Summary
Dieses Protokoll stellt eine vollständige und detaillierte Verfahren zur RNA-seq, eine leistungsstarke Next-Generation-DNA-Sequenzierung Technologie zum Profil Transkriptomen in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung anzuwenden. Dieses Protokoll ist generalisierbar verschiedenen Zellen oder Geweben von verschiedenen Reagenzien oder Krankheitszuständen befallen.
Abstract
Die Charakterisierung der Genexpression in Zellen über Messung der mRNA ist ein nützliches Werkzeug bei der Bestimmung, wie der transkriptionellen Maschinerie der Zelle von externen Signalen (zB Arzneimittelbehandlung) oder wie Zellen unterscheiden zwischen einem gesunden Zustand und einem erkrankten Zustand ist betroffen. Mit dem Aufkommen und kontinuierliche Weiterentwicklung der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Technologie hat RNA-Sequenzierung (RNA-seq) eine zunehmend beliebte Methode der Transkriptom-Analyse, um alle Arten von Transkripten zu katalogisieren, um die transkriptionelle Struktur aller exprimierten Gene zu ermitteln und zu quantifizieren die wechselnden Expressionsniveaus des gesamten Satzes von Transkripten in einer bestimmten Zelle, Gewebe oder Organismus 1,2. RNA-seq ersetzt nach DNA-Mikroarrays als bevorzugte Methode für die Transkriptom-Analyse, da sie die Vorteile der Profilierung eine komplette Transkriptom hat, ein digitales Typ Datum (Kopienzahl jeder transcript) und sich auf keine bekannten genomischen sequence 3.
Hier stellen wir eine vollständige und detaillierte Protokoll RNA-seq zum Profil Transkriptomen gelten in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung. Dieses Protokoll basiert auf unseren kürzlich veröffentlichten Studie mit dem Titel basiert "RNA-seq enthüllt Novel Transkriptom von Genen und deren Isoformen in Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin behandelt," 4, in denen wir erfolgreich durchgeführt die erste komplette Transkriptom-Analyse der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen behandelt mit Thrombin mittels RNA-seq. Es ergab beispiellose Ressourcen für weitere Experimente, um Einblicke in die molekularen Mechanismen, die Thrombin-vermittelte endotheliale Dysfunktion in der Pathogenese von entzündlichen Erkrankungen, Krebs, Diabetes und koronare Herzkrankheit zu gewinnen, und bietet potenziellen neuen Leads für therapeutische Targets zu diesen Krankheiten.
Der beschreibende Text des Protokollsist in vier Teile gegliedert. Der erste Teil beschreibt die Behandlung von pulmonaler menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin und RNA-Isolation, Qualität Analyse und Quantifizierung. Der zweite Teil beschreibt Aufbau der Bibliothek und Sequenzierung. Der dritte Teil beschreibt die Analyse der Daten. Der vierte Teil beschreibt einen RT-PCR Validierung Assay. Repräsentative Ergebnisse von mehreren wichtigen Schritten angezeigt. Nützliche Tipps oder Hinweise auf zu Erfolg in wichtigen Schritten zu steigern sind in der Diskussion Abschnitt. Obwohl dieses Protokoll verwendet menschlichen pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen mit Thrombin behandelt wird, kann es sein, generalisierte zum Profil Transkriptomen in beiden Säuger und Nicht-Säuger-Zellen und in Geweben mit unterschiedlichen Stimuli oder Inhibitoren oder Transkriptomen in Zellen oder Geweben zwischen einem gesunden Zustand vergleichen behandelten und einen Krankheitszustand.
Protocol
Ein Flussdiagramm, dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
Ein. Behandlung der Zellen mit Thrombin, RNA Isolation, Quality Assessment und Quantifizierung von RNA
- Kultur Human Lung mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC-LBL) 90-100% Konfluenz in 6-Well-Platten in EGM-2-Medium mit 5% FBS, Wachstumsfaktoren und Antibiotika (Lonza, cat # CC-3202).
- Anderer Medien zu den Hungermedium (0% FBS) 30 min vor der Behandlung mit Thrombin.
- Behandlung der Zellen mit 0,05 U / ml Thrombin oder lassen unbehandelten als Kontrolle für 6 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Isolieren der Gesamt-RNA aus den behandelten und Kontroll-Zellen unter Verwendung des Ambion mir Vana Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bewerten Sie die Qualität der RNA mit einer Experion StdSense eukaryotischen RNA-Chip nach dem Standard-Protokoll auf dem Experion Automatisierte Elektrophorese Station (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
- Quantifizierung der RNA mit einem Standard-spektrophotometrische Methode.
2. Library Construction und Sequenzierung
- Verwenden Sie 1 ug von hoher Qualität Gesamt-RNA pro Probe als Ausgangsmaterial.
- Um die Bibliothek zu bauen, folgen Sie den Standard-Verfahren von Illumina (Protokoll # 15008136 Rev. A). In diesem Protokoll zwei Runden von Poly (A) enthaltende mRNA Auswahlen werden durchgeführt, um zu entfernen, um die rRNA rRNA-Sequenzierung zu minimieren.
- Bewerten Sie die Qualität der Bibliotheken mit einem Experion DNA 1K-Chip nach dem Standard-Protokoll auf dem Experion Automatisierte Elektrophorese Station ( www.bio-rad.com ).
- Quantifizierung der Bibliothek mit qPCR: Verwenden Sie eine Bibliothek, die zuvor als Standardkurve und spezifische Primer für die ligierten Adapter wurde sequenziert. Verwenden Sie eine Reihe von Verdünnungen der unbekannten Bibliotheken (dh 1:100, 1:500 und 1:1000). Führen Sie die qPCR according der SyberGreen MM-Protokoll und berechnen den ursprünglichen Bestand Konzentration von jeder Bibliothek.
- Verdünnen Sie die Bibliotheksbestände bis 10 nm und bei -20 ° C bis zum Cluster eine Durchflusszelle.
- Wenn Sie bereit sind Cluster eine Durchflusszelle, auftauen der CBOT Reagenz Platte in einem Wasserbad. CBOT ist eine Illumina Instrument benutzt, um die Cluster-Generation zu rationalisieren.
- Waschen Sie die CBOT Instrument.
- Denaturierung der Bibliotheken: Kombinieren Sie 13 ul 1x TE und 6 ul 10 uM Bibliothek und an der Seite des Rohres, fügen Sie 1 ul 1 N NaOH (von Illumina). Vortex, Spin-down, Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und legen die denaturierten Bibliotheken auf Eis.
- Verdünnt den Bibliotheken: Verdünnen der denaturierten Bibliotheken mit vorgekühlten Hybridisierungspuffer (HT1, bereitgestellt durch Illumina) durch Kombinieren 996 ul HT1 und 4 ul denaturierten Bibliothek nach einer Endkonzentration von 12 pM. Legen Sie die denaturiert und verwässert Bibliotheken auf Eis.
- Invert jede Zeile der Rohre der CBOT Platte,sicherzustellen, dass alle Reagenzien aufgetaut werden. Spin-Down der Platte entfernen / Punktion der Folie Dichtungen und laden auf der CBOT.
- Aliquot 120 ul der verdünnten, denaturierten Bibliotheken auf einen Streifen Gefäß mit der Beschriftung 1-8. Mit 1,2 ul verdünnte, vergällt PhiX Control-Bibliothek (von Illumina) in jedes Röhrchen als spike-Kontrolle. Vortex und Spin-down der Rohre und laden Sie sie an der CBOT in der richtigen Ausrichtung (Röhrchen Nr. 1 auf der rechten Seite).
- Legen Sie eine Durchflusszelle und vielfältig auf die CBOT.
- Füllen Sie die Strömung zu überprüfen und beginnen das Clustering Lauf.
- Nach dem Lauf abgeschlossen ist, überprüfen Reagenz Lieferung in allen Gassen. Notieren Sie alle Auffälligkeiten. Entweder starten die Sequenzierung Lauf sofort oder lagern Sie die Durchflusszelle in der mitgelieferten Röhrchen bei 4 ° C.
- Tauen die Sequenzierung durch Synthese (SBS, Illumina) Reagenzien.
- Legen Sie die Reagenzien zu den entsprechenden Stellen auf den Reagenzgefäße, was sicher nicht zu den anderen Reagenzien nach dem Berühren der Spaltung Mix berühren.
- Verwendung eines nichtn-Sequenzierung Durchflusszelle (dh eine, die zuvor wurde sequenziert), prime die Reagenzleitungen zweimal.
- Reinigen Sie die Sequenzierung Durchflusszelle mit 70% EtOH und Kimwipes, um 70% EtOH und Brillenputztuch gefolgt. Überprüfen Sie die Durchflusszelle für alle Streifen. Re-Reinigung, wenn nötig.
- Laden die Flußzelle auf dem Sequenzer und führen einen Strom überprüfen, um sicherzustellen, dass die Dichtung zwischen dem Verteiler und der Durchflusszelle dicht ist.
- Starten Sie die Sequenzierung Lauf.
- Bewerten Sie die Qualität Metriken (zB die Cluster-Dichte, Clustern vorbei Filter, Q30, Intensität), sobald sie verfügbar während des Laufs werden.
- Überwachen Intensität über die gesamte Auflage.
- Nach 101 Zyklen abgeschlossen sind, führen Turnaround Chemie zur Vollendung des zweiten lesen: Tauen Sie die Paired-End-Reagenzien und die zweite Lese Incorporation Buffer (ICB, eine Komponente des SBS Reagenzien, Illumina) und laden Sie die Reagenzien.
- Fahren Sie mit der Sequenzierung Lauf Beurteilung 2 nd lesen Intensität, Q30 einnd anderen Qualitätsmetriken als Lauf fortschreitet.
3. Data Analysis
- Verwenden Sie die neueste Version von Casava (Illumina, derzeit 1.8.2), um die Basis-Call-Dateien (. Bcl) Dateien. Fastq Dateien zu konvertieren, setzen fastq-cluster-count auf 0, um die Schaffung eines einheitlichen fastq Datei für jede Probe zu gewährleisten . Entpacken Sie die fastq Dateien für nachgeschaltete Analyse.
- Führen gepaart Ende Ausrichtung mit den neuesten Versionen von TopHat (1.4.1) 5, die RNA-seq liest Säuger-sized Genome mit dem Ultra-High-Throughput-Kurz read Ausrichter (Bowtie, 0.12.7) 6 und samtools (0,1 ausrichtet. 17) 7. Samtools implementiert verschiedene Dienstprogramme für die Nachbearbeitung Ausrichtungen in der SAM-Format. Der Verweis menschlichen Transkriptom aus iGenomes (heruntergeladen werden www.illumina.com ). Im laufenden TopHat, haben wir alle Standard-Parametereinstellungen einschließlich der Bibliothek Typ Option fr-unverseilten (default).
- UnsIng. das Programm CuffDiff ein Teil der Manschettenknöpfe (1.3.0) 8 Softwarepaket, vergleicht die Thrombin-behandelten Zellen zu den Kontrollen Zellen herauszufiltern die differentiell exprimierten Gens Transkripte in der ehemaligen am menschlichen Referenz Transkriptom basiert. Dieser Vergleich ermittelt die differentielle Expression von bekannten Transkripte. Verwenden Sie Microsoft Excel, um das Ergebnis in tabellarischer Form darzustellen. Im laufenden Manschettenknöpfe Programm, haben wir alle Standard-Parametereinstellungen. Diese Gentranskripten mit FPKM <0,05 und p> 0,05 herausgefiltert.
- Um neue Isoformen erkennen, führen Manschettenknöpfe ohne einen Verweis Transkriptom. Vergleichen Sie die Probe transcript Dateien auf den Referenz-Genom mit Cuffcompare und testen Sie die differentielle Expression mit Cuffdiff mit kombiniertem Thrombin transcript-Dateien als Referenz Genom für eine Analyse und die kombinierte Steuerung transcript-Dateien als Referenz Genom für eine zweite Analyse. Verwenden Sie Microsoft Excel, um das Ergebnis in tabellarischer Form darzustellen. Wieder those Gentranskripten mit FPKM <0,05 und p> 0,05 herausgefiltert. Nach diesem Schritt können die Ermittler entscheiden, um eine Liste der neu gemeldeten Transkripte der UCSC Genome Browser Website (Upload http://genome.ucsc.edu/ ) auf ihre Gültigkeit durch eine manuelle Inspektion zu überprüfen.
- Senden Listen differentiell exprimierter Gene Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com ) zur Charakterisierung der Gene und Signalwege durch den Thrombin Behandlung nicht beeinflusst. In diesem Schritt kann die Ermittler entscheiden, Kummerbund (verwenden http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), eine R-Paket, das entworfen, um zu helfen und vereinfachen die Aufgabe der Analyse Manschettenknöpfe RNA-seq ausgegeben wird, um die Verwaltung, Visualisierung und Integration aller Daten durch einen Cuffdiff Analyse hergestellt.
4. Validierung der RNA-seq Ergebnisse mittels quantitativer real-time-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)
- Führen Gesamt-RNA Isolation von Steuerung und Thrombin behandelten HMVEC-LBL-Zellen, RNA Qualitätsbewertung und RNA-Quantifizierung in den Schritten von 1,4 bis 1,6 beschrieben.
- Generieren komplementäre DNA von 1 pg Gesamt-RNA jeder Probe mit SuperScript III First-Strand Synthesis System RT Kits nach den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen, 18080-051).
- Führen qRT-PCR-Analyse auf einem Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System mit TaqMan-Assay-on-Demand entwickelt Oligonukleotide für die Detektion von CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) und β-Aktin (ACTB, Hs99999903_m1). Jede Probe wies eine Vorlage entspricht 5 ng Gesamt-RNA. Messen Quantifizierung mit dem DDCt Methode und zu normalisieren, um β-Aktin. Jeder Test wurde über mindestens drei biologischen Replikaten durchgeführt.
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Representative Results
Für Schritt 1: Die 28s: 18s-Verhältnis wird traditionell als Indikator für die RNA-Abbau verwendet. Idealerweise sollte die 28s Peak etwa doppelt der Fläche der 18s Band (ein Verhältnis von 2) aufweisen, wird dies jedoch oft nicht ideale Verhältnis in der Praxis angesehen. Weiterhin 28s: 18s können Verhältnisse von spektrophotometrischen Methoden erhalten unterschätzen die Menge des Abbaus der RNA. Um genauer zu quantifizieren den Abbau und somit die Qualität der RNA-Probe, berechnet das System eine RNA Experion Quality Indicator (RQI) Nummer. Die RQI Algorithmus vergleicht die Elektropherogramm von RNA-Proben, um Daten aus einer Reihe von genormten, abgebaute RNA Proben und kehrt automatisch eine Zahl zwischen 10 (intakte RNA) und 1 (abgebaute RNA). Die RNA-Qualität sollte eine RQI von mindestens 7, idealerweise größer als 8 ist. Abbildung 2 zeigt die Experion Ergebnisse mit einem hochwertigen RNA-Probe mit einem RQI von 8,4.
FürSchritt 2: Die Bibliotheken sollten eine breite Bande bei ca. 250-300 bp haben Abbildung 3 zeigt Experion Ergebnisse einer qualitativ hochwertigen Bibliothek Abbildung 4 zeigt die qPCR Ergebnisse der Standardkurve Proben und eine unbekannte Probe (in dunkelblau)... Der Fortschritt und die Qualität der Sequenzierung Lauf sollte ständig während des Laufs beobachtet werden Abbildung 5 zeigt entsprechende Cluster-Dichte während des ersten Zyklus Bildgebung Schritt;. Dies ist der erste Hinweis auf der Flucht Qualität. Cluster sollte hell sein und konzentriert. Abbildung 6 zeigt die First Base Bericht nach dem ersten Zyklus erzeugt wird, ist abgeschlossen. Es ist wichtig, um die geschätzte Clusterdichte, Intensitätspegeln und Fokusqualität an diesem Punkt zu beurteilen. Die nächste Qualität Checkpoint nach Zyklus 4 ist in Abbildung 7 dargestellt. Dies zeigt die absolute Cluster-Dichte für jede Spur. Der Cluster Dichte sollte nicht über 850 k / mm 2 betragen. Nach Zyklus 13,Phasing (wenn eine Base nicht während eines Zyklus hinzugefügt) und prephasing (wenn zwei Basen während eines Zyklus versetzt) Statistik berechnet werden, wie in 8 gezeigt. Typische-Werte zwischen 0,1 und 0,25. Der große Qualitätsbeurteilung ist nach Zyklus 24, wenn mehrere Qualitätsmetriken berechnet werden kann. Der prozentuale Anteil der liest über Q30, wie in Abbildung 9 gezeigt, ist ein Maß für das Vertrauen, das in der Basis Berufung. Ein Lesen mit einem Q Punktzahl von 30 bedeutet, dass es eine 1 in 1000 zufällig Basis Anruf falsch ist. Die Q Scores wird als Lauf Fortschritte zu verringern, sollte aber beginnen mit mehr als 95% der liest erfüllen oder übertreffen Q30. Die Cluster Passieren Filter (PF), in 10 gezeigt, sind die Cluster aus der die aktuellen Sequenzdaten, Rechnung trägt. Idealerweise sollte diese oberhalb von 85% liegen. Der Cluster PF wird von vielen Faktoren ab, einschließlich Phasing, prephasing, Intensität und Q30 basiert. Es wird nicht als Lauf fortschreitender ändern. Die prozentuale ausgerichtet ( Für Schritt 3: Tabelle 1 zeigt exprimierten Genen und Isoformen in den Kontroll-und Thrombin-behandelten humanen pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen. Insbesondere gibt es etwa 26.000 neue Isoformen detektiert, was die Festigkeit des veranschaulicht RNA-seq-Nachweis kann RNAs, alternativ gespleißte Transkripte und alternative Promotor Nutzung, welche nicht erfassbarer Mikroarray Techniken 3 zu identifizieren. RNA-seq kann auch messen die weniger reichlich Transkripte, die ungenau quantifiziert werden oder nicht erkannt von Microarrays. Abbildung 12 und Tabelle 2 Display differentially exprimierten Genen in der Thrombin-Signalweg. Dies ist ein Beispiel der dritten Generation Wissensbasis-driven Pathwayanalyse 9: pathway Topologie Ansätze, mit Ingenuity Pathway Analysis Software. Es zeigt, dass ein sechs h Thrombinbehandlung signifikant oben reguliert den Thrombinrezeptor Par 4 und unten reguliert den Thrombinrezeptor Par 3 während es keine Veränderung in der Expression des Thrombinrezeptors Par ein. Expression NFKB1 sind NF KB2 und Src auch signifikant hochreguliert. Einige der Rho-Familie Gene (Rho B, C, F und G) sind hoch reguliert, während andere (Rho J, Q, T1, U und V) herunterreguliert sind (Tabelle 4). Myosin-leichte-Kette-Gen 9 (MYL9) ist hoch reguliert, während MYL12B ist herunterreguliert. Expression anderer Gene entweder herabreguliert oder nicht beeinflusst. Für Schritt 4: Um die RNA-seq Ergebnisse mit einen alternativen Ansatz zu überprüfen, führten wir eine qRT-PCR Experiment Assay drei verschiedenenMiete Gene (Abbildung 13). In RNA-seq Daten war TRAF1 hochreguliert von 7,96 fach; CELF1 war 1,16 fach herabreguliert; und FANCD2 wurde von 1,70 fache herunterreguliert. In qRT-PCR-Daten sind diese entsprechenden Zahlen 7,25 fach, -1,15 und -2,07 fache fache. Die Ergebnisse dieser drei Gene durch RNA-seq und qRT-PCR untersucht sind in guter Übereinstimmung, die die RNA-seq Ergebnisse bestätigt. Tabelle 1. Gene / Isoform Expression Zusammenfassung *. Diese Tabelle listet Genen, Isoformen und neuartige Isoformen in Steuer-und Thrombin-behandelten HMVEC-LBL-Zellen exprimiert. Der fache Änderung ist das Verhältnis von Thrombin FragmentsPerKilobase an Transkript perMillion Fragmente kartiert (FPKM) bis FPKM steuern. Diese Gene bekannt, Isoformen und neue Isoformen mit 2-fach oder mehr Unterschied zwischen beiden Gruppen haben statistisch unterschiedlich Expression (wie nach Benjamini-Hochberg Korrektur bestimmt). * Diese Tabelle ist aus Tabelle 2 in Referenz 4 wiedergegeben. Tabelle 2. Differentiell exprimierte Gene und Isoformen in Thrombin Signaling Pathway *. * Diese Tabelle wird aus der Tabelle S4 in Referenz 4 mit einer geringfügigen Änderung reproduziert. **, Q-Wert, ein false discovery rate eingestellt p-Wert. 93/4393fig1.jpg "alt =" Abbildung 1 "/> Genes Steuern Thrombin Insgesamt Gene exprimiert 16.636 16.357 Steuerung nur 783 Thrombin Nur 504 Up-regulierten (2-fach oder mehr Differenz) 152 Down-reguliert (2-fach oder greater Differenz) 2.190 Bekannte Isoformen Steuern Thrombin Insgesamt bekannten Isoformen Ausgedrückt 26.807 26.300 Steuerung nur 1.492 Thrombin Nur 985 Up-regulierten (2-fach oder mehr Differenz) 480 Down-reguliert (2-fach oder mehr Differenz) 3.574 Novel-Isoformen Steuern Thrombin Insgesamt Novel Isoformen Ausgedrückt 25.880 25.886 Steuerung nur 418 Thrombin Nur 424 Up-regulierten (2-fach oder mehr Differenz) 1.775 Down-reguliert (2-fach oder mehr Differenz) 12.202 Down-regulierte Gene Gene Symbol Insgesamt fache Änderung Mitglieder Einzelne Falte ändern q_value ** FPKM Steuerung FPKM Thrombin PLC -2,49 PLCB1 -2,97 0 6,75585 2,27611 PLCB2 -1,32 0.00183634 1,80892 1,36957 PLCB4 -10,04 6.28386E-14 0.682668 0,0679837 PLCL1 -2,53 5.26728E-09 0.602879 0.238017 Gaq -1,87 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 Gai -1,56 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 PKC -2,15 PRKCE -1,65 0 9,36364 5,67305 Prkci -2,14 0 6,63566 3,09818 PRKD3 -2,61 0 16,0215 6,12878 IP3R -2,60 ITPR1 -1,39 0,000018734 1,51592 1,09009 ITPR2 -3,19 0 7,23283 2,26944 CREB -2,36 CREB1 -2,36 0 5,19117 2,2004 GATA -2,33 GATA3 -2,33 0.0228108 0.716773 0.307131 TBP -1,35 TBP -1,35 2.66E-05 8,48689 6,30476 G-Protein Alpha -1,64 GNA14 -1,49 0,000122496 2,78076 1,86573 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 PAR3 -1,87 F2RL2 -1,87 1.02474E-06 1,51286 0.810286 SOS1 SOS1 -2,27 0 8,94353 3,94679 Ras -1,69 KRAS -2,03 0 11,2766 5,5659 NRAS -1,61 0 38,0874 23,6491 AKT -1,77 AKT3 -1,77 0 15,8228 8,94223 MLKP -2,38 PPP1CB -2,10 0 39,585 18,8199 PPP1R12A -3,56 0 15,2274 4,27516 PPP1R12B -2,66 5.28466E-13 1,92123 0.722188 FAK -1,31 PTK2 -1,31 4.3856E-10 39,7935 30,3044 p70 S6K RPS6KB1 -1,99 0 8,46312 ROCK -3,68 ROCK1 -3,54 0 19,5921 5,53112 Rock2 -3,86 0 16,0054 4,14759 CAMK -1,17 CAMK1 1,30 0,000255587 7,90794 10,296 CAMK2D -1,74 2.22911E-12 11,4497 6,56804 CAMK4 -2,58 0,000619045 0,62714 0.243277 Up-regulierte Gene Symbol Insgesamt fache Änderung Mitglieder Einzelne Falte ändern q_value ** FPKM Steuerung FPKM Thrombin PAR4 1,59 F2RL3 1,59 9.19043E-13 4,99867 7,9253 Src 1,47 Src 1,47 0 14,1085 20,675 NF-kB 1,65 NFKB1 1,66 0 19,5113 32,3457 NFKB2 2,02 0 28,7563 58,1293 RELA 1,45 0 55,3482 80,28 Teilweise Up-/Partial Down-regulierte Gene Symbol Insgesamt fache Änderung Mitglieder Einzelne Falte ändern q_value ** FPKM Steuerung FPKM Thrombin G-Protein gamma 1,22 GNG10 -1,34 2.17216E-08 27,192 20,2206 GNG11 1,31 5.66209E-05 770,922 1011,05 GNG12 -1,44 5.11591E-13 112,397 78,3023 GNG2 2,43 6.38453E-09 0.465705 1,13132 G-Protein beta 1,27 GNB2 1,36 1.91268E-10 137,786 187,43 GNB3 -2,69 4.71259E-11 2,58703 0.962504 GNB4 -1,61 0 15,8275 9,85484 Rho GEF -1,16 ARHGEF12 -1,67 0 30,6424 18,3015 ARHGEF2 1,33 5.80478E-08 27,6288 36,758 ARHGEF3 -1,48 0 20,3279 13,7813 ARHGEF6 -2,08 0 2,67944 1,28635 ARHGEF9 -1,54 0.00469498 1,56367 1,0159 PI3K -1,80 Geldautomat -6,84 0 4,98972 0.729483 PIK3C2A -5,09 0 17,7894 3,49234 PIK3C3 -1,49 4.66294E-15 12,6504 8,50852 PIK3CA -3,14 0 16,8398 5,36228 PIK3CB -1,36 8.4357E-09 9,68516 7,12129 PIK3CD 1,86 0 5,6579 10,5507 PIK3CG -1,76 2.32945E-10 1,86962 1,06419 PIK3R1 -1,79 0 5,48118 3,06256 PIK3R3 -1,59 1.50915E-05 5,24549 3,30763 PIK3R4 -1,40 7.18425E-12 8,34176 5,97942 Rho 1,19 RHOB 1,31 9.48429E-06 232,232 304,587 RhoC 1,38 458,267 630,235 Rhof 1,65 0 8,29676 13,7268 RHOG 1,40 1.02141E-14 58,6003 82,0172 RHOJ -1,57 0 127,446 80,9317 RHOQ -1,52 0 16,4802 10,8122 RHOT1 -1,96 3.00071E-12 8,48834 4,33755 RHOU -1,54 0.00184367 0.900141 0.586092 RHOV -3,32 0.0056467 1 0.413912 0.124591 RND3 -1,95 0 58,0564 29,7075 MLC -1,06 MYL12B -1,43 4.87832E-11 872,075 608,472 MYL9 1,48 0 202,636 299,559
Abbildung 1. Flussdiagramm des Protokolls für RNA-seq Profilierung der Thrombin-vermittelten Transkriptom in menschlichen Lungen mikrovaskuläre Endothelzellen. Erstens behandeln Zellen und Isolierung und Quantifizierung von RNA. Bereiten Bibliotheken aus den hochwertigen RNA und beurteilen ihre Konzentration (über qPCR) und Qualität (über eine Bioanalyzer), dann Cluster auf einem Durchflusszelle. Starten Sie die Sequenzierung Lauf und analysieren die Qualität des Laufes ganz. Die große Qualität Checkpoints sind Zyklen 1, 4, 13 und 24 Jahren. Mit Casava, konvertieren Sie die bcl Dateien fastq Dateien und richten Sie dann die in das Genom mit TopHat. Erkennen von bekannten und unbekannten Isoformen unter Verwendung Manschettenknöpfe und bestimmen differentielle Expression mit CuffDiff. Anzeigen der Ausgabedateien in Excel und herauszufiltern Gene, die eine Expression von weniger als 0,05 FPKM oder einen p-Wert größer als 0,05 haben. Reichen Sie die übrigen Gene zu Ingenuity Pathway Analysis für weitere Informationen über die Gen-Funktionen und Signalwege affected durch den Thrombin Behandlung. Üblicherweise ausgewählten differentiell exprimierter Gene eingestellt werden durch einen alternativen Ansatz, wie qRT-PCR überprüft. 
Abbildung 2. Eine repräsentative Probe mit einem RNA RQI von 8,4 wie vom Experion Automatisierte Elektrophorese analysiert Bahnhof A) Der einzelne Spur von hochwertigen RNA -.. Die x-Achse stellt Zeit und die y-Achse zeigt Fluoreszenzsignal B) Das virtuelle Gelbild einer hochwertigen RNA-Probe. Die Intensität des 28S Spitzenwert größer als 18S Peak und keine Verschmutzung zu sehen ist. Beide Bands sind scharf und definiert. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3. Hochqualitative Bibliothek aus RNA hergestellt, wie durch die Experion Automatisierte Elektrophorese analysiert Bahnhof A breiten Peak zwischen 250 und 300 bp nachgewiesen wird und keine DNA mit hohem Molekulargewicht (kontaminierender DNA) beobachtet A) Der einzelne Spur einer hochwertigen Bibliothek.. - die x-Achse stellt Zeit und die y-Achse zeigt Fluoreszenzsignal B) Das virtuelle Bild von einem Gel hochwertigen Bibliothek. Ein breiter Peak zwischen 250 und 300 bp erkannt wird und keine DNA mit hohem Molekulargewicht (kontaminierender DNA) beobachtet wird. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
<strong> Abbildung 4. qPCR Ergebnisse mit SyberGreen und Primer spezifisch für Illumina ligierten Adapter. Ein zuvor gruppierten Bibliothek als Standardkurve verwendet werden, um die optimale Clustering Konzentration für den neu erstellten Bibliothek zu bestimmen. Die Verdünnung der unbekannten Bibliothek fällt innerhalb der Standardkurve Konzentrationen. Die Standardkurve Proben werden durch die Pfeile angeklagt und die unbekannte Probe ist dunkelblau und auch die durch einen Pfeil.
Abbildung 5. . Entsprechende Clusterdichte während des ersten Zyklus Bebilderungsschritt Die Cluster sind klare, fokussierte und hellen A) Base A;. B) Base C, C) Base G, D) Base T.
| Metrisch | Spur 1 | | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Lane 7 | Spur 8 | |
| Cluster-Dichte (k / mm 2) | 420,94 | 412,95 | 410,81 | 408,54 | 416,71 | 416,56 | 410,02 | 411,84 |
| Ein Intensity | 25870,5 | 23886 | 23891,38 | 23735,83 | 23949,38 | 24933,08 | 24305,79 | 23950,29 |
| C Intensity | 21559,62 | 19822,33 | 19759,33 | 19472 | 19954,21 | 20611,75 | <td> 1989219438,29 | |
| G Intensity | 13619,46 | 11756,67 | 11486,44 | 10498,38 | 12186,62 | 12195,5 | 11826,88 | 11010,5 |
| T Intensity | 19402,67 | 17663,79 | 17854,42 | 17353,75 | 17545,54 | 18060,67 | 18457,92 | 17397,12 |
| Ein Fokus Ergebnis | 68,2 | 67,46 | 67,67 | 67,75 | 67,41 | 67,43 | 67,63 | 67,05 |
| C Fokus Ergebnis | 67,93 | 67,33 | 67,56 | 67,66 | 67,33 | 67,39 | 67,46 | 66,9 |
| G Fokus Ergebnis | 65,4 | 64,14 | 63,98 | 63,92 | 63,29 | 63,41 | 63,47 | 63,74 |
| T Fokus Ergebnis | 66,45 | 65,57 | 65,5 | 65,49 | 65,03 | 65,23 | 65,57 | 65,59 |
Abbildung 6. Die First Base Bericht nach dem ersten Zyklus erzeugt wird, abgeschlossen. Die Cluster-Dichte (obwohl zu diesem Zeitpunkt unterschätzt) angemessen ist. Die Intensitäten gut aussehen (10,000-26,000, mit G mit der niedrigsten Intensität). Die Fokusauswertungen sind ebenfalls geeignet, fallen rund 65-70, obgleich auch höhere Werte angemessen sind.
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Abbildung 7. Der Cluster Dichte nach Zyklus 4 berechneten Der Cluster Dichte ist geringer als 850 k / mm 2 und sogar in allen Gassen A) tabellarischer Form;... B) Graph Form Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 8. Phasing (nicht die Zugabe einer Base während eines Zyklus) und Pre-Phasing (um zwei Basen während eines Zyklus). Beide Werte werden bei 0,25 oder darunter, was auf entsprechende Phasing / Vorphasierung Ebenen. A) Die Phasing und Vorphasierung Zahlenwerte . B) Die Phasing-Werte in grafischer Form. C) Die Vorphasierung Werte in grafischer Form. Clic K Sie hier, um größere Zahl anzuzeigen.
Abbildung 9. Die verschiedenen Darstellungen von Q30 Partituren nach Zyklus 24. Eine Punktzahl von 30 oder höher zeigt eine 1 in 1.000 Zufall, dass base Aufruf ist falsch. Rund 90% der Q Werte liegen über 30 A) tabellarischer Form (Q30 Partituren hier sind aus der Gesamtheit der Flucht, über Zyklus 24);. B) Q30 Partituren von Zyklus. Jeder Balken stellt die Verteilung der liest fallen bei Q30 oder höher für den jeweiligen Zyklus. C) Q30 Scoreverteilungen über Zyklus 24. Die Verteilung der Q Partituren auf kumulativer Basis über Zyklus 24. Q-Score ist auf der x-Achse und Millionen von reads auf der y-Achse ist. Liest mit einer Q30 über 30 sind in grün dargestellt.oad/4393/4393fig9large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
Abbildung 10. Die verschiedenen Darstellungen von Clustern vorbei Filter. Clusters vorbei Filter basiert auf verschiedenen Parametern, einschließlich Q30, Intensität und Phasing / Vorphasierung basiert. Mindestens 85% der Cluster übergeben Filter in jeder Spur A) tabellarischer Form;. B) Graph Form darzustellen blauen Kästchen die Anzahl der Cluster, stellen grünen Kästchen die Cluster vorbei Filter. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 11. . Das Prozent der Cluster ausgerichtet auf die PhiX Genom Etwa 0,5% der Cluster ausrichten, um die PhiX Genoms, die für die Höhe der PhiX in die Proben gespickt A) tabellarischer Form;.. B) Graph Form Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 12. Gene differentiell durch den Thrombin Behandlung von HMVEC-LBL in der Thrombin-Signalweg ausgedrückt. Die Thrombin-Signalweg wurde von Ingenuity gebaut. In der Bahn, zeigt rot up-regulierten Genen (3 1,3-fach) und grün down-regulierten Genen (
Abbildung 13. qRT-PCR Validierung von drei differentiell exprimierten Gene von Thrombin behandelt HMVEC-LBL RNA-seq Daten. qRT-PCR wurde wie im Protokoll beschrieben durchgeführt. Falzen Veränderungen aus den relativen Ct-Werte der Gene Expression TaqMan Assay für CUGBP bestimmt Elav-ähnliche Familienmitglied 1 (CELF1), Fanconi Anämie, Komplementationsgruppe D2 (FANCD2) und TNF Rezeptor-assoziierter Faktor 1 (TRAF1)wurden mit denen durch RNA-seq detektiert verglichen. Wiederholungen (n = 4) von jeder Probe wurden durchgeführt und die CT-Werte gemittelt. Alle Ct-Werte wurden β-Aktin normalisiert. Die Fehlerbalken stellen den Bereich des fache Änderung wie durch die Daten Assist Software bestimmt. p <0,05 wurde als statistisch signifikant in Bezug fache Veränderungen zwischen Thrombin-treat-Gruppe und der Kontrollgruppe sowohl von der RNA-seq und die qRT-PCR-Assays. Die mRNA-Level in den Kontrollgruppen von jedem Assay wurde willkürlich als eine, die nicht gezeigt sind, eingestellt. *, P <0.05; ** p <0,01. Diese Zahl ist aus Abbildung 6 in Referenz 4 wiedergegeben.
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Discussion
Wichtige Schritte
RNA Handhabung: RNasen sogar verschlechtern die meisten hochwertigen RNA, daher muss darauf bei der Isolierung, Lagerung und Verwendung von RNA 10 entnommen werden. Handschuhe sind immer getragen werden, um Verschmutzungen durch RNasen auf die menschliche Hände fanden verhindern. Handschuhe sollten häufig gewechselt werden, insbesondere nach dem Berühren der Haut, Türklinken oder anderen gängigen Oberflächen. Eine Reihe von Pipetten sollten ausschließlich gewidmet sein, die Arbeit RNA und alle Tipps und Rohre sollten RNase-frei sein. RNA-Isolierung und stromabwärts Anwendung sollte in niedrig Verkehrsflächen, die routinemäßig mit einem Produkt wie RNase-Zap die Dekontaminierung durchgeführt werden. Der Abbau kann auch mit wiederholtes Einfrieren und Auftauen auftreten. Diese können durch Aliquotierung RNA für nachgelagerte Anwendungen sofort nach Isolierung minimiert werden. Alternativ kann cDNA aus für nachgelagerte Anwendungen wie qRT-PCR direkt nach der Isolierung werden. RNA sollte bei -80 ° C gelagert werden und auf Eis gehalten während des Gebrauchs. Es ist auch important gründlich auftauen und Vortex-RNA Proben vor und während des Einsatzes.
Das Ausgangsmaterial Qualität der RNA ist wesentlich für den Erfolg dieses Protokoll. Verwendung abgebaut oder anderweitig geringer Qualität RNA kann die Bibliothek der Vorbereitung bis zur scheitern oder in geringer Ausbeute, die nicht ausreichend für die Sequenzierung führen wird. Selbst wenn genug Bibliothek aus abgebaute oder niedriger Qualität RNA hergestellt werden kann, wird sie nicht genau darzustellen die Transkripte in der Probe vorhanden, was zu ungenauen Quantifizierung der Expression. Auch kann jedes nicht entfernte genomischen DNA während der RNA-Isolierung bewirken eine Überschätzung der Menge von RNA in dem Protokoll verwendet wird, aber, wenn eine Menge (z. B. 1-2 ug) in der Mitte der vorgeschlagene Bereich (0,1-4 ug) verwendet wird, wird die tatsächliche Menge an RNA ausreichend sein für das Protokoll. Darüber hinaus ist jeder genomischen DNA nicht geeignet, die von Oligo (dT)-Primer basierten Bibliothek-Konstruktion in der Standard-Protokoll Illumina abgeholt und somit wird es nicht zu stromabwärts issWerte mit ausdrücklicher mRNA-Transkript Ebenen. Die Quantifizierung der Ausgangs-RNA unter Verwendung regulärer spektrophotometrische Messungen sollte ausreichend sein, und es gibt keine Notwendigkeit, eine hochgenaue quantitativer Verfahren wie RiboGreen zu verwenden, da die Bibliotheken wird genau nach Vorbereitung durch qPCR und Genexpressionsniveaus quantifiziert werden relativ zu der Gesamtzahl von normalisiert liest während der Datenanalyse Schritte.
Bibliothek Quantifizierung. Genaue Quantifizierung der Bibliotheken ist entscheidend für die entsprechende Erzeugung von Clustern. Nur DNA-Moleküle mit erfolgreich ligiert Adaptern bilden Cluster. Spektrophotometrische Messungen werden nicht unterschieden zwischen DNA und DNA mit Adaptern ohne, welche in einer Überschätzung der Konzentration der Bibliothek führen und letztlich zu einer Unter-Clustering der Flußzelle führen. Die Menge an DNA, ohne ligierten Adapter werden von Bibliothek zu Bibliothek unterscheiden, selbst wenn die gleichen RNA als Startseite verwendet wurdeterial, so kann man nicht genau davon ausgehen, dass ein Standard-Prozentsatz der spektrophotometrischen Lesen DNA mit ligierten Adaptern. Durchführen qPCR mit Primern, die spezifisch an den Adaptern nur jene DNA-Moleküle mit Adaptern erfolgreich an beiden Enden des Moleküls ligiert detektieren. Dies ermöglicht eine absolute Quantifizierung der Bibliotheken und im Gegenzug eine genaue Cluster-Dichte. Beurteilung der Bibliotheken mit einem Instrument oder einer Experion Bioanalyzer ist ebenfalls wichtig. Dies ermöglicht eine Visualisierung der Größenbereich der Bibliothek, was wichtig ist, während der Datenanalyse Schritte, und stellt sicher, dass es keine Kontamination, die mit Cluster Generation stören könnten.
Datenanalyse. In diesem Protokoll angewendet wir TopHat auszurichten RNA-seq liest die menschliche Bezugnahme Transkriptom und Manschettenknöpfe zu Transkripten zusammenzubauen, schätzen ihren Häufigkeiten und Test für differentielle Expression in Thrombin behandelten HMVEC-LBL Zellen. TopHat und Manschettenknöpfe sind two beliebte Tools, und sie sind kostenlos, Open-Source-Software 11. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass Manschettenknöpfe eine hohe Sensitivität und Spezifität waren beim Nachweis von zuvor kommentierten Introns 12. Allerdings haben TopHat und Manschettenknöpfe nicht auf alle Anwendungen der RNA-seq noch sind sie die einzigen Werkzeuge zur RNA-seq-Analyse 11. TopHat und Manschettenknöpfe erfordern eine sequenzierte Referenz Transkriptom oder Genom. Sie sind besonders geeignet für die Analyse von RNA-seq Daten von entweder Illumina oder festen Sequenziermaschinen aber nicht 454 oder dem klassischen Kapillarelektrophorese Sequenzierungsplattform erzeugt. Benutzer, die ohne sequenziert Referenz-Genom kann Betracht ziehen, de novo Transkriptom Montage mittels eines von mehreren Instrumenten, wie Trinity ( http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), Trans-Abyss ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) oder Oasen ( http://www.ebi.ac.uk/ ~ zerbino / Oasen / ). Viele alternative Transkriptom-Analyse-Programme jetzt existieren. Für eine Übersicht der verschiedenen Programme, darf der Leser möchten die Studie von Garber et al lesen. 13 und die Überprüfung von Martin und Wang 14, die die komparativen Vorteile und Nachteile und die theoretischen Überlegungen der meisten aktuell und häufig verwendete Programme zu beschreiben. Die Wahl der Transkriptom-Analyse-Strategien (Referenz-basierte Strategie, de novo Strategie und kombinierte Strategie) und Programme hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der Existenz oder Vollständigkeit der Referenz-Genoms, die Verfügbarkeit von Sequenzierung und Computing-Ressourcen, die Art des Datensatzes generiert und, am wichtigsten, das übergeordnete Ziel der Sequenzierung Projekt 14.
Ein weiterer Punkt gemacht werden sollte: computer Programme für die Transkriptom-Analyse möglicherweise nicht zu 100% Genauigkeit aller transcript Berichterstattung. Sequenzierung Fehler ist ein weiteres Anliegen. Es ist ratsam, dass eine differentiell exprimierte RNA Transkripts durch-seq identifiziert durch Echtzeit-PCR bestätigt werden. TaqMan-Sonde-basierte Chemie gilt als der Goldstandard für die real time PCR. Außerdem sollten neu identifizierten Transkripte durch die Sanger-Methode der DNA-Sequenzierung vor jeder weiteren Experimente validiert werden.
Fehlerbehebung
Bibliothek Zubereitung: Ein Abstrich von hohem Molekulargewicht genomische DNA, nachdem die Bibliothek Vorbereitungsschritte durch verursacht werden könnten ein Übertrag von der letzten Perle Reinigungsschritt in der Bibliothek Vorbereitung. Rücksendung der Bibliotheken auf den magnetischen Standfuß für volle fünf Minuten kann das Problem beheben. Wenn nicht, kann das Problem aus der unvollständigen Fragmentierung der RNA während der ersten Schritte der Bibliothek Vorbereitung einzudämmen. Dies kann auftreten, wenn low-Qualität RNA verwendet wird oder wenn das Protokoll nicht genau befolgt. Beispielsweise Änderung der Inkubationszeiten oder Temperatur, Zugabe von Reagenzien in der falschen Reihenfolge oder Pause zwischen Fragmentierung und die Synthese des ersten Stranges der cDNA. Wenn wir wieder die Bibliotheken mit dem Magnetfuß nicht entfernt die hohe MW DNA, ist es ratsam, die Bibliothek der Zubereitung mit frischen RNA-Proben zu wiederholen.
Geringer Intensität: Wenn der erste Zyklus Intensität geringer als erwartet, ist es möglich, dass die Primer nicht zu den Clustern ordnungsgemäß hybridisieren im letzten Schritt der Cluster Generation oder die Durchflußzelle wurde zu lange zwischen Clustering und dem Beginn der Sequenzierung gespeicherten laufen. In diesem Fall sollte ein Primer Rehybridisierung unter Verwendung eines Primer Kit von rehyb Illumina werden. In den meisten Fällen löst dies rehyb die Intensität Fragen und der Lauf kann über ohne Probleme gestartet werden. Wenn nach einer rehyb, die Intensitäten sind noch niedrig ist, kann das Problem seinmit den Bibliotheken oder die Reihenfolge durch Synthese (SBS) Reagenzien und Illumina technischen Dienst sollte für die weitere Fehlersuche kontaktiert werden. Wenn die erste Lese die Intensitäten sind gut, aber die Intensitäten sind niedrig, nachdem turn around, kann ein Primer rehyb der zweiten Lese-Primer notwendig sein. Dies basiert auf der Sequenzierung Instrument und Illumina technischen Dienst sollte für das Verfahren kontaktiert werden durchgeführt.
Hohe Phasing / prephasing: Wenn höher als normal Phasing oder prephasing beobachtet wird, ist eine mögliche Ursache der Kontamination der anderen SBS Reagenzien mit Spaltung Puffer. Während der SBS Schritte zur Vorbereitung, ist es wichtig zu handhaben die Spaltung Puffer letzte und die Handschuhe wechseln, zwischen dem Umgang mit der Spaltung Puffer und andere Reagenzien. Wenn Spaltungspuffer Kontamination vermutet wird, sollte eine Grundierung rehyb der Durchflusszelle durchgeführt werden und neue SBS Reagenzien vorbereitet werden. Alternativ könnte es Kontamination in den Leitungen der inst RUMENT. Wenn dies vermutet wird, sollte das Gerät eine Wartung Waschung (a Wasser durch eine NaOH Waschung gefolgt waschen, gefolgt von einer abschließenden Wasserspülung) unterziehen sollte ein Primer rehyb auf der Flußzelle durchgeführt werden und neue SBS Reagenzien hergestellt werden. Wenn die Phasing / prephasing Werte mäßig hohen (~ 0,5) sind, kann der Lauf fortgesetzt, bis die Q30 Noten und Clustern vorbei Filters berechnet werden. Diese Werte können noch in akzeptablen Grenzen auch bei hohen Phasing und / oder prephasing sein.
Generalisierbarkeit dieses Protokolls
Während es spezifisch für die Illumina HiScanSQ ist, ist dieses Protokoll für jede der HiSeq Familie oder die Genome Analyzer II Illumina Instrumente ( www.illumina.com ) mit geringfügigen Modifikationen der Cluster Generation Schritte und Sequenzierung Reagenzien. Andere nächsten Generation DNA-Sequenzierung Plattformen wie dem SOLiD-Serie ("_blank"> Www.lifetechnologies.com) und der GS-Systeme ( www.454.com sind) sowie einige aufstrebende neuere Systeme auch für die Zwecke der RNA-seq 11 eingesetzt. Obwohl ihre Bibliothek Bau und Sequenzierung Verfahren etwas unterschiedlich sein, die RNA Handhabung Tipps, die Datenanalyse Portionen (hinter den Casava Schritte) und die Validierung mittels RT-PCR in diesem Protokoll vorgestellt kann Referenzwert um ihre RNA-seq Anwendungen .
Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass dieses Protokoll spezifisch für RNA-seq ist zu einem Zeitpunkt von Thrombin behandelte HMVEC-LBL-Zellen, aber es kann leicht zu einer Multi-Zeitpunkt Studie oder Studien in anderen Zellen angepasst sein, Geweben behandelt mit verschiedene Stimuli oder Inhibitoren oder Vergleiche der Transkriptomen in Zellen oder Geweben zwischen einem gesunden Zustand und einem Krankheitszustand.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Stephen Kingsmore und die Kinderradiologie Genome Medicine Center im Kinderkrankenhaus Mercy Krankenhäuser und Kliniken danken für die Nutzung ihrer Computing-Cluster für unsere Datenanalyse, Illumina Außendienst (Elizabeth Boyer, Scott Cook und Mark Cook) und technische Berater-Team für die schnellen Antworten und Anregungen auf dem Lauf der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Instrument, HiScanSQ und Datenqualität Analyse. Diese Arbeit wurde zum Teil von den National Institutes of Health Grants HL080042 (um SQY) unterstützt und Start-up-Fonds und Ausstattung der Kinder Mercy Krankenhäuser und Kliniken, University of Missouri in Kansas City (auf SQY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine - Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. | |||
References
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- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
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