Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

Published: February 13, 2013 doi: 10.3791/4393
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

Summary

פרוטוקול זה מציג הליך מלא ומפורט להחלת RNA-seq, טכנולוגיית דור הבא DNA עצמת רצף, לtranscriptomes פרופיל בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה הוא להכליל לתאים או רקמות שונים שנפגעו על ידי חומרים כימיים שונים או במחלות.

Abstract

האפיון של ביטוי גנים בתאים באמצעות מדידת רמות ה-mRNA הוא כלי שימושי בקביעה כמה מכונות התעתיק של התא מושפעות מאותות חיצוניים (לדוגמה: טיפול תרופתי), או כמה תאים שונים בין מצב בריא ומצב חולה. עם כניסתו ועידון מתמיד של טכנולוגיית רצפי DNA של הדור הבא, RNA-רצף (RNA-seq) הפך שיטה פופולרית יותר ויותר של ניתוח transcriptome לקטלג את כל המינים של תמלילים, כדי לקבוע את מבנה התעתיק של כל הגנים הביעו ולכמת הרמות המשתנות הביטוי של המערך הכולל של תמלילים בניתן 1,2 תא, רקמה או אורגניזם. RNA-seq הדרגה מחליף מערכי DNA כשיטה מועדפת לניתוח transcriptome כי יש לו את היתרונות של אפיון transcriptome מלא, ומספק נתון סוג דיגיטלי (מספר העתק של כל פרוטוקול) ולא להסתמך על כל sequen הגנומי ידוע3 לספירה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מלא ומפורט כדי להחיל RNA-seq לtranscriptomes פרופיל בתאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה מבוסס על המחקר שפורסם לאחרונה תחת הכותרת שלנו "RNA-seq חושף transcriptome רומן של גנים וisoforms בתאי כלי דם ריאתי אדם שטופלו באנדותל טרומבין," 4 שבבצענו ניתוח transcriptome המלא הראשון של תאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל בהצלחה טופל בתרומבין באמצעות RNA-seq. הוא הניב משאבים חסרי תקדים לניסויים נוספים כדי לקבל תובנה לתוך מנגנונים מולקולריים שבבסיס תפקוד האנדותל תרומבין בתיווך בפתוגנזה של מצבים דלקתיים, סרטן, סוכרת, ומחלת לב כלילית, ומספק לידים חדשים פוטנציאליים למטרות טיפוליות למחלות אלה.

טקסט התיאורים של פרוטוקול זההוא מחולק לארבעה חלקים. החלק הראשון מתאר את הטיפול בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם תרומבין ו-RNA בידוד, איכות ניתוח וכימות. החלק השני מתאר את בניית ספרייה וסדר. החלק השלישי מתאר את ניתוח הנתונים. החלק הרביעי מתאר assay אימות RT-PCR. תוצאות מייצגות של כמה צעדים מרכזיים מוצגות. טיפים או אזהרות שימושיים כדי לשפר את ההצלחה בשלבים עיקריים מובאים בסעיף הדיון. למרות שפרוטוקול זה משתמש בתאי אנדותל כלי דם ריאתי אדם שטופלו בתרומבין, זה יכול להיות כללי לtranscriptomes הפרופיל בשני תאי יונקים ושאינם יונקים וברקמות שטופלו בגירויים שונים או מעכבים, או להשוואת transcriptomes בתאים או רקמות בין מצב בריא ומצב של מחלה.

Protocol

תרשים זרימה מתאר פרוטוקול זה מוצג באיור 1.

1. טיפול בתאים עם טרומבין, RNA בידוד, הערכת איכות וכימות של RNA

  1. תאי תרבות אנושי ריאות כלי דם (אנדותל HMVEC-LBL) למפגש 90-100% בצלחות 6-גם במדיום EGM-2 עם 5% FBS, גורמי גדילה ואנטיביוטיקה (Lonza, חתול # CC-3202).
  2. שינוי תקשורת לתקשורת הרעבה (0% FBS) 30 דקות לפני הטיפול עם תרומבין.
  3. פנק את התאים עם 0.05 U / ml תרומבין או להשאיר מטופל כשלט עבור 6 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
  4. בודד RNA כלל מהתאים שטופלו ושליטה באמצעות Ambion מיר נה הערכה לפי הוראות היצרן.
  5. להעריך את איכות RNA עם שבב RNA האיקריוטים StdSense Experion פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת אלקטרופורזה האוטומטית Experion (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
  6. לכמת את RNA באמצעות שיטת spectrophotometric סטנדרטית.

