécution TopHat, nous avons utilisé tous les paramètres par défaut, y compris l'option de type bibliothèque fr-unstranded (par défaut).
3. Noustion de la CuffDiff programme, une partie des boutons de manchette (1.3.0) ⁸ progiciel, comparez les cellules traitées par la thrombine dans les cellules contrôles pour éliminer les transcrits des gènes différentiellement exprimés dans l'ancienne base de référence sur le transcriptome humain. Cette comparaison détecte l'expression différentielle des transcrits connus. Utilisez Microsoft Excel pour visualiser le résultat sous forme de tableau. En exécutant le programme Boutons de manchette, nous avons utilisé tous les paramètres par défaut. Ces transcrits du gène avec FPKM <0,05 et p> 0,05 sont filtrés.
4. Pour détecter les nouvelles isoformes, exécutez Boutons de manchette sans transcriptome de référence. Comparer les fichiers de transcription échantillon de référence à l'aide du génome Cuffcompare et tester l'expression différentielle avec Cuffdiff combinées en utilisant les fichiers de transcription thrombine comme le génome de référence pour une analyse et les fichiers combinés de contrôle de transcription que le génome de référence pour une analyse secondes. Utilisez Microsoft Excel pour visualiser le résultat sous forme de tableau. Encore une fois, thostranscrits du gène électroniques avec FPKM <0,05 et p> 0,05 sont filtrés. Après cette étape, les enquêteurs peuvent choisir de télécharger une liste des transcriptions nouvellement signalés sur le site UCSC Genome Browser ( http://genome.ucsc.edu/ ) pour vérifier leur validité par une inspection manuelle.
5. Présenter des listes de gènes différentiellement exprimés à Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com ) pour la caractérisation des gènes et les voies affectées par le traitement thrombine. Dans cette étape, les enquêteurs peuvent choisir d'utiliser ceinture ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), un package R qui est conçu pour faciliter et simplifier la tâche d'analyser Boutons de manchette ARN-seq sortie, pour aider à gérer, visualiser et d'intégrer toutes les données produites par une analyse Cuffdiff.

4. Validation des résultats par RNA-Seq quantitative en temps réel-PoChain Reaction lymerase (qRT-PCR)

1. Effectuer totale isolement d'ARN à partir de la thrombine et de contrôle traités par HMVEC-LBL cellules, l'ARN et d'évaluation de la qualité de quantification d'ARN décrit dans les stades 1,4 à 1,6.
2. Générer ADN complémentaire de 1 ug d'ARN totaux de chaque échantillon avec SuperScript III du premier volet Kits de synthèse RT système, suivant les instructions du fabricant (Invitrogen, 18080-051).
3. Effectuer qRT-PCR sur une analyse Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time System PCR en utilisant Taqman-on-Demand oligonucléotides conçus pour la détection des CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) et β-actine (ACTB, Hs99999903_m1). Chaque échantillon a eu un modèle équivalent à 5 ng d'ARN total. Mesurer la quantification en utilisant la méthode DDCT et normaliser la β-actine. Chaque essai a été effectué sur au moins trois biologique répétitions.

Representative Results

Pour l'étape 1: L'28s: 18s rapport est traditionnellement utilisé comme un indicateur de la dégradation de l'ARN. Idéalement, le pic 28s devrait avoir environ deux fois la surface de la bande 18 (un ratio de 2), mais cette proportion idéale n'est pas souvent vu dans la pratique. En outre, 28s: 18s ratios obtenus à partir de méthodes spectrophotométriques peut sous-estimer l'importance de la dégradation de l'ARN. Pour plus de précision quantifier la dégradation, et donc la qualité de l'échantillon d'ARN, le système Experion calcule un indicateur de la qualité de l'ARN (RQI) nombre. L'algorithme compare le RQI électrophérogramme des échantillons d'ARN à des données provenant d'une série de standards, des échantillons d'ARN dégradés et renvoie automatiquement un nombre compris entre 10 (ARN intact) et 1 (dégradé ARN). La qualité de l'ARN devrait avoir un RQI d'au moins 7, de préférence supérieur à 8. Figure 2 montre les résultats Experion en utilisant un échantillon de haute qualité avec un ARN de 8,4 RQI.

PourÉtape 2: Les bibliothèques devraient avoir une large bande à environ 250-300 pb Figure 3 montre les résultats Experion d'une bibliothèque de haute qualité La figure 4 montre les résultats de qPCR d'échantillons courbe standard et d'un échantillon inconnu (en bleu foncé)... Le progrès et la qualité de l'exécution séquençage doivent être constamment observé tout au long de la course La figure 5 montre la densité de cluster approprié lors de l'étape d'imagerie de premier cycle;. C'est la première indication de la qualité de l'exécution. Les grappes doivent être brillants et ciblée. La figure 6 montre le rapport First Base généré après le premier cycle est terminé. Il est important d'évaluer la densité estimée de cluster, niveaux d'intensité, et la qualité de mise au point à ce point. Le point de contrôle de la qualité prochain, après le cycle 4, est illustré à la figure 7. Cela montre la densité absolue de cluster pour chaque couloir. La densité de cluster ne doit pas être supérieure à 850 k / mm ^2. Après le cycle 13,stat de mise en phase (lorsqu'une base n'est pas ajouté au cours d'un cycle) et prephasing (lorsque deux bases sont ajoutés au cours d'un cycle) sont calculées, comme illustré à la figure 8. Nombres typiques sont comprises entre 0,1 et 0,25. L'évaluation de la qualité majeure est possible après le cycle 24, lorsque plusieurs mesures de qualité sont calculés. Le pour cent de lit au-dessus de Q30, illustré à la figure 9, est une mesure de la confiance dans la vocation de base. Une lecture avec un score de 30 Q signifie qu'il ya 1 chance sur 1000 que l'appel de base est erroné. Les scores Q diminue à mesure que progresse la course, mais devrait commencer avec plus de 95% du lit atteindre ou dépasser Q30. Les grappes passent filtre (PF), illustré à la figure 10, sont les groupes à partir de laquelle les données de séquence réels seront prises. Idéalement, cela devrait être supérieur à 85%. Le PF cluster est fonction de nombreux facteurs, y compris l'élimination, prephasing, l'intensité et Q30. Il ne changera pas au fil de l'exécution. Le pour cent alignés (

Pour l'étape 3: Le tableau 1 présente les gènes exprimés et des isoformes à la fois le contrôle et la thrombine humaine traitée par des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires. Notamment, il ya environ 26.000 nouvelles isoformes détectés, ce qui illustre la force de l'ARN-seq-il peut identifier des ARN inconnus, des transcriptions d'épissage alternatif et l'utilisation promoteur alternatif qui ne sont pas détectables par ³ techniques de microarray. ARN-seq permet également de mesurer les transcriptions moins abondantes que sont incorrectement quantifiés ou non détecté par puces à ADN. Figure 12 et Tableau 2 differentiall affichagey gènes exprimés dans la voie de signalisation de thrombine. Ceci est un exemple de l'analyse de la production de connaissances troisième voie de base axée sur ^9: approches topologiques voie base, en utilisant le logiciel Ingenuity Pathway Analysis. Il montre que de six heures thrombine traitement de manière significative une régulation positive du récepteur de la thrombine Par 4 et régule à la baisse la Par récepteur de la thrombine 3, tandis que il n'ya pas de changement dans l'expression du Parle récepteur de la thrombine 1. Expression de NFKB1, NF KB2 et Src sont également significativement régulée à la hausse. Certains des gènes de la famille Rho (Rho B, C, F et G) sont régulés à la hausse tandis que d'autres (Rho J, Q, T1, U et V) sont régulé à la baisse (tableau 4). Gène de la myosine chaîne légère 9 (MYL9) est régulée à la hausse tandis que MYL12B est régulée à la baisse. Expression d'autres gènes est soit régulé à la baisse ou non affecté.

Pour Étape 4: Pour valider les résultats de l'ARN suivants en utilisant une approche alternative, nous avons réalisé une expérience qRT-PCR au test de trois diffégènes louer (figure 13). Dans l'ARN-seq données, TRAF1 était régulée à la hausse de 7,96 fois; CELF1 était régulée à la baisse de 1,16 fois et FANCD2 a été régulée à la baisse de 1,70 fois. En qRT-PCR données, ces chiffres correspondants sont de 7,25 fois, -1,15 -2,07 pli et pli, respectivement. Les résultats de ces trois gènes analysés par l'ARN-seq et qRT-PCR sont en bon accord, ce qui corrobore les résultats RNA-Seq.

Gènes
	Contrôler	La thrombine
Les gènes totale exprimée	16636	16357
Contrôler uniquement	783
Seule la thrombine		504
Mis à réglementée (différence de 2 fois ou plus)		152
Régulée à la baisse (2 fois ou gPLUS GRANDE différence)		2190
Isoformes connues
	Contrôler	La thrombine
Total des isoformes connues Exprimé	26807	26300
Contrôler uniquement	1492
Seule la thrombine		985
Mis à réglementée (différence de 2 fois ou plus)		480
Régulée à la baisse (différence de 2 fois ou plus)		3574
Nouvelles isoformes
	Contrôler	La thrombine
Nouvelles isoformes total exprimé	25880	25886
Contrôler uniquement	418
Seule la thrombine		424
Mis à réglementée (différence de 2 fois ou plus)		1775
Régulée à la baisse (différence de 2 fois ou plus)		12202

Tableau 1. Gene / isoforme * Résumé expression. Ce tableau répertorie les gènes, les isoformes connues et nouvelles isoformes exprimées dans le contrôle et la thrombine traités HMVEC-LBL cellules. Le facteur de variation est le rapport de la thrombine FragmentsPerKilobase de fragments de transcrits perMillion mappés (FPKM) pour contrôler FPKM. Ces gènes, des isoformes connues et nouvelles isoformes avec une différence de 2 fois ou plus entre deux groupes ont des niveaux d'expression statistiquement différentes (tel que déterminé après Benjamini-Hochberg correction). * Ce tableau est reproduit dans le tableau 2 dans la référence 4.

Bas gènes régulés
Symbole Gene	Dans l'ensemble les changements Fold	Membres	Changement individuel Fold	q_value **	FPKM contrôle	FPKM thrombine
PLC	-2,49
		PLCB1	-2,97	0	6,75585	2,27611
		PLCB2	-1,32	0.00183634	1,80892	1,36957
		PLCB4	-10.04	6.28386E-14	0.682668	0,0679837
		PLCL1	-2,53	5.26728E-09	0.602879	0.238017
Gaq	-1,87
		GNAQ	-1,87	0	24.0907	12.8996
Gai	-1,56
		GNAI1	-1,86	0	9,88417	5,31795
		GNAI3	-1,49	0	35.7592	24.0198
PKC			-2,15
		PRKCE	-1,65	0	9,36364	5,67305
		PRKCI	-2,14	0	6,63566	3,09818
		PRKD3	-2,61	0	16.0215	6,12878
IP3R	-2,60
		ITPR1	-1,39	0.000018734	1,51592	1,09009
		ITPR2	-3,19	0	7,23283	2,26944
CREB	-2,36
		CREB1	-2,36	0	5,19117	2,2004
GATA	-2,33
		GATA3	-2,33	0.0228108	0.716773	0.307131
TBP	-1,35
		TBP	-1,35	2.66E-05	8,48689	6,30476
G-protéine Alpha	-1,64
		GNA14	-1,49	0.000122496	2,78076	1,86573
		GNAI1	-1,86	0	9,88417	5,31795
		GNAI3	-1,49	0	35.7592	24.0198
		GNAQ	-1,87	0	24.0907	12.8996
PAR3	-1,87
		F2RL2	-1,87	1.02474E-06	1,51286	0.810286
SOS1
	SOS1	-2,27	0	8,94353	3,94679
Ras	-1,69
		KRAS	-2,03	0	11.2766	5,5659
		NRAS	-1,61	0	38.0874	23.6491
AKT	-1,77
		AKT3	-1,77	0	15.8228	8,94223
MLCP	-2,38
		PPP1CB	-2,10	0	39,585	18.8199
		PPP1R12A	-3,56	0	15.2274	4,27516
		PPP1R12B	-2,66	5.28466E-13	1,92123	0.722188
FAK	-1,31
		PTK2	-1,31	4.3856E-10	39.7935	30.3044
p70 S6K
		RPS6KB1	-1,99	0	8,46312
ROCK	-3,68
		ROCK1	-3,54	0	19.5921	5,53112
		ROCK2	-3,86	0	16.0054	4,14759
CAMK	-1,17
		CAMK1	1,30	0.000255587	7,90794	10,296
		CAMK2D	-1,74	2.22911E-12	11.4497	6,56804
		CAMK4	-2,58	0.000619045	0,62714	0.243277
Jusqu'à gènes régulés
Symbole	Dans l'ensemble les changements Fold	Membres	Changement individuel Fold	q_value **	FPKM contrôle	FPKM thrombine
PAR4	1,59
		F2RL3	1,59	9.19043E-13	4,99867	7,9253
Src	1,47
		Src	1,47	0	14.1085	20,675
NF-kB	1,65
		NFKB1	1,66	0	19.5113	32.3457
		NFKB2	2,02	0	28.7563	58.1293
		RELA	1,45	0	55.3482	80,28
Partielles Up-/Partial Bas gènes régulés
Symbole	Dans l'ensemble les changements Fold	Membres	Changement individuel Fold	q_value **	FPKM contrôle	FPKM thrombine
G-protéine Gammaman	1,22
		GNG10	-1,34	2.17216E-08	27,192	20.2206
		GNG11	1,31	5.66209E-05	770,922	1011.05
		GNG12	-1,44	5.11591E-13	112,397	78.3023
		GNG2	2,43	6.38453E-09	0.465705	1,13132
G-protéine bêta	1,27
		GNB2	1,36	1.91268E-10	137,786	187,43
	GNB3	-2,69	4.71259E-11	2,58703	0.962504
		GNB4	-1,61	0	15.8275	9,85484
Rho GEF	-1,16
		ARHGEF12	-1,67	0	30.6424	18.3015
		ARHGEF2	1,33	5.80478E-08	27.6288	36,758
		ARHGEF3	-1,48	0	20.3279	13.7813
		ARHGEF6	-2,08	0	2,67944	1,28635
		ARHGEF9	-1,54	0.00469498	1,56367	1,0159
PI3K	-1,80
		ATM	-6,84	0	4,98972	0.729483
		PIK3C2A	-5,09	0	17.7894	3,49234
		PIK3C3	-1,49	4.66294E-15	12.6504	8,50852
		PIK3CA	-3,14	0	16.8398	5,36228
		PIK3CB	-1,36	8.4357E-09	9,68516	7,12129
		PIK3CD	1,86	0	5,6579	10.5507
		PIK3CG	-1,76	2.32945E-10	1,86962	1,06419
		PIK3R1	-1,79	0	5,48118	3,06256
		PIK3R3	-1,59	1.50915E-05	5,24549	3,30763
		PIK3R4	-1,40	7.18425E-12	8,34176	5,97942
Rho	1,19
		RHOB	1,31	9.48429E-06	232,232	304,587
		RhoC	1,38	458,267	630,235
		RHOF	1,65	0	8,29676	13.7268
		RHOG	1,40	1.02141E-14	58.6003	82.0172
		RHOJ	-1,57	0	127,446	80.9317
		RHOQ	-1,52	0	16.4802	10.8122
		RHOT1	-1,96	3.00071E-12	8,48834	4,33755
		RHOU	-1,54	0.00184367	0.900141	0.586092
		RHOV	-3,32	0.0056467 1	0.413912	0.124591
		RND3	-1,95	0	58.0564	29.7075
MLC	-1,06
		MYL12B	-1,43	4.87832E-11	872,075	608,472
		MYL9	1,48	0	202,636	299,559

Tableau 2. Gènes différentiellement exprimés et des isoformes de thrombine voie de signalisation *. *, Ce tableau est reproduit à partir de S4 Tableau de référence 4 avec une modification mineure. **, Q-valeur, un taux de fausses découvertes ajustée Valeur p.

93/4393fig1.jpg "alt =" Figure 1 "/>
Figure 1. Organigramme du protocole pour l'ARN-seq profil du transcriptome thrombine dans pulmonaires humaines cellules endothéliales microvasculaires. Tout d'abord, traiter les cellules et d'isoler et de quantifier l'ARN. Préparer les bibliothèques de l'ARN de haute qualité et d'évaluer leur concentration (par qPCR) et la qualité (via un bioanalyseur), puis de cluster sur une cellule d'écoulement. Lancer le cycle de séquençage et l'analyse de la qualité tout au long de la course. Les points de contrôle de qualité sont les principaux cycles 1, 4, 13 et 24. Utilisation CASAVA, convertir les fichiers bcl aux fichiers fastq puis alignez ceux du génome avec TopHat. Détecter les isoformes connues et inconnues grâce Boutons de manchette et déterminer l'expression différentielle avec CuffDiff. Afficher les fichiers de sortie dans Excel et filtrer les gènes qui ont un taux d'expression inférieur à 0,05 FPKM ou une p-valeur supérieure à 0,05. Soumettre les gènes restants à Ingenuity Pathway Analysis pour plus d'informations sur les fonctions des gènes et voies d'unffected par le traitement de thrombine. Habituellement, l'ensemble sélectionné de gènes différentiellement exprimés sont validés par une approche alternative comme qRT-PCR.

Figure 2. Un échantillon représentatif ARN avec un RQI de 8,4 analysée par la station automatique d'électrophorèse Experion A) La trace individuelle de haute qualité de l'ARN -.. L'axe des abscisses représente le temps et l'axe des ordonnées représente le signal fluorescent B) L'image du gel virtuel d'un échantillon de haute qualité de l'ARN. L'intensité du pic est supérieure à 28S 18S pic et aucune contamination est vu. Les deux bandes sont nettes et bien définies. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. Bibliothèque de haute qualité préparé à partir d'ARN analysée par la station automatique d'électrophorèse Experion Un large pic entre 250 et 300 bp est détecté et aucune trace d'ADN de haut poids moléculaire (ADN contaminant) est observée A) La trace individuelle d'une bibliothèque de grande qualité.. - l'axe des abscisses représente le temps et l'axe des ordonnées représente signal fluorescent B) L'image de gel d'une bibliothèque virtuelle de grande qualité. Un large pic entre 250 et 300 bp est détecté et aucune trace d'ADN de haut poids moléculaire (ADN contaminant) est observée. Cliquez ici pour agrandir la figure .

<strong> Figure 4. qPCR résultats en utilisant des amorces spécifiques et Sybergreen à Illumina adaptateurs ligaturés. Une bibliothèque précédemment cluster est utilisée comme courbe standard pour déterminer la concentration optimale pour la classification bibliothèque nouvellement préparé. La dilution de la bibliothèque inconnu relève des concentrations de la courbe standard. Les échantillons de courbe standard sont mis en accusation par les flèches et l'échantillon inconnu est bleu foncé et aussi indiquée par une flèche.

Figure 5. . Densité de cluster approprié lors de l'étape d'imagerie premier cycle Les grappes sont clairs, précis et lumineux Un socle) A;. B) Base de C, C) Base G, D) Base T.

<td> 19892

Métrique	La ligne 1		Voie 3	La piste 4	La piste 5	6, rue	Piste 7	Lane 8
Densité de cluster (k / mm 2)	420,94	412,95	410,81	408,54	416,71	416,56	410,02	411,84
Une intensité	25870.5	23886	23891.38	23735.83	23949.38	24933.08	24305.79	23950.29
Intensité C	21559.62	19822.33	19759.33	19472	19954.21	20611.75	19438.29
Intensité G	13619.46	11756.67	11486.44	10498.38	12186.62	12195.5	11826.88	11010.5
Intensité T	19402.67	17663.79	17854.42	17353.75	17545.54	18060.67	18457.92	17397.12
Score de mise au point	68,2	67,46	67,67	67,75	67,41	67,43	67,63	67,05
Note Focus C	67,93	67,33	67,56	67,66	67,33	67,39	67,46	66,9
Note de mise au point G	65,4	64,14	63,98	63,92	63,29	63,41	63,47	63,74
Note de mise au point T	66,45	65,57	65,5	65,49	65,03	65,23	65,57	65,59

Figure 6. Le Rapport First Base généré après le premier cycle est terminé. La densité de cluster (bien que sous-estimé, à ce stade) est appropriée. Les intensités bien paraître (10,000-26,000, avec G ayant la plus faible intensité). Les scores de focalisation sont également appropriés, tombant autour de 65-70, bien que des valeurs plus élevées sont également appropriés.

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Figure 7. La densité calculée de cluster après le cycle 4 La densité de cluster est inférieure à 850 k / mm ² et même à travers toutes les voies forme A) sous forme de tableau;... Forme graphique B) Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 8. Phasage (ne pas ajouter une base au cours d'un cycle) et de pré-élimination (en ajoutant deux bases pendant un cycle). Ces deux valeurs sont à 0,25 ou au-dessous, en indiquant appropriées phasage / pré-élimination progressive des niveaux. A) Les valeurs de phasage et de pré-élimination numériques . B) Les valeurs de phasage sous forme de graphique. C) Le pré-élimination progressive des valeurs sous forme de graphique. Cliquez K ici pour agrandir la figure.

Figure 9. Les différentes représentations de Q30 scores après le cycle 24. Un score de 30 ou plus indique une probabilité de 1 sur 1000 que l'appel de base est erroné. Environ 90% des scores Q est supérieur à 30 forme A) sous forme de tableau (Q30 scores sont ici de l'intégralité de la course, à travers le cycle 24);. B) Q30 scores par cycle. Chaque barre représente la distribution des lectures tombant à Q30 ou au-dessus de ce cycle particulier. C) Q30 distributions des scores par cycle de 24. La distribution des scores Q sur une base cumulative à travers le cycle 24. Note Q est sur l'axe des x et des millions de lectures est sur l'axe des ordonnées. Lit avec un Q30-dessus de 30 sont représentés en vert.oad/4393/4393fig9large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 10. Les différentes représentations des groupes qui passent Clusters filtre. Passant filtre est fonction de plusieurs paramètres, y compris Q30, l'intensité et l'élimination / de pré-élimination. Au moins 85% des glomérules sont de passage du filtre dans chaque ligne un formulaire) sous forme de tableau;. B) sous forme graphique, les boîtes bleues représentent le nombre total de grappes, boîtes vertes représentent les groupes qui passent filtres. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 11. . Le pour cent des pôles alignés sur le génome PhiX Environ 0,5% des glomérules aligner sur le génome PhiX, appropriée pour le montant de PhiX enrichi dans les échantillons de forme A) sous forme de tableau;.. Forme graphique B) Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 12. Gènes différentiellement exprimés par le traitement de la thrombine HMVEC-LBL dans la voie de signalisation de thrombine. La voie de signalisation de thrombine a été construit par l'ingéniosité. Dans la voie, la couleur rouge indique une régulation des gènes ⁽³ 1,3 fois) et le vert en bas gènes régulés ( tableau 2. Ce chiffre est reproduit sur ​​la figure 4 dans la référence 4. Cliquez ici pour agrandir la figure

Figure 13. qRT-PCR validation de trois gènes différentiellement exprimés de la thrombine traités HMVEC-LBL RNA-Seq données. qRT-PCR a été réalisée comme décrit dans le protocole. amplitude des variations déterminées à partir des valeurs de Ct relatives de l'essai TaqMan Gene Expression pour CUGBP, Elav-comme membre de la famille 1 (CELF1), l'anémie de Fanconi, D2 groupe de complémentation (FANCD2) et de TNF facteur associé au récepteur 1 (TRAF1)ont été comparées à celles détectées par l'ARN-seq. Répétitions (n ​​= 4) de chaque échantillon ont été effectués et les valeurs de Ct moyenne. Toutes les valeurs de Ct ont été normalisées à β-actine. Les barres d'erreur représentent la plage de variation de fois tel que déterminé par les données Assist. p <0,05 était considérée comme statistiquement significative par rapport modifications de pliage entre la thrombine traitement et un groupe contrôle à la fois par l'ARN-seq et les essais qRT-PCR. Le niveau de l'ARNm dans les groupes témoins par chaque essai a été fixée arbitrairement comme un seul, qui ne sont pas représentés. * P <0,05; ** p <0,01. Ce chiffre est tiré de la figure 6 dans la référence 4.

Discussion

Les étapes clés

Manipulation d'ARN: RNases se dégrade, même les plus de haute qualité d'ARN, donc il faut faire attention lors de l'isolement, le stockage et l'utilisation de l'ARN ^10. Les gants sont toujours portés afin de prévenir la contamination par des RNases trouvés sur les mains de l'homme. Les gants doivent être changés souvent, surtout après la peau toucher, les poignées de porte ou d'autres surfaces communes. Un ensemble de pipettes doivent être exclusivement dédiée à l'ARN de travail et tous les trucs et les tubes doivent être exempte de RNase. Isolement de l'ARN et en aval application doit être réalisée dans les zones moins fréquentées qui sont régulièrement décontaminés avec un produit tel que la RNase-Zap. La dégradation peut également se produire avec répétés de congélation-décongélation. Ceux-ci peuvent être minimisés en aliquotant ARN pour des applications en aval immédiatement après l'isolement. Alternativement, l'ADNc peut être faite pour une application en aval tels que qRT-PCR directement après l'isolement. ARN doivent être conservés à -80 ° C et conservé sur de la glace pendant l'utilisation. Il est également important de bien dégeler et homogénéiser au vortex échantillons d'ARN avant et pendant l'utilisation.

La qualité à partir de l'ARN est essentielle à la réussite de ce protocole. Utilisation des dégradés ou de faible qualité ARN peut causer la préparation bibliothèque d'échouer ou aboutir à faible rendement qui sera insuffisant pour le séquençage. Même si la bibliothèque assez peut être faite à partir d'ARN dégradés ou de faible qualité, il ne sera pas représenter avec exactitude les transcriptions présents dans l'échantillon, ce qui entraîne la quantification inexacte de l'expression. En outre, tout l'ADN génomique non enlevée pendant l'isolement d'ARN peut provoquer une surestimation de la quantité d'ARN utilisées dans le protocole, mais si un montant (par exemple 1-2 pg) dans le milieu de la fourchette proposée (0.1-4 mg) est utilisé, le montant réel de l'ARN sera suffisant pour le protocole. En outre, tout l'ADN génomique n'est pas susceptible d'être ramassé par oligo (dt) construction de la bibliothèque apprêt à base d'Illumina dans le protocole standard et donc cela ne causera pas iss avalues avec les niveaux de transcription d'ARNm exprimés. La quantification de l'ARN de départ en utilisant régulièrement des lectures spectrophotométriques devrait être suffisant et il n'est pas nécessaire d'utiliser des méthodes quantitatives très précises telles que RiboGreen puisque les bibliothèques sera quantifiée avec précision après préparation par qPCR et les niveaux d'expression des gènes sont normalisés par rapport au nombre total de lit pendant les étapes de l'analyse de données.

Quantification de la bibliothèque. Quantification précise des bibliothèques est essentiel à la génération approprié de grappes. Seules les molécules d'ADN avec des adaptateurs ligaturés avec succès sera former des amas. Lectures spectrophotométriques sera pas la différence entre l'ADN et l'ADN avec des adaptateurs sans, ce qui se traduira par une surestimation de la concentration de la bibliothèque et finalement entraîner une sous-classification de la cellule d'écoulement. La quantité d'ADN sans adaptateurs ligaturés varient d'une bibliothèque à, même si les ARN mêmes a été utilisé comme commencermatériau ment, on peut donc supposer que pas exactement un pourcentage standard de la lecture spectrophotométrique est de l'ADN avec des adaptateurs ligaturés. Effectuer qPCR avec des amorces spécifiques aux adaptateurs permet de détecter seulement les molécules d'ADN avec les adaptateurs ligaturés avec succès aux deux extrémités de la molécule. Cela permet une quantification absolue des bibliothèques et à son tour une densité de cluster précis. Évaluation des bibliothèques avec un instrument ou un Experion bioanalyseur est également importante. Cela permet une visualisation de la gamme de taille de la bibliothèque, ce qui est important au cours des étapes de l'analyse de données, et assure qu'il n'ya pas de contamination qui peuvent interférer avec la production cluster.

Analyse des données. Dans ce protocole, nous avons appliqué TopHat d'aligner l'ARN-seq lit à transcriptome humain de référence et de boutons de manchette pour assembler les transcriptions, d'estimer leur abondance et de test pour l'expression différentielle de la thrombine traités HMVEC-LBL cellules. TopHat et boutons de manchette sont two outils populaires, et ils sont libres, logiciels libres ^11. Une étude récente a montré que Manchette avait une sensibilité et une spécificité élevées pour la détection des introns précédemment annotés ^12. Cependant, TopHat et boutons de manchette ne traitent pas toutes les applications de l'ARN-seq ils ne sont pas les seuls outils pour l'ARN-seq analyse ^11. Boutons de manchette TopHat et nécessitent un transcriptome de référence séquencés ou du génome. Ils sont particulièrement adaptés pour l'analyse de l'ARN-seq données produites à partir de Illumina ou solide machines de séquençage, mais pas 454 ou l'électrophorèse capillaire classique plateforme de séquençage. Les utilisateurs qui travaillent sans un génome séquencé de référence peut envisager d'effectuer de novo du transcriptome assemblage en utilisant un des nombreux outils tels que Trinity ( http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), Trans-Abyss ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) ou Oasis ( http://www.ebi.ac.uk/ ~ Zerbino / oasis / ). De nombreux autres programmes d'analyse du transcriptome existent maintenant. Pour un aperçu des différents programmes, les lecteurs pourront lire l'étude de Garber et al. ¹³ et l'examen par Martin et Wang ^14, qui décrivent les avantages et désavantages comparatifs et les considérations théoriques de la plupart des programmes en cours et couramment utilisés. Le choix des stratégies d'analyse du transcriptome (référence stratégie fondée sur la stratégie de novo, et une stratégie combinée) et des programmes dépend de nombreux facteurs, y compris l'existence ou l'intégralité d'un génome de référence, la disponibilité du séquençage et de ressources de calcul, le type de jeu de données généré et, plus important encore, l'objectif global du projet de séquençage ^14.

Un autre point doit être effectué: computer programmes pour l'analyse du transcriptome peut ne pas donner une précision de 100% de tous les rapports transcription. Le séquençage d'erreur est une autre préoccupation. Il est toujours recommandé que toute transcription différentiellement exprimés identifiés par l'ARN-seq être validés par PCR en temps réel. Chimie TaqMan basée sur sonde est considérée comme le gold standard pour PCR en temps réel. En outre, les transcriptions nouvellement identifiées devraient être validés par la méthode de Sanger de séquençage de l'ADN avant une expérimentation plus loin.

Dépannage

Préparation Bibliothèque: Un test de ADN de haut poids moléculaire génomique après les étapes de préparation de la bibliothèque pourrait être causé par un report de l'étape de purification finale talon lors de la préparation de la bibliothèque. Retour des bibliothèques sur le stand magnétique pour cinq bonnes minutes peut résoudre le problème. Sinon, le problème peut provenir de la fragmentation incomplète de l'ARN au cours des premières étapes de la préparation de la bibliothèque. Cela pourrait se produire si faiblequalité de l'ARN est utilisé ou si le protocole n'est pas exactement suivie. Par exemple, la modification des durées d'incubation ou de la température, ajout de réactifs dans l'ordre incorrect ou la pause entre la fragmentation et la synthèse du premier brin de l'ADNc. Si vous retournez les bibliothèques dans le support magnétique ne supprime pas l'ADN poids moléculaire élevé, il est conseillé de répéter la préparation bibliothèque avec des échantillons d'ARN frais.

De faible intensité: si l'intensité du premier cycle est plus faible que prévu, il est possible que les amorces ne s'hybrident avec les grappes correctement lors de la dernière étape de production cluster ou la cellule d'écoulement a été stocké pendant trop longtemps entre le regroupement et le début de la séquence de fonctionner. Dans ce cas, un réhybridation primaire doit être effectuée en utilisant un kit rehyb amorce d'Illumina. Le plus souvent, ce rehyb résout les problèmes d'intensité et la course peut être démarré sur sans aucun problème. Si, après une rehyb, les intensités sont encore faibles, la question peut êtreavec les bibliothèques ou la séquence de synthèse (SBS) et réactifs d'Illumina service technique doit être contacté pour le dépannage. Si l'intensité de la lecture du premier sont bons, mais les intensités sont faibles après demi-tour, un rehyb primaire de l'amorce seconde lecture peut être nécessaire. Ceci est effectué sur l'instrument de séquençage Illumina et service technique doit être contacté pour la procédure.

Haute phasing / prephasing: Si supérieur à la normale progressive ou prephasing est observé, une cause possible est la contamination des réactifs SBS autres avec le tampon de clivage. Au cours des étapes de préparation SBS, il est essentiel de gérer le tampon de clivage dernier et changer de gants entre la manipulation de la mémoire tampon de clivage et les autres réactifs. En cas de contamination tampon de clivage est suspectée, un rehyb amorce de la cellule d'écoulement doivent être réalisées et de nouveaux réactifs SBS doit être préparé. Alternativement, il pourrait y avoir contamination dans les lignes de l'inst RUMENT. Si cela est suspecté, l'instrument doit subir un lavage d'entretien (un lavage à l'eau suivi d'un lavage NaOH, suivi d'un lavage à l'eau final), une rehyb primaire doit être effectué sur la cellule d'écoulement et de nouveaux réactifs SBS doit être préparé. Si les valeurs de phasage / prephasing sont moyennement élevés (~ 0,5), la course peut être poursuivie jusqu'à ce que le Q30 scores et des grappes de passage du filtre sont calculés. Ces niveaux peuvent être encore dans des limites acceptables, même avec phasage et / ou prephasing.

Généralisation de ce protocole

Bien qu'il soit spécifique à la HiScanSQ Illumina, ce protocole est applicable à toute la famille HiSeq ou le Genome Analyzer II Illumina instruments ( www.illumina.com ) avec des modifications mineures des étapes de génération de cluster et des réactifs de séquençage. Autres prochaine génération de plates-formes de séquençage d'ADN tels que la série (SOLiD"_blank"> Www.lifetechnologies.com), les systèmes GS ( www.454.com ) ainsi que des nouveaux systèmes plus récents sont également utilisés dans le but d'ARN-seq ^11. Bien que leur construction de la bibliothèque et des procédures de séquençage peut être légèrement différente, les conseils de manipulation d'ARN, les parties d'analyse de données (en aval des étapes de manioc) et de la validation par RT-PCR dans le présent protocole peut être de valeur de référence pour leurs applications RNA-Seq .

Il convient également de souligner que ce protocole est spécifique à l'ARN-seq moins un point dans le temps de thrombine traités HMVEC-LBL cellules, mais il pourrait facilement être adapté à une étude multi-point-temps ou des études dans d'autres cellules, les tissus traités avec stimuli différents ou des inhibiteurs ou des comparaisons des transcriptomes dans des cellules ou des tissus entre un état sain et d'un état pathologique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC-2815
Lonza, Bullet Kit	Lonza	CC-3202	Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics
Thrombin	Sigma	T4393
Ambion mirVana Kit	Life Technologies	AM 1560
RNase-Zap	Life Technologies	AM9782
Experion StdSens RNA	Bio-Rad	700-7103
TruSeq RNA Preparation Kit	Illumina	FC-122-1001
AMPureXP Beads	Beckman Coulter	A63881
Superscript Reverse Transcriptase II	Life Technologies	18064-014
Experion DNA 1K	Bio-Rad	700-7107
QuantiTect SyberGreen	Qiagen	204163
PE Cluster Generation Kit	Illumina	PE-401-3001
PhiX Control Kit	Illumina	FC110-301
200 Cycle SBS Kit	Illumina	FC-401-3001
HiScanSQ*	Illumina	SY-103-2001
cBot	Illumina	SY-301-2002
qPCR machine - Viia7	Life Technologies	Model #VIIA7 / Equipment #10631261	Or equivalent
Experion System	Bio Rad	7007001	Bioanalyzer is an alternative system
Spectrophotometer	Bio-Tek	Epoch Microplate Spectrophotometer	Or equivalent
Centrifuge - Sorvall Legend XTR	Thermo Scientific	75004521	Or equivalent
Magnetic stand	Life Technologies	AM10027
96-well thermocycler	General Lab Supplier
Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated.