РНК-след Анализ Transcriptomes в тромбин обращению и контролю человека легочной микрососудистой эндотелиальных клеток

Summary

Этот протокол представляет собой полный и подробный порядок применения РНК-след, мощный следующего поколения секвенирования ДНК технологии, профиль transcriptomes в человеческой легочной микрососудистых эндотелиальных клеток с лечением или без тромбина. Этот протокол является обобщением различных клеток или тканей под влиянием различных реагентов или болезненных состояний.

Protocol

Блок-схема изложением этот протокол отображается на рисунке 1.

1. Обработка клеток тромбина, РНК изоляции, оценке качества и количественной оценки РНК

1. Культура легких микрососудистой эндотелиальных клеток (HMVEC-LBL) до 90-100% слияния в 6-луночные планшеты в EGM-2 среды с 5% FBS, факторы роста и антибиотиков (Lonza, кошки # CC-3202).
2. Изменение средств массовой информации к голоду СМИ (0% FBS) 30 мин до начала лечения с тромбином.
3. Относитесь к клеткам с 0,05 ЕД / мл тромбина или оставить необработанными в качестве контроля в течение 6 часов при температуре 37 ° C и 5% CO _2.
4. Изолировать общей РНК из обработанных и контрольных клеток с использованием Ambion мир Vana комплекта в соответствии с инструкциями производителя.
5. Оценить качество РНК эукариот Experion чип StdSense РНК в соответствии со стандартным протоколом на Experion Автоматизированная станция электрофореза (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
6. Количественная РНК с использованием стандартного спектрофотометрического метода.

2. Строительство библиотеки и последовательности

1. Используйте 1 мкг высокого качества общей РНК в образце исходного материала.
2. Чтобы построить библиотеку, выполните стандартную процедуру от Illumina (протокол № 15008136 Rev. A). В этом протоколе двух раундов поли (А), содержащий выборы мРНК выполняется для удаления рРНК, чтобы свести к минимуму последовательности рРНК.
3. Оценить качество библиотек с использованием ДНК-чипов Experion 1K в соответствии со стандартом протокола о электрофореза Experion Автоматизированная станция ( www.bio-rad.com ).
4. Количественная библиотеки с помощью КПЦР: Используйте библиотеку, которая ранее была последовательной в качестве стандартной кривой и праймеров, специфичных для лигированную адаптеров. Использование диапазона разведений неизвестные библиотеки (1:100, т.е., 1:500 и 1:1000). Запустите КПЦР АККОrding к протоколу SyberGreen ММ и расчета исходной концентрации запасов каждой библиотеке.
5. Развести библиотечных фондов до 10 нм и хранят при температуре -20 ° C до готовности кластера потоке клеток.
6. Когда все будет готово к кластеру проточной ячейки, растопить CBOT пластины реагента на водяной бане. CBOT является Illumina инструмент, используемый для упорядочения процесса генерации кластеров.
7. Вымойте CBOT инструмента.
8. Денатурации библиотеках: Объединить 13 мкл 1x TE и 6 мкл 10 мкМ библиотеки и, на стороне трубки, добавить 1 мкл 1 N NaOH (при условии, Illumina). Vortex, спин вниз, инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин и поместить денатурированный библиотеки на льду.
9. Развести библиотеках: Развести денатурированный библиотек с предварительно охлажденным гибридизации буфер (HT1, предусмотренных Illumina), объединяя 996 мкл HT1 и 4 мкл денатурированный библиотека для конечной концентрации 12 вечера. Поместите денатурированный и разводненной библиотеки на льду.
10. Обратить каждого ряда труб пластины CBOT,обеспечение того, чтобы все реагенты оттаивают. Спином вниз пластину, снять / прокол фольги уплотнения и загрузить на CBOT.
11. Алиготе 120 мкл разбавленного, денатурированный библиотеки полосу трубки, с номерами 1-8. Добавить 1,2 мкл разведенного, денатурированный управления PhiX библиотеке (от Illumina) в каждую пробирку как шип-контроль. Vortex и спином вниз трубы и загружать их на CBOT в правильной ориентации (труба № 1 справа).
12. Загрузите ячейку потока и многообразия на CBOT.
13. Выполните проверку расхода и начать кластеризации перспективе.
14. После запуска завершена, проверьте реагента Доставка по всей полосы. Обратите внимание на любые отклонения от нормы. Либо начать последовательность выполнения сразу или хранить проточной ячейки в предоставленной трубки при 4 ° C.
15. Оттепель последовательности через синтез (SBS, Illumina) реагентов.
16. Загрузка реагентов в соответствующие места на реагентов лотков, стараясь не прикасаться к другим реагентам после прикосновения к расщеплению смеси.
17. Использование неп-последовательности потока ячейки (т.е. тот, который был секвенирован ранее), премьер-линии реагента в два раза.
18. Тщательно очистите последовательности проточной ячейки с 70% этанола и Kimwipes, а затем 70% этанола и линзы бумаги. Осмотрите проточной ячейки для любой полосы. Повторно очистить его в случае необходимости.
19. Загрузите проточной ячейки на секвенсор и выполнять потока убедитесь, что уплотнение между многообразия и проточной ячейки плотно.
20. Начало последовательности запуска.
21. Оценка показателей качества (например, кластер плотность кластеров проходящего фильтр, Q30, интенсивность) по мере их появления во время бега.
22. Мониторинг интенсивности по всему перспективе.
23. После 101 циклов завершен, выполнить поворот химии для завершения второй следующего содержания: Оттепель парных конце реагентов и второго буфера регистрации чтения (ICB, компоненты SBS реагентов, Illumina) и загружать реагенты.
24. Продолжите последовательность выполнения, оценка ^2-й читать интенсивности, Q30й другие показатели качества выполнения прогрессирует.

3. Анализ данных

1. Используйте последние версии CASAVA (Illumina, в настоящее время 1.8.2), чтобы преобразовать базу вызова файлов (. BCL) файлы. Fastq файлов, установка fastq-кластера счетом 0, чтобы создание единого файла fastq для каждого образца . Распакуйте fastq файлы для последующего анализа.
2. Выполните парный конце трассы с использованием последних версий TopHat (1.4.1) ^5, который присоединяется РНК-след читает млекопитающего размером генома использованием сверхвысокой пропускной короткие выравниватель для чтения (Bowtie, 0.12.7) ⁶ и SAMtools (0,1. 17) ^7. SAMtools реализует различные утилиты для пост-обработки рядов в формате SAM. Ссылка человека транскриптом могут быть скачаны с iGenomes ( www.illumina.com ). В беге TopHat, мы использовали все стандартные параметры настройки, включая выбор типа библиотеки, как FR-unstranded (по умолчанию).
3. НамING программы CuffDiff, часть запонки (1.3.0) ⁸ пакет программного обеспечения, сравнить тромбин-обработанных клеток с контролем клетки, чтобы отсеивать разному экспрессируются генов транскрипты в бывшем основана на человека транскриптом ссылки. Это сравнение определяет дифференциальное выражение известно стенограммы. Использование Microsoft Excel для визуализации результатов в виде таблицы. В беге запонки программы, мы использовали все настройки параметров по умолчанию. Те, ген стенограммы с FPKM <0,05 и р> 0,05 отфильтровываются.
4. Для обнаружения новых изоформ, запустить запонки без ссылки транскриптом. Сравните примеры файлов стенограмму, чтобы референсного генома использованием Cuffcompare и проверить дифференциальные выражения с Cuffdiff с использованием комбинированного файла стенограмме тромбина в качестве опорного генома для одного анализа и комбинированный контроль расшифровка файлов в качестве опорного генома для второго анализа. Использование Microsoft Excel для визуализации результатов в табличной форме. Опять же, тыс.электронной гена стенограммы с FPKM <0,05 и р> 0,05 отфильтровываются. После этого шага, следователи могут выбрать, чтобы загрузить список вновь зарегистрированных стенограммы на сайте УСК браузера генома ( http://genome.ucsc.edu/ ) для проверки их достоверности по ручного досмотра.
5. Представьте списки разному экспрессируются гены изобретательность анализа путей (IPA, www.ingenuity.com ) для характеристики гены и пути, пострадавших от лечения тромбина. На данном этапе следователи могут решить использовать пояс ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), пакет R, который разработан, чтобы помочь и упростить задачи анализа запонки РНК-след выходных, чтобы помочь управлять, визуализировать и интегрировать все данные, полученные с помощью анализа Cuffdiff.

4. Проверка РНК-последующие результаты по Количественные в режиме реального времени-Polymerase цепной реакции (QRT-PCR)

1. Выполните полной изоляции РНК из управления и тромбин обработанных HMVEC-LBL клеток, РНК оценки качества и РНК количественного описано в шагах от 1,4 до 1,6.
2. Создание комплементарной ДНК от 1 мкг суммарной РНК каждого образца с индексом III Первый Strand Синтез системы Комплекты РТ, в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, 18080-051).
3. Выполните QRT-PCR анализа Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System использованием Taqman анализа по требованию предназначен олигонуклеотидов для выявления CUGBP, ELAV-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor связанных фактор 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) и β-актин (ACTB, Hs99999903_m1). Каждый образец был шаблон эквивалентно 5 нг общей РНК. Измерьте количественного использования DDCT метод и нормализовать β-актина. Каждый тест проводился по крайней мере, три биологических повторностях.

Representative Results

Для Шаг 1: 28s: 18 лет соотношение традиционно используется как показатель деградации РНК. В идеале, 28s пика должны быть примерно в два раза площадь 18 лет группе (соотношение 2), однако это идеальное соотношение часто не видел на практике. Кроме того, 28s: 18 лет соотношение получается из спектрофотометрический методы могут недооценивать количество деградации РНК. Для более точной количественной деградации, и, следовательно, качества образцов РНК, система Experion рассчитывает показатель качества РНК (RQI) номер. Алгоритм RQI сравнивает electropherogram образцов РНК данным ряда стандартизированных, деградированных образцов РНК и автоматически возвращает число от 10 (нетронутым РНК) и 1 (деградировали РНК). Качество РНК должна иметь RQI по крайней мере 7, в идеале больше 8. Рисунке 2 показан Experion результатов с помощью высококачественной РНК образца с RQI 8,4.

ДляШаг 2: библиотеки должны иметь широкую полосу примерно в 250-300 б.п. На рисунке 3 показана Experion результаты высокого качества библиотеке Рисунок 4 показывает КПЦР результатам стандартных образцов кривой и одного неизвестного образца (показан в темно-синий)... Ход и качество выполнения последовательности должны постоянно наблюдаться по всему выполнения На рисунке 5 показано соответствующее плотности кластера на первом этапе визуализации цикла;., Это первый признак перспективе качества. Кластеры должны быть яркими и целенаправленной. Рисунке 6 показан первый доклад базы, созданные после первого цикла завершена. Это важно для оценки предполагаемой плотности кластера, уровни интенсивности, качества и фокус в этой точке. Следующий контрольно-пропускном пункте качества, после цикла 4, показано на рисунке 7. Это показывает абсолютную плотность кластеров для каждой полосы. Кластере плотность не должна быть выше 850 К / мм ^2. После цикла 13,фазировка (когда база не добавляется в ходе цикла) и prephasing (когда две базы добавляется в течение цикла) Статистика рассчитывается, как показано на рисунке 8. Типичные числа между 0,1 и 0,25. Основные оценки качества возможно после цикла 24, когда несколько показателей качества рассчитывается. Процентов читает выше Q30, как показано на рисунке 9, является мерой доверия к базе призвание. Чтение со счетом Q от 30 означает, что 1 из 1000 шансов, что база вызов неправильно. Q баллов будет уменьшаться по мере выполнения прогрессирует, но должны начать с более чем 95% читает соответствуют или превосходят Q30. Кластеров прохождение фильтра (ПФ), как показано на рисунке 10, являются кластеры, из которых фактические данные последовательности будут приняты. В идеале это должна быть выше 85%. Кластеров PF зависит от многих факторов, включая постепенный, prephasing, интенсивность и Q30. Он не будет меняться по мере выполнения прогрессирует. Процентов выровнены (

Для Шаг 3: В таблице 1 представлены выразил генов и изоформ в контрольной группе и тромбин обращение человека легочных капилляров эндотелиальных клеток. Примечательно, что около 26000 новых изоформ обнаружено, что свидетельствует о силе РНК-след-это может идентифицировать неизвестные РНК, альтернативного сплайсинга транскриптов и использования альтернативных промоутер, которые не обнаруживаются микрочипов методы ^3. РНК-след может также измерять менее обильными стенограмм, которые неточно количественно или не обнаруживается микрочипов. Рисунке 12 и в таблице 2 дисплея differentiallУ выразили генов в сигнальный путь тромбина. Это пример третьего поколения база знаний управляемые пути анализа ^9: путь топологии подходы, используя изобретательность анализа путей распространения программного обеспечения. Это показывает, что шесть часов тромбина лечения значительно выше регулирует тромбина Par рецептор 4 и вниз регулирует тромбина Par рецептора 3 пока нет изменений в экспрессии рецептора тромбина Номинал 1. Выражение NFKB1, NF kb2 и Src также значительно выше, регулируется. Некоторые из генов Rho семьи (Rho B, C, F и G) являются до-регулируется в то время как другие (Rho J, Q, T1, U и V) упали на регулируемые (табл. 4). Миозин ген легкой цепи 9 (MYL9) является до-регулируется в то время как MYL12B подавляется. Экспрессии других генов либо вниз регулируемых или не влияет.

Для Шаг 4: Для проверки РНК-последующие результаты с помощью альтернативного подхода, мы провели QRT-PCR эксперимента для анализа три Diff #Аренда генов (рис. 13). В РНК-последующие данные, TRAF1 был до-регулируется 7,96 раза; CELF1 было вниз регулируется на 1,16 раза, а FANCD2 подавлялась на 1,70 раза. В QRT-PCR данным, эти соответствующего числа 7,25 раза, -1,15 -2,07 раза и раза соответственно. Результаты этих трех генов анализировали с помощью РНК-след и QRT-PCR находятся в хорошем согласии, что подтверждает РНК-последующие результаты.

Гены
	Управление	Тромбин
Всего генов,	16636	16357
Контроль только	783
Тромбин только		504
Up-регулируемые (2-раза или больше разница)		152
Down-регулируется (2-кратное или гreater разница)		2190
Известные Изоформы
	Управление	Тромбин
Всего известно изоформ Выразил	26807	26300
Контроль только	1492
Тромбин только		985
Up-регулируемые (2-раза или больше разница)		480
Down-регулируется (2-раза или больше разница)		3574
Роман Изоформы
	Управление	Тромбин
Всего изоформ Роман выраженные	25880	25886
Контроль только	418
Тромбин только		424
Up-регулируемые (2-раза или больше разница)		1775
Down-регулируется (2-раза или больше разница)		12202

Таблица 1. Gene / изоформы Выражение Резюме *. Этой таблице перечислены генов, известных изоформ и новые изоформы выражается в контроле и тромбин обращение HMVEC-LBL клеток. Раз изменение соотношения тромбина FragmentsPerKilobase стенограммы perMillion фрагменты отображаются (FPKM) для управления FPKM. Эти гены, известные изоформы и новые изоформы с 2-кратным или больше разница между двумя группами статистически имеют различные уровни экспрессии (как определено после Benjamini-Hochberg коррекции). * В данной таблице приводится из таблицы 2 в ссылке 4.

Down-регулируемых генов
Обозначение гена	Общая кратное изменение	Пользователи	Индивидуальные кратное изменение	q_value **	FPKM управления	FPKM Тромбин
PLC	-2,49
		PLCB1	-2,97	0	6,75585	2,27611
		PLCB2	-1,32	0.00183634	1,80892	1,36957
		PLCB4	-10,04	6.28386E-14	0.682668	0,0679837
		PLCL1	-2,53	5.26728E-09	0.602879	0.238017
GAQ	-1,87
		GNAQ	-1,87	0	24,0907	12,8996
Гай	-1,56
		GNAI1	-1,86	0	9,88417	5,31795
		GNAI3	-1,49	0	35,7592	24,0198
PKC			-2,15
		PRKCE	-1,65	0	9,36364	5,67305
		PRKCI	-2,14	0	6,63566	3,09818
		PRKD3	-2,61	0	16,0215	6,12878
IP3R	-2,60
		ITPR1	-1,39	0,000018734	1,51592	1,09009
		ITPR2	-3,19	0	7,23283	2,26944
CREB	-2,36
		CREB1	-2,36	0	5,19117	2,2004
GATA	-2,33
		GATA3	-2,33	0.0228108	0.716773	0.307131
TBP	-1,35
		TBP	-1,35	2.66E-05	8,48689	6,30476
G-белок альфа-	-1,64
		GNA14	-1,49	0,000122496	2,78076	1,86573
		GNAI1	-1,86	0	9,88417	5,31795
		GNAI3	-1,49	0	35,7592	24,0198
		GNAQ	-1,87	0	24,0907	12,8996
PAR3	-1,87
		F2RL2	-1,87	1.02474E-06	1,51286	0.810286
SOS1
	SOS1	-2,27	0	8,94353	3,94679
Рас-	-1,69
		KRAS	-2,03	0	11,2766	5,5659
		NRAS	-1,61	0	38,0874	23,6491
AKT	-1,77
		AKT3	-1,77	0	15,8228	8,94223
МЛКП	-2,38
		PPP1CB	-2,10	0	39,585	18,8199
		PPP1R12A	-3,56	0	15,2274	4,27516
		PPP1R12B	-2,66	5.28466E-13	1,92123	0.722188
FAK	-1,31
		PTK2	-1,31	4.3856E-10	39,7935	30,3044
p70 S6K
		RPS6KB1	-1,99	0	8,46312
ROCK	-3,68
		ROCK1	-3,54	0	19,5921	5,53112
		ROCK2	-3,86	0	16,0054	4,14759
CAMK	-1,17
		CAMK1	1,30	0,000255587	7,90794	10,296
		CAMK2D	-1,74	2.22911E-12	11,4497	6,56804
		CAMK4	-2,58	0,000619045	0,62714	0.243277
Up-регулируемых генов
Символ	Общая кратное изменение	Пользователи	Индивидуальные кратное изменение	q_value **	FPKM управления	FPKM Тромбин
PAR4	1,59
		F2RL3	1,59	9.19043E-13	4,99867	7,9253
Src	1,47
		Src	1,47	0	14,1085	20,675
NF-Кб	1,65
		NFKB1	1,66	0	19,5113	32,3457
		NFKB2	2,02	0	28,7563	58,1293
		RELA	1,45	0	55,3482	80,28
Частичное Up-/Partial Down-регулируемых генов
Символ	Общая кратное изменение	Пользователи	Индивидуальные кратное изменение	q_value **	FPKM управления	FPKM Тромбин
G-белком гамМассачусетс	1,22
		GNG10	-1,34	2.17216E-08	27,192	20,2206
		GNG11	1,31	5.66209E-05	770,922	1011,05
		GNG12	-1,44	5.11591E-13	112,397	78,3023
		GNG2	2,43	6.38453E-09	0.465705	1,13132
G-белка бета-	1,27
		GNB2	1,36	1.91268E-10	137,786	187,43
	GNB3	-2,69	4.71259E-11	2,58703	0.962504
		GNB4	-1,61	0	15,8275	9,85484
Rho ГЭФ	-1,16
		ARHGEF12	-1,67	0	30,6424	18,3015
		ARHGEF2	1,33	5.80478E-08	27,6288	36,758
		ARHGEF3	-1,48	0	20,3279	13,7813
		ARHGEF6	-2,08	0	2,67944	1,28635
		ARHGEF9	-1,54	0.00469498	1,56367	1,0159
PI3K	-1,80
		Банкомат	-6,84	0	4,98972	0.729483
		PIK3C2A	-5,09	0	17,7894	3,49234
		PIK3C3	-1,49	4.66294E-15	12,6504	8,50852
		PIK3CA	-3,14	0	16,8398	5,36228
		PIK3CB	-1,36	8.4357E-09	9,68516	7,12129
		PIK3CD	1,86	0	5,6579	10,5507
		PIK3CG	-1,76	2.32945E-10	1,86962	1,06419
		PIK3R1	-1,79	0	5,48118	3,06256
		PIK3R3	-1,59	1.50915E-05	5,24549	3,30763
		PIK3R4	-1,40	7.18425E-12	8,34176	5,97942
Rho	1,19
		RhoB	1,31	9.48429E-06	232,232	304,587
		RHOC	1,38	458,267	630,235
		RHOF	1,65	0	8,29676	13,7268
		RhoG	1,40	1.02141E-14	58,6003	82,0172
		RHOJ	-1,57	0	127,446	80,9317
		RHOQ	-1,52	0	16,4802	10,8122
		RHOT1	-1,96	3.00071E-12	8,48834	4,33755
		RHOU	-1,54	0.00184367	0.900141	0.586092
		RHOV	-3,32	0.0056467 1	0.413912	0.124591
		RND3	-1,95	0	58,0564	29,7075
MLC	-1,06
		MYL12B	-1,43	4.87832E-11	872,075	608,472
		MYL9	1,48	0	202,636	299,559

Таблица 2. Дифференциально экспрессируются гены и изоформ в Pathway Тромбин сигнализации *. * В данной таблице приводится таблица из S4 в номер 4 с незначительными изменениями. **, Q-значение, ложных открытий регулировать значение р.

93/4393fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Блок-схема протокола для РНК-след профилирования тромбин-опосредованной транскриптом в человеческой легочной микрососудистых эндотелиальных клеток. Во-первых, лечить и изолировать клетки и количественно РНК. Подготовка библиотеки из высококачественной РНК и оценить их концентрацию (через КПЦР) и качество (через bioanalyzer), то кластер на потоке клеток. Начало последовательности запуска и анализа качества выполнения на всей территории. Основные контрольно-пропускных пунктов качества циклов 1, 4, 13 и 24. Использование CASAVA, конвертировать файлы в BCL fastq файлы, а затем выровнять тех генома с TopHat. Обнаружение известных и неизвестных изоформ использованием запонки и определить дифференциальные выражения с CuffDiff. Просмотр выходных файлов в Excel и отфильтровать генов, которые есть выражение уровне менее 0,05 FPKM или р-значение большее, чем 0,05. Добавить остальные гены изобретательность Анализ Путь для получения дополнительной информации о функциях генов и путейffected по лечению тромбина. Как правило, подобранный набор разному экспрессируются гены подтверждено альтернативного подхода, таких как QRT-PCR.

Рисунок 2. Репрезентативной выборке РНК с RQI на 8,4, как проанализированы Experion Автоматизированная станция электрофорез) отдельных следов высокого качества РНК -.. Оси х показывает время и оси у изображает флуоресцентный сигнал B) виртуальное изображение геля из высококачественных образцов РНК. Интенсивность 28S пик больше, чем пик 18S и никакого загрязнения не наблюдается. Обе группы имеют острые края и определены. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3. Высокое качество библиотеку получали из РНК в качестве проанализированы Experion Автоматизированная станция электрофореза широкого пика между 250 и 300 б.п. обнаружено и никаких высокого молекулярного веса ДНК (ДНК загрязняющих) наблюдается) отдельных следов высококачественная библиотека.. - оси х показывает время и оси у изображает флуоресцентный сигнал B) виртуальная картинка гель высокого качества библиотеке. Широкого пика между 250 и 300 б.п. обнаружено и никаких высоким молекулярным весом ДНК (ДНК загрязняющих) не наблюдается. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

<сильная> Рисунок 4. КПЦР результатов с помощью SyberGreen и праймеров, специфичных для Illumina лигированную адаптеров. ранее кластеризованных библиотека используется в качестве стандартной кривой для определения оптимальной концентрации кластеризации для вновь подготовленных библиотекой. Разбавления неизвестные библиотека входит в стандартную концентрацию кривой. Стандартные образцы кривой предъявлено обвинение стрелки и неизвестного образца темно-синего цвета, а также указано стрелкой.

Рисунок 5. . Соответствующие плотности кластера на первом этапе визуализации цикл кластеров ясно