2. בניית הספרייה ורצף

  1. השתמש מיקרוגרם 1 של RNA באיכות הגבוהה הכולל לדוגמה כחומר מוצא.
  2. כדי לבנות את הספרייה, בצע את ההליך הסטנדרטי מIllumina (פרוטוקול # 15008136 כומר). בפרוטוקול זה, שני סיבובים של פולי () בחירות mRNA מכילים מבוצעים כדי להסיר rRNA כדי למזער את רצפי rRNA.
  3. להעריך את איכות הספריות באמצעות שבב ה-DNA 1K Experion פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת אלקטרופורזה האוטומטית Experion (www.bio-rad.com).
  4. לכמת את הספרייה באמצעות qPCR: השתמש בספרייה שבעבר כבר רצף כעקומה ופריימרים ספציפיים למתאמי הגבעול סטנדרטי. השתמש במגוון של דילולים של ספריות לא הידועות (כלומר 1:100, 1:500 ו1:1,000). הפעל qPCR עכוrding לפרוטוקול MM SyberGreen ולחשב את ריכוז המנייה המקורית של כל ספרייה.
  5. לדלל את המניות לספריית 10 ננומטר ולאחסן ב -20 ° C עד מוכן לאשכול תא זרימה.
  6. כאשר מוכן לאשכול תא זרימה, להפשיר את הצלחת מגיבה CBOT באמבט מים. CBOT הוא מכשיר Illumina משמש כדי לייעל את תהליך יצירת האשכול.
  7. שטוף את מכשיר CBOT.
  8. לפגל ספריות: שלב 13 מיקרומטר ספריית 6 μl 10 1x TE μl ו, לצדו של הצינור, להוסיף 1 μl 1 N NaOH (המסופק על ידי Illumina). מערבולת, ספין למטה, דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולמקם את הספריות המפוגלות על קרח.
  9. לדלל את הספריות: לדלל את הספריות המפוגלות עם חיץ הכלאה מראש מצונן (HT1, המסופק על ידי Illumina) על ידי שילוב HT1 ו4 ספריית μl מפוגלת μl 996 לריכוז סופי של 12 PM. הנח את הספריות מפוגלות ומדוללות על קרח.
  10. הפוך כל שורה של צינורות של צלחת CBOT,להבטיח כי כל ריאגנטים מופשרים. הספין למטה הצלחת, להסיר / לנקב את חותמות רדידים ולהעמיס CBOT.
  11. 120 μl aliquot של ספריות המדוללות, המפוגלות לצינור רצועה, שכותרתו 1-8. הוסף 1.2 ספריית μl מדוללת, מפוגלת PhiX שליטה (מIllumina) לכל צינור כמחודד בשליטה. מערבולת וספין למטה את הצינורות ולטעון אותם על CBOT בכיוון הנכון (צינור # 1 בצד ימין).
  12. טען תא זרימה וסעפת על CBOT.
  13. השלם את הזרימה לבדוק ולהתחיל לרוץ באשכולות.
  14. לאחר הריצה תושלם, לבדוק משלוח מגיב בכל הנתיבים. שים לב לתופעות חריגות. גם להתחיל לרוץ רצף מייד או לאחסן את תא הזרימה בצינור ספק ב 4 ° C.
  15. הפשר את כל סידור אחר הסינתזה (SBS, Illumina) ריאגנטים.
  16. טען את ריאגנטים למקומות המתאימים במגשים המגיבים, כדי לוודא שלא לגעת בחומרים הכימיים האחרים לאחר שנגע תמהיל המחשוף.
  17. שימוש לאתא n-רצף זרימה (כלומר אחד שמיצה בעבר), ממשלת הקווים המגיבים פעמים.
  18. לנקות ביסודיות את תא רצף זרימה עם EtOH 70% וKimwipes, ואחרי EtOH 70% ונייר עדשה. בדוק את תא זרימה לכל פסים. מחדש לנקות אותו במידת צורך.
  19. טען את תא הזרימה על הרצף ולבצע זרימה לבדוק כדי להבטיח שחותם בין הסעפות ותא הזרימה הוא הדוק.
  20. התחל לרוץ רצף.
  21. להעריך את מדדי האיכות (לדוגמה, צפיפות האשכול, אשכולות שעברו סינון, Q30, עצמה) כפי שהם מתפרסמים בזמן הריצה.
  22. לפקח עצמה לאורך הריצה.
  23. אחרי 101 מחזורי הסקרים, לבצע תפנית כימיה כדי להשלים את 2 קראו: הפשר את ריאגנטים הקצה לזווג והצפת התאגדות הקריאה השנייה (ICB, מרכיב של ריאגנטים SBS, Illumina) ולטעון את החומרים כימיים.
  24. המשך ריצת הרצף, הערכת 2 nd לקרוא עצמה, Q30מדדים אחרים nd איכות כמו התקדמות הריצה.

3. ניתוח נתונים

  1. השתמש בגרסה העדכנית ביותר של CASAVA (Illumina, כרגע 1.8.2) כדי להמיר את קבצי הבסיס (הטלפוניים. BCL) קבצים לקבצים. Fastq, הגדרת fastq-אשכול ספירה ל 0 כדי להבטיח יצירת קובץ fastq יחיד עבור כל דגימה . לפתוח את קבצי fastq לניתוח במורד זרם.
  2. לבצע יישור הסוף לזווג שימוש בגרסות האחרונות של TopHat (1.4.1) 5, שמיישרת RNA-seq קורא לגנומים של יונקים בגודל באמצעות אולטרה aligner התפוקה גבוהה הקצר הקריאה (BOWTIE, 0.12.7) 6 וSAMtools (0.1. 17) 7. SAMtools מיישם כלי עזר שונים למערכים לאחר עיבוד בפורמט SAM. Transcriptome אנושי ההתייחסות ניתן להוריד מiGenomes (www.illumina.com). בריצת TopHat והשתמשנו בכל הגדרות ברירת המחדל של הפרמטרים כוללים אפשרות סוג הספרייה כfr-unstranded (ברירת מחדל).
  3. לנוing CuffDiff התכנית, חלק מחפת (1.3.0) חבילת תוכנה 8, להשוות את תאי תרומבין שטופל לתאי הבקרה לסנן את תמלילי הגנים מתבטאים באופן דיפרנציאלי בעבר על בסיס transcriptome ההתייחסות האנושית. השוואה זו מזהה את ביטוי ההפרש של תמלילים ידועים. השתמש ב-Microsoft Excel מציג את התוצאה בצורת טבלה. בהפעלת תכנית חפת והשתמשנו בכל הגדרות ברירת המחדל של הפרמטרים. אלה תעתיקי גנים עם FPKM <0.05 ו-p> 0.05 מסוננים החוצה.
  4. כדי לזהות isoforms רומן, לרוץ בלי חפת transcriptome הפניה. השווה את קבצי תמליל הדוגמא להתייחסות הגנום באמצעות Cuffcompare ולבדוק את ביטוי ההפרש עם Cuffdiff באמצעות קבצי תמליל תרומבין המשולבים כהגנום התייחסות לניתוח אחד ואת קבצי תמליל בקרה המשולבות כהגנום התייחסות לניתוח שני. השתמש ב-Microsoft Excel מציג את התוצאה בתבנית טבלאית. שוב, thosתעתיקי גני E עם FPKM <0.05 ו-p> 0.05 מסוננים החוצה. לאחר שלב זה, חוקרים יכולים לבחור כדי להעלות רשימה של תמלילים שדווחו לאחרונה לאתר UCSC הגנום הדפדפן (http://genome.ucsc.edu/) כדי לאמת את תוקפם על ידי בדיקה ידנית.
  5. שלח רשימות של גנים הביעו באופן דיפרנציאלי לניתוח נתיב שנינות (IPA, www.ingenuity.com) לאפיון של הגנים והשבילים המושפעים מטיפול תרומבין. בשלב זה, חוקרים יכולים לבחור להשתמש באבנט (http://compbio.mit.edu/cummeRbund/), חבילת R אשר נועדה לסייע ולפשט את המשימה של ניתוח חפת פלט RNA-seq, כדי לסייע בניהול, לדמיין ולשלב את כל נתונים המיוצרים על ידי ניתוח Cuffdiff.

4. אימות של תוצאות RNA-seq ידי בזמן אמת-פו כמוניתגובת שרשרת lymerase (qRT-PCR)

  1. לבצע בידוד RNA מוחלט משליטה ותאי תרומבין טופל HMVEC-LBL, RNA איכות הערכה וכימות רנ"א תאר בצעדים 1.4-1.6.
  2. לייצר דנ"א משלים מ1 RNA מיקרוגרם הכולל של כל דגימה עם ערכות עיליות III ראשון גדיל סינתזת מערכת RT, בעקבות הוראות היצרן (Invitrogen, 18080-051).
  3. ביצוע ניתוח qRT-PCR על מערכת Applied Biosystems ViiA 7 Real-Time PCR באמצעות TaqMan oligonucleotides נועד Assay על פי דרישה לגילוי CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor גורם הקשור 1 (TRAF1, Hs01090170_m1), וβ-יקטין (ACTB, Hs99999903_m1). כל דגימה הייתה תבנית שווה ערך ל 5 ננוגרם של רנ"א בסך הכל. למדוד לכמת בשיטת DDCt ולנרמל לβ-תקטין. כל assay בוצע על פני לפחות שלוש ביולוגיים משכפל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עבור שלב 1: -28: יחס 18s משמש באופן מסורתי כאינדיקציה לפירוק רנ"א. באופן אידיאלי, -28 השיא צריך להיות בערך פי שניים מהשטח של להקת 18s (יחס של 2), אולם יחס אידיאלי זה הוא לעתים קרובות לא ראה בפועל. יתר על כן, יחסים -28: 18S המתקבלים משיטות spectrophotometric יכולים לזלזל בסכום של השפלה של רנ"א. באופן מדויק יותר כדי לכמת את ההשפלה, ולכן האיכות של מדגם RNA, המערכת מחשבת Experion איכות מחוון מספר רנ"א (RQI). אלגוריתם RQI משווה electropherogram של דגימות RNA לנתונים מסדרה של דגימות RNA סטנדרטיות, מושפלות ויחזור באופן אוטומטי מספר בין 10 (RNA השלם) ו1 (RNA המושפל). איכות רנ"א צריכה RQI של לפחות 7, באופן אידיאלי יותר מאשר 8. תרשים 2 מציג את תוצאות Experion באמצעות מדגם RNA באיכות גבוהה עם RQI של 8.4.

עבורשלב 2: הספריות צריכות פס רחב בקצב של כ 250-300 נ"ב איור 3 מציג תוצאות Experion של ספרייה איכותית איור 4 מראה את התוצאות של דגימות qPCR עקומת סטנדרט ומדגם לא ידוע (המוצגת בכחול כהה)... ההתקדמות והאיכות של ריצת הרצף יש להקפיד כל זמן לאורך כל ריצת איור 5 מראה צפיפות אשכול מתאימה במהלך צעד הדמית המחזור הראשון;. זה הסימן הראשון של איכות הריצה. אשכולות צריכים להיות בהירים וממוקדים. איור 6 מציג את דוח הבסיס הראשון שנוצר לאחר המחזור הראשון הושלם. זה חשוב כדי להעריך את הצפיפות המוערכת אשכול, רמות של עצמה, איכות והתמקדות בנקודה זו. המחסום הבא איכות, אחרי המחזור 4, מוצג באיור 7. זה מציג את צפיפות האשכול המוחלטת לכל מסלול. צפיפות האשכול לא צריכה להיות מעל 850 k / 2 מ"מ. לאחר המחזור 13,phasing (כאשר בסיס הוא לא הוסיף במהלך מחזור) וprephasing (כאשר בסיסי 2 נוספים במהלך מחזור) סטטיסטיקה מחושבת, כפי שמוצגת באיור 8. מספרים אופייניים הם בין 0.1 לבין 0.25. הערכת האיכות העיקרית היא אפשרית אחרי 24 מחזור, כאשר מספר מדדי איכות מחושבים. אחוזים מקורא מעל Q30, מוצגים באיור 9, הוא מידה של הביטחון בייעוד הבסיס. קריאה עם ציון של 30 ש אומרת שיש 1 ב1000 סיכוי ששיחת הבסיס הוא שגויה. ציוני Q יקטנו עם התקדמות הריצה, אבל צריך להתחיל עם יותר מ 95% מקורא פגישה או העולה על Q30. האשכולות שעברו סינון (PF), המוצגים באיור 10, הם מאשכולות שינקטו את רצף הנתונים בפועל. באופן אידיאלי, זה צריך להיות מעל 85%. PF האשכול מבוסס על גורמים רבים, כולל, עוצמת phasing prephasing וQ30. זה לא ישנה עם התקדמות הריצה. האחוזים מיושרים (

עבור שלב 3: לוח 1 מציג גנים וisoforms בבקרה והן בתאים שטופלו תרומבין-אדם ריאות כלי דם אנדותל הביע. יש לציין, יש כ 26000 isoforms הרומן התגלה, הממחיש את כוחו של RNA-seq-RNAs הוא יכול לזהות לא ידוע, תרשומות שחבור חלופי ושימוש אמרגן חלופי אשר לא ניתן לגילוי על ידי טכניקות microarray 3. RNA-seq ניתן גם למדוד את התמלילים פחות שפע הלכמת לא מדויק או לא זוהו על ידי microarrays. איור 12 וdifferentiall תצוגת הטבלה 2y הביע גנים במסלול איתות תרומבין. זוהי דוגמה של ניתוח הדור השלישי ידע בסיס מונחה מסלול 9: גישות המבוססות על הטופולוגיה של מסלול, תוך שימוש בתוכנת ניתוח נתיב שנינות. זה מראה שטיפול 6 שעות תרומבין באופן משמעותי את-מסדיר סעיף הקולט תרומבין 4 ומטה מסדיר-Par הקולט תרומבין 3 זמן שאין שינוי בביטוי של הקולטן תרומבין סעיף 1. ביטוי של NFkB1, NF kB2 וSrc הם גם משמעותי מוסדר למעלה. חלק מהגנים משפחתיים Rho (Rho B, C, F ו-G) הוא מוסדר, בזמן שאחרים (רו J, Q, T1, U ו-V) הם למטה מוסדרים (לוח 4). גן מיוזין אור שרשרת 9 (MYL9) הוא מוסדר מעלה תוך MYL12B הוא מוסדר כלפי מטה. ביטוי של גנים אחרים הוא למטה מוסדר או שאינה מושפע.

עבור שלב 4: כדי לאמת את תוצאות RNA-seq באמצעות גישה חלופית, בצעו ניסוי qRT-PCR לשלושה diffe assayגני שכירות (איור 13). ב-RNA-seq נתונים, TRAF1 היה מעלה מוסדר על ידי 7.96 לקפל; CELF1 היה מוסדר על ידי-1.16 לקפל; וFANCD2 היה למטה מוסדר על ידי-1.70 קיפול. בנתוני qRT-PCR, מספרים המתאימים אלה הם 7.25, -1.15 קיפול קפל וקפל -2.07, בהתאמה. התוצאות של שלושה גנים אלו assayed ידי RNA-seq וqRT-PCR הן בהסכם טוב, שמאשש את תוצאות RNA-seq.

גנים
לשלוט תרומבין
סכו כל גנים מבוטאים 16636 16357
בקרה בלבד 783
תרומבין רק 504
עד מוסדר (פרש 2 מתקפל או יותר) 152
למטה מוסדרים-(פי 2 או gהבדל reater) 2190
Isoforms הידוע
לשלוט תרומבין
Isoforms המוכר הסך הביע 26807 26300
בקרה בלבד 1492
תרומבין רק 985
עד מוסדר (פרש 2 מתקפל או יותר) 480
למטה מוסדר (פרש 2 מתקפל או יותר) 3574
Isoforms רומן
לשלוט תרומבין
Isoforms רומן הסך הביע 25880 25886
בקרה בלבד 418
תרומבין רק 424
עד מוסדר (פרש 2 מתקפל או יותר) 1775
למטה מוסדר (פרש 2 מתקפל או יותר) 12202

טבלת 1. * גן / איזופורם ביטוי סיכום. טבלה זו מפרטת גנים, isoforms הידוע וisoforms רומן לידי ביטוי בשליטה ובתאים שטופלו תרומבין-HMVEC-LBL. שינוי הקיפול הוא היחס של FragmentsPerKilobase תרומבין של שברי perMillion תמליל מופו (FPKM) לשלוט FPKM. הגנים האלה, isoforms הידוע וisoforms רומן עם הבדל 2 מתקפל או גדול יותר בין שתי קבוצות יש רמות ביטוי סטטיסטי שונות (כפי שנקבע לאחר תיקון Benjamini-הוכברג). * טבלה זו מובאת מטבלת 2 בעיון 4.

rder = "1">
גנים למטה מוסדרים
סמל גן שינוי כולל פולד חברים שינוי פולד פרט q_value ** FPKM בקרה FPKM טרומבין
PLC -2.49
PLCB1 -2.97 0 6.75585 2.27611
PLCB2 -1.32 0.00183634 1.80892 1.36957
PLCB4 -10.04 6.28386E-14 0.682668 0.0679837
PLCL1 -2.53 5.26728E-09 0.602879 0.238017
Gaq -1.87
GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996
גיא -1.56
GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795
GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198
PKC -2.15
PRKCE -1.65 0 9.36364 5.67305
PRKCI -2.14 0 6.63566 3.09818
PRKD3 -2.61 0 16.0215 6.12878
IP3R -2.60
ITPR1 -1.39 .000018734 1.51592 1.09009
ITPR2 -3.19 0 7.23283 2.26944
CREB -2.36
CREB1 -2.36 0 5.19117 2.2004
Gata -2.33
GATA3 -2.33 0.0228108 0.716773 0.307131
TBP -1.35
TBP -1.35 2.66E-05 8.48689 6.30476
G-חלבון אלפא -1.64
GNA14 -1.49 .000122496 2.78076 1.86573
GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795
GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198
GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996
PAR3 -1.87
F2RL2 -1.87 1.02474E-06 1.51286 0.810286
SOS1
SOS1 -2.27 0 8.94353 3.94679
ראס -1.69
KRAS -2.03 0 11.2766 5.5659
NRAS -1.61 0 38.0874 23.6491
AKT -1.77
AKT3 -1.77 0 15.8228 8.94223
MLCP -2.38
PPP1CB -2.10 0 39.585 18.8199
PPP1R12A -3.56 0 15.2274 4.27516
PPP1R12B -2.66 5.28466E-13 1.92123 0.722188
FAK -1.31
PTK2 -1.31 4.3856E-10 39.7935 30.3044
p70 S6K
RPS6KB1 -1.99 0 8.46312
רוק -3.68
ROCK1 -3.54 0 19.5921 5.53112
ROCK2 -3.86 0 16.0054 4.14759
CAMK -1.17
CAMK1 1.30 .000255587 7.90794 10.296
CAMK2D -1.74 2.22911E-12 11.4497 6.56804
CAMK4 -2.58 .000619045 .62714 0.243277
גנים מווסתים ב
סמל שינוי כולל פולד חברים שינוי פולד פרט q_value ** FPKM בקרה FPKM טרומבין
PAR4 1.59
F2RL3 1.59 9.19043E-13 4.99867 7.9253
Src 1.47
Src 1.47 0 14.1085 20.675
NF-kB 1.65
NFKB1 1.66 0 19.5113 32.3457
NFKB2 2.02 0 28.7563 58.1293
רלה 1.45 0 55.3482 80.28
גני Down-מוסדר Up-/Partial חלקיים
סמל שינוי כולל פולד חברים שינוי פולד פרט q_value ** FPKM בקרה FPKM טרומבין
gam-G-חלבוןאמא 1.22
GNG10 -1.34 2.17216E-08 27.192 20.2206
GNG11 1.31 5.66209E-05 770.922 1011.05
GNG12 -1.44 5.11591E-13 112.397 78.3023
GNG2 2.43 6.38453E-09 0.465705 1.13132
הבטא G-חלבון 1.27
GNB2 1.36 1.91268E-10 137.786 187.43
GNB3 -2.69 4.71259E-11 2.58703 0.962504
GNB4 -1.61 0 15.8275 9.85484
Rho GEF -1.16
ARHGEF12 -1.67 0 30.6424 18.3015
ARHGEF2 1.33 5.80478E-08 27.6288 36.758
ARHGEF3 -1.48 0 20.3279 13.7813
ARHGEF6 -2.08 0 2.67944 1.28635
ARHGEF9 -1.54 0.00469498 1.56367 1.0159
PI3K -1.80
כספומט -6.84 0 4.98972 0.729483
PIK3C2A -5.09 0 17.7894 3.49234
PIK3C3 -1.49 4.66294E-15 12.6504 8.50852
PIK3CA -3.14 0 16.8398 5.36228
PIK3CB -1.36 8.4357E-09 9.68516 7.12129
PIK3CD 1.86 0 5.6579 10.5507
PIK3CG -1.76 2.32945E-10 1.86962 1.06419
PIK3R1 -1.79 0 5.48118 3.06256
PIK3R3 -1.59 1.50915E-05 5.24549 3.30763
PIK3R4 -1.40 7.18425E-12 8.34176 5.97942
רו 1.19
RHOB 1.31 9.48429E-06 232.232 304.587
RHOC 1.38 458.267 630.235
RHOF 1.65 0 8.29676 13.7268
RHOG 1.40 1.02141E-14 58.6003 82.0172
RHOJ -1.57 0 127.446 80.9317
RHOQ -1.52 0 16.4802 10.8122
RHOT1 -1.96 3.00071E-12 8.48834 4.33755
RHOU -1.54 0.00184367 0.900141 0.586092
RHOV -3.32 0.0056467 1 0.413912 0.124591
RND3 -1.95 0 58.0564 29.7075
MLC -1.06
MYL12B -1.43 4.87832E-11 872.075 608.472
MYL9 1.48 0 202.636 299.559

טבלה 2. גנים מתבטאים באופן דיפרנציאלי וisoforms במסלול איתות טרומבין *. *, טבלה זו מובאת מS4 הטבלה בעיון 4 עם שינוי קטן. **, Q-ערך, שיעור גילוי כוזב יותאם p-value.

93/4393fig1.jpg "alt =" איור 1 "/>
איור 1. תרשים זרימה של הפרוטוקול לאפיון RNA-seq של transcriptome תרומבין בתיווך בתאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל. ראשית, טיפול בתאים ולבודד ולכמת רנ"א. הכן את הספריות מRNA באיכות גבוהה ולהעריך הריכוז שלהם (באמצעות qPCR) ואיכות (באמצעות bioanalyzer), ואז האשכול בתא זרימה. התחל לרוץ רצף ולנתח את האיכות של הריצה לאורך כל הדרך. המחסומים העיקריים הם באיכות מחזורים 1, 4, 13 ו 24. שימוש CASAVA, להמיר את הקבצים לקבצי Bcl fastq ולאחר מכן ליישר אלו לגנום עם TopHat. זיהוי isoforms הידוע ובלתי ידוע באמצעות חפת ולקבוע ביטוי הפרש עם CuffDiff. הצג את קבצי הפלט ב-Excel ולסנן את הגנים שיש להם רמת ביטוי פחות מ 0.05 FPKM או p-ערך גדול מ 0.05. שלח את הגנים שנותרו לניתוח נתיב שנינות קבלת מידע נוסף אודות הפונקציות של הגנים והמסלולים ffected ידי טיפול תרומבין. בדרך כלל, נבחר קבוצת הגנים הביעו באופן דיפרנציאלי, אומתו על ידי גישה חלופית כגון qRT-PCR.

איור 2
איור 2. מדגם RNA עם נציג RQI של 8.4 כפי שנותחו על ידי תחנת אלקטרופורזה האוטומטית Experion) עקבות הבודדות של RNA באיכות גבוהה -.. ציר X מתאר זמן וציר y מתאר אות הניאון B) תמונת ג'ל הווירטואלית ממדגם RNA באיכות גבוהה. עוצמת -28 השיא היא גדולה יותר משיא 18S ואין זיהום נתפס. שני הלהקות הן חדות ומוגדרים. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

. בתוך עמודים = "תמיד"> איור 3
איור 3. הספרייה באיכות גבוהה מ-RNA המוכנה כפי שנותחה על ידי תחנת אלקטרופורזה האוטומטית Experion שיא רחב בין 250 ל 300 נ"ב הוא זוהה ולא דנ"א משקל מולקולרי גבוה (זיהום DNA) הוא ציין) עקבות הבודדות של ספרייה באיכות גבוהה.. - ציר X מתאר זמן וציר y מתאר אות ניאון B) תמונת ג'ל הווירטואלית של ספרייה באיכות גבוהה. שיא רחב בין 250 ל 300 נ"ב הוא זוהה ולא דנ"א משקל מולקולרי גבוה (זיהום DNA) הוא ציין. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 4
<חזק> איור 4. תוצאות qPCR באמצעות SyberGreen ופריימרים ספציפיים למתאמי גבעול Illumina. ספרייה התקבצה בעבר משמשת כעקומת סטנדרט לקביעת ריכוז האשכולות האופטימלי לספרייה שהוכנה זה עתה. הדילול של הספרייה הידועה נופל בתוך ריכוזי עקומת הסטנדרט. דגימות עקומת הסטנדרט שהואשמו על ידי החיצים והמדגם לא הידוע הוא בצבע כחול כהה וגם צוין על ידי חץ.

איור 5
איור 5. . הצפיפות מתאימה אשכול בצעד הדמית המחזור הראשון האשכולות הן ברורה, ממוקדות ובהירות) מאגר;. ב ') בבסיס C; C) המאגר G; ד) המאגר ט

<td> 19892
מטרי 1 ליין 3 ליין ליין 4 ליין 5 6 ליין 7 ליין ליין 8
צפיפות אשכול (יא / מ"מ 2) 420.94 412.95 410.81 408.54 416.71 416.56 410.02 411.84
עצמה 25870.5 23886 23891.38 23735.83 23949.38 24933.08 24305.79 23950.29
עצמת ג 21559.62 19822.33 19759.33 19472 19954.21 20611.75 19438.29
עצמת G 13619.46 11756.67 11486.44 10498.38 12186.62 12195.5 11826.88 11010.5
עצמת T 19402.67 17663.79 17854.42 17353.75 17545.54 18060.67 18457.92 17397.12
ציון פוקוס 68.2 67.46 67.67 67.75 67.41 67.43 67.63 67.05
ציון פוקוס C 67.93 67.33 67.56 67.66 67.33 67.39 67.46 66.9
ציון פוקוס G 65.4 64.14 63.98 63.92 63.29 63.41 63.47 63.74
ציון T פוקוס 66.45 65.57 65.5 65.49 65.03 65.23 65.57 65.59

איור 6. דוח הבסיס הראשון שנוצר לאחר המחזור הראשון יושלם. צפיפות האשכול (למרות שהמעיט בשלב זה) היא מתאים. העוצמות נראות טובות (10,000-26,000, עם G יש עצמה הנמוכה ביותר). ציוני המיקוד הם גם מתאימים, ולנפול 65-70, למרות שערכים גבוהים יותר הם גם מתאימים.

g7.jpg "alt =" איור 7 "/>
איור 7. צפיפות הצביר חושבה לאחר המחזור 4 צפיפות האשכול היא נמוכה יותר מאשר 850 k / 2 מ"מ ואפילו על פני כל הנתיבים) צורה טבלאית;... ב ') צורת גרף לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 8
איור 8. Phasing (לא מוסיף בסיס במהלך מחזור) וphasing קדם (הוספת שני בסיסים במהלך מחזור). שני הערכים ברמה של 0.25 או מתחת, רמות מתאימות phasing / מראש phasing-המציין. א) phasing וphasing מראש הערכים המספריים . B) ערכי הדרגה בצורת גרף. C) מראש phasing ערכים בצורת גרף. קליק K כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 9
איור 9. הייצוגים השונים של Q30 ציונים לאחר המחזור 24. ציון של 30 ומעלה מצביעים על 1 ב1000 סיכוי ששיחת הבסיס הוא שגויה. בסביבות 90% מניקוד Q הם מעל 30) צורה טבלאית (Q30 ציונים כאן הם מהמכלול של הריצה, דרך המחזור 24);. B) Q30 ציונים של מחזור. כל עמודה מייצגת החלוקה קוראה נופל בQ30 או מעל שלמחזור מסוים. C) Q30 הפצות הציון דרך המחזור 24. חלוקת ציוני Q על בסיס מצטבר במחזור של 24. ניקוד Q הוא על ציר ה-X ומ' כניסות הוא על ציר y. קורא עם Q30 מעל 30 המיוצגים בירוק.oad/4393/4393fig9large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 10
איור 10. הייצוגים השונים של אשכולות אשכולות עוברים סינון. עוברים סינון מתבססים על מספר פרמטרים ובכלל Q30, עצמה וphasing / מראש phasing-. לפחות 85% מהצבירים עוברים סינון בכל מסלול) צורה טבלאית;. ב ') צורת גרף, תיבות כחולות מייצגות את המספר הכולל של אשכולות, תיבות ירוקות מייצגות את האשכולות עוברים מסננים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 11 איור 11. . אחוזים מהאשכולות המיושרים לגנום PhiX כ -0.5% מהצבירים ליישר לגנום PhiX, מתאים לכמות PhiX זנקה לתוך דגימות צורה) טבלאית;.. ב ') צורת גרף לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה .

איור 12
איור 12. הגנים הביעו באופן דיפרנציאלי, על ידי הטיפול של תרומבין HMVEC-LBL במסלול איתות טרומבין. מסלול איתות טרומבין נבנה על ידי שנינות. במסלול, צבע אדום מציין מווסתים בגנים (3 1.3 קיפול) וגנים ירוקים למטה מוסדרים ( בטבלה 2. נתון זה מובא מאיור 4 בעיון 4. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה

איור 13
איור 13. אימות qRT-PCR של שלושה גנים הביעו באופן דיפרנציאלי מHMVEC-LBL נתוני תרומבין טופל-RNA-seq. qRT-PCR בוצע כפי שמתואר בפרוטוקול. שינויים מקפלים נקבעו מערכי Ct היחסיים של assay ביטוי גני TaqMan לCUGBP, Elav כמו בן משפחה 1 (CELF1), פנקוני אנמיה, D2 הקבוצה complementation (FANCD2) ו-TNF factor receptor-associated 1 (TRAF1)הושוו לאלה זוהו על ידי RNA-seq. משכפל (n = 4) לכל מדגם היו לרוץ וערכי Ct ממוצע. כל ערכי Ct היו מנורמלים β-תקטין. ברי השגיאה מייצגים את הטווח של שינוי הקיפול כפי שנקבע על ידי נתוני Assist תוכנה. p <0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית בשינויי קיפול יחסיים בין קבוצת שליטת קבוצת תרומבין-פינוק והן על ידי RNA-seq ומבחני qRT-PCR. רמת ה-mRNA בקבוצות ביקורת בכל assay נקבעה באופן שרירותי כאחד, אשר לא הוצג. *, P <0.05; ** p <0.01. נתון זה מובא מאיור 6 בעיון 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים עיקריים

טיפול RNA: RNases לבזות אפילו את רוב RNA באיכות גבוהה, ולכן יש להקפיד בעת הבידוד, האחסון והשימוש של רנ"א 10. כפפות תמיד שחוקות על מנת למנוע זיהום על ידי RNases שנמצא על ידי אדם. כפפות צריכות להיות שונות לעתים קרובות, במיוחד לאחר עור נוגע, ידיות של דלתות או משטחים נפוצים אחרים. קבוצה של pipettes צריכה להיות מוקדשת אך ורק לעבודת RNA וכל הטיפים וצינורות צריכים להיות RNase חינם. בידוד RNA ומורד יישום צריך להתבצע באזורים נמוכים תנועה שחיטוי באופן שגרתי עם מוצר כגון RNase-Zap. שפלה יכולה לקרות גם עם מחזורים חוזרים ונשנים להקפיא הפשרה. אלה יכולים להיות ממוזערים על ידי aliquoting רנ"א עבור יישומים במורד זרם מייד עם בידוד. לחלופין, cDNA ניתן ליישום במורד זרם כמו qRT-PCR ישירות לאחר בידוד. RNA צריך להיות מאוחסן ב-80 ° C ושמר על קרח בעת השימוש. זה גם שדדגימות RNA ortant יסודיות להפשיר ומערבולת לפני ובמהלך השימוש.

איכות המוצא של RNA היא חיונית להצלחתו של פרוטוקול זה. השתמשו של RNA המושפל או אחר באיכות נמוכה יכול לגרום לספריית ההכנה להיכשל או לגרום לתשואה נמוכה שתהיה מספיק עבור סידור. גם אם ניתן מספיק ספרייה מ-RNA מושפל או באיכות נמוכה, זה לא מייצג נאמן את התמלילים בהווה במדגם, וכתוצאה מהכימות מדויק של ביטוי. כמו כן, כל הדנ"א הגנומי unremoved במהלך בידוד RNA יכול לגרום להערכת יתר של הכמות של RNA בשימוש בפרוטוקול, אבל אם כמות (למשל 1-2 ק"ג) באמצע הטווח הציע (0.1-4 מיקרוגרם) משמש, הסכום בפועל של RNA יהיה מספיק לפרוטוקול. בנוסף, בכל הדנ"א הגנומי אינו צפוי להיות נטל על ידי בניית Oligo (DT) פריימר מבוססת ספרייה בפרוטוקול Illumina הסטנדרטי ובכך זה לא יגרום iss מורד זרםues עם רמות תמליל mRNA לידי ביטוי. כימות של RNA החל באמצעות קריאות spectrophotometric רגילות צריכה להספיק ואין צורך להשתמש בשיטות כמותיות מאוד מדויקות כגון RiboGreen מאז תהיינה לכמת במדויק את הספריות לאחר הכנה ידי qPCR ורמות התבטאות גנים מתנרמלים ביחס למספר הכולל של קורא במהלך שלבי ניתוח הנתונים.

כימות ספרייה. כימות מדויק של הספריות הן חיוניות לדור המתאים של אשכולות. מולקולות דנ"א רק עם מתאמי גבעול הצלחה תהווינה אשכולות. קריאות Spectrophotometric לא להבדיל בין DNA עם מתאמים וללא DNA, שיגרום להערכת יתר של הריכוז של הספרייה וסופו של דבר לגרום לתחת אשכול של תא הזרימה. כמות ה-DNA בלי מתאמי גבעול תהיה שונה מספרייה לספרייה, גם אם אותם RNA שמש להתחילחומר ing, ולכן לא ניתן באופן מדויק להניח שאחוז סטנדרטי של קריאת spectrophotometric הוא DNA עם מתאמי גבעול. ביצוע qPCR עם פריימרים ספציפיים למתאמים יזהה רק מולקולות דנ"א אלה עם מתאמי גבעול בהצלחה לשני הקצוות של המולקולה. זה מאפשר כימות מוחלטת של הספריות ופונה בצפיפות מקבץ מדויקת. הערכה של הספריות במכשיר Experion או bioanalyzer היא גם חשובה. זה מאפשר הדמיה של טווח הגודל של הספרייה, וזה חשוב בשלבי ניתוח הנתונים, ומבטיח שאין זיהום שעלול להפריע לדור אשכול.

ניתוח נתונים. בפרוטוקול זה, אנחנו מוחלים TopHat ליישר RNA-seq קורא לtranscriptome התייחסות האנושי וחפת להרכיב תמלילים, להעריך שכיחותם, ומבחן לביטוי הפרש בתאים שטופלו ב-תרומבין HMVEC-LBL. TopHat וחפת הם לאכלי וו פופולרי, והם תוכנה חופשיה, קוד פתוח 11. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי חפת היה רגישות וסגולית גבוהה באיתור אינטרונים בעבר מבואר 12. עם זאת, TopHat וחפת לא לטפל בכל היישומים של RNA-seq והם אינם הכלים היחידים לניתוח RNA-seq 11. TopHat וחפת דורשים transcriptome או הגנום התייחסות רצף. הן מתאימות במיוחד לניתוח נתוני RNA-SEQ המופקים ממכונות או Illumina או מוצקות ריצוף, אך לא 454 או אלקטרופורזה נימים הקלסיות רצף פלטפורמה. משתמשים שעובדים ללא התייחסות רצף הגנום עשויים לשקול ביצוע דה הרכבת transcriptome נובו משתמשים באחד ממספר כלים כגון טריניטי (http://trinityrnaseq.sourceforge.net/), חוצת תהום (http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) או בנאות מדברת (http://www.ebi.ac.uk/ ~ zerbino / בנאות /). תוכניות ניתוח רבות חלופיות transcriptome קיימות כיום. לסקירה של תוכניות שונות, לקוראים מומלצים לקרוא את המחקר של גרבר ואח'. -13 וביקורת על ידי מרטין וואנג 14, המתאר את היתרונות היחסיים ואת החסרונות ואת השיקולים התיאורטיים של תוכניות השימושיות ביותר כיום ונפוץ. הבחירה של אסטרטגיות transcriptome ניתוח (אסטרטגית התייחסות מבוססת, נובו אסטרטגית דה ואסטרטגיה משולבת) ותוכניות תלויות בגורמים רבים, כולל קיומו או שלמותו של הגנום התייחסות, על זמינותו של רצף ומשאבי מחשוב, סוג הנתונים שמוגדר נוצר, והכי חשוב, מטרת העל של פרויקט קביעת הרצף 14.

נקודה נוספת שצריכה להיעשות: שיתוףתוכניות mputer לניתוח transcriptome לא יכולות להניב דיוק של 100% מכל דיווח התמליל. סידור שגיאה הוא בעיה נוספת. זה תמיד רצוי שכל תמליל הביע באופן דיפרנציאלי, מזוהים על ידי RNA-seq להיות מאומת על ידי PCR בזמן אמת. כימית בדיקה מבוססת TaqMan נחשבת את תקן הזהב עבור הזמן PCR האמיתי. כמו כן, תעתיקים מזוהים חדש צריכים להיות מאומתים על ידי שיטת סנגר של רצפי DNA לפני כל צורך בניסויים נוסף.

פתרון בעיות

הכנת ספרייה: כתם של הדנ"א הגנומי הגבוה מולקולרי משקל לאחר יכולים להיגרם צעדי הכנת הספרייה על ידי נישא מעל מצעד טיהור החרוז הסופי במהלך הכנת הספרייה. חוזר הספריות לדוכן המגנטי במשך חמש דקות תמימות, עשוי לפתור את הבעיה. אם לא, הבעיה עלולה לנבוע מפיצול חלקי של רנ"א במהלך השלבים הראשונים של הכנת הספרייה. זה יכול להתרחש אם נמוךאיכות רנ"א משמש או אם הפרוטוקול לא אחריו בדיוק. לדוגמה, שינוי זמני הדגירה או הטמפרטורה, הוספת חומרים כימיים במטרה השגויה או שהייה בין קיטוע והסינתזה של הגדיל הראשון של cDNA. אם חוזר הספריות לדוכן המגנטי אינו מסיר את ה-DNA MW הגבוה, מומלץ לחזור על ספריית ההכנה עם דגימות RNA טריות.

עצימות נמוכות: אם עוצמת המחזור הראשונה היא נמוכה מצפוי, זה אפשרי שפריימרים לא להכליא לאשכולות כראוי במהלך השלב האחרון של דור אשכול או תא הזרימה אוחסנו זמן רב מדי בין אשכולות וההתחלה של הרצף לרוץ. במקרה זה, rehybridization פריימר יש לבצע באמצעות ערכת rehyb פריימר מIllumina. לרוב, rehyb זה פותר את בעיות העצמה והטווח ניתן להתחיל מעל בלי שום בעיה. אם לאחר rehyb, העוצמות עדיין נמוכות, הבעיה עלולה להיותבספריות או ברצף בסינתזת ריאגנטים (SBS) ושירות טכני Illumina יש לפנות לפתרון בעיות נוספים. אם העוצמות של הקריאה הראשונה הן טובות, אבל את העוצמות נמוכות לאחר מסתובבים, rehyb פריימר לפריימר לקריאה השני עשויה להיות נחוץ. זו מבוצעת במכשיר הרצף והשירות טכני Illumina יש לפנות להליך.

גבוה phasing / prephasing: אם גבוה מהדרגה או prephasing נורמלי הוא ציין, סיבה אפשרית היא הזיהום של החומרים כימיים האחרים SBS עם חיץ מחשוף. במהלך שלבי הכנת SBS, זה חיוני כדי לטפל בחיץ המחשוף האחרון ולשנות את הכפפות בין הטיפול בחיץ המחשוף וכל מגיבים אחרים. אם זיהום חיץ מחשוף חשוד, rehyb פריימר של תא הזרימה יש לבצע וריאגנטים SBS חדשים צריכים להיות מוכנים. לחלופין, יכול להיות שיש זיהום בקווי inst rument. אם זה על פי חשד, המכשיר צריך לעבור שטיפת תחזוקה (מים לשטוף אחרי NaOH שטיפה, ואחרי רחצה במים סופי), rehyb פריימר צריכה להתבצע בתא הזרימה וריאגנטים SBS חדשים צריכים להיות מוכנים. אם ערכי phasing / prephasing הם גבוהים למדי (~ 0.5), הטווח ניתן להמשיך עד שQ30 ציונים והאשכולות העוברים סינון מחושבים. רמות אלו עשויות עדיין להיות בגבולות מקובלים אפילו עם phasing הגבוה ו / או prephasing.

הכללה של פרוטוקול זה

למרות שזה הוא ספציפי לIllumina HiScanSQ, פרוטוקול זה הוא ישים לכל משפחת HiSeq או הגנום המנתח השני של Illumina מכשירים (www.illumina.com) עם שינויים קלים של צעדי דור מצרר וריאגנטים רצף. פלטפורמות אחרות דור הבא של רצפי DNA כגון סדרה המוצקה ("_blank"> Www.lifetechnologies.com), מערכות GS (www.454.com), כמו גם כמה מערכות חדשות מתעוררות גם העסיקו לצורך 11 RNA-seq. למרות שבניית הספרייה שלהם ונהלי ריצוף עשויה להיות שונים במקצת, את הטיפים לטיפול RNA, מנות ניתוח הנתונים (מורד מדרגות CASAVA) והאימות על ידי RT-PCR הוצגו בפרוטוקול זה יכולים להיות בעל ערך התייחסות ליישומים שלהם RNA-seq .

זה צריך להיות גם ציין כי בפרוטוקול זה הוא ספציפי ל RNA-seq בנקודת זמן אחת של תאים שטופלו תרומבין-HMVEC-LBL, אבל זה בקלות יכול להיות מותאם ללימוד או מחקרים בתאים אחרים נקודה רב זמן, רקמות שטופלו גירויים שונים או מעכבים, או השוואות של transcriptomes בתאים או רקמות בין מצב בריא ומצב מחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לד"ר סטיבן Kingsmore ומרכז לרפואת הגנום ילדים בבתי החולים ומרפאות מרסי לילדים לשימוש באשכולות המחשוב שלהם לניתוח הנתונים שלנו, צוות של Illumina תחום השירות (אליזבת בוייר, סקוט קוק ומארק קוק) והטכני צוות יועצים לתגובות המהירות שלהם והצעות מועילות על הריצה של מכשיר הדור הבא של רצפי DNA, HiScanSQ, וניתוח איכות נתונים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט HL080042 (לSQY) והקרן הזנק והנחלה של בתי החולים ומרפאות מרסי לילדים, אוניברסיטת מיזורי בקנזס סיטי (לSQY).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells Lonza CC-2815
Lonza, Bullet Kit Lonza CC-3202 Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics
Thrombin Sigma T4393
Ambion mirVana Kit Life Technologies AM 1560
RNase-Zap Life Technologies AM9782
Experion StdSens RNA Bio-Rad 700-7103
TruSeq RNA Preparation Kit Illumina FC-122-1001
AMPureXP Beads Beckman Coulter A63881
Superscript Reverse Transcriptase II Life Technologies 18064-014
Experion DNA 1K Bio-Rad 700-7107
QuantiTect SyberGreen Qiagen 204163
PE Cluster Generation Kit Illumina PE-401-3001
PhiX Control Kit Illumina FC110-301
200 Cycle SBS Kit Illumina FC-401-3001
HiScanSQ* Illumina SY-103-2001
cBot Illumina SY-301-2002
qPCR machine - Viia7 Life Technologies Model #VIIA7 / Equipment #10631261 Or equivalent
Experion System Bio Rad 7007001 Bioanalyzer is an alternative system
Spectrophotometer Bio-Tek Epoch Microplate Spectrophotometer Or equivalent
Centrifuge - Sorvall Legend XTR Thermo Scientific 75004521 Or equivalent
Magnetic stand Life Technologies AM10027
96-well thermocycler General Lab Supplier
Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
  4. Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
  5. Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
  6. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
  7. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  8. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  9. Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
  10. Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
  11. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
  12. Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
  13. Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
  14. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).

Tags

גנטיקה גיליון 72 ביולוגיה מולקולרית אימונולוגיה רפואה ג'נומיקס חלבונים RNA-seq דור הבא של רצפי DNA transcriptome תמלול טרומבין תא אנדותל תפוקה גבוהה ה-DNA הדנ"א הגנומי RT-PCR PCR
ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheranova, D., Gibson, M.,… More

Cheranova, D., Gibson, M., Chaudhary, S., Zhang, L. Q., Heruth, D. P., Grigoryev, D. N., Qing Ye, S. RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (72), e4393, doi:10.3791/4393 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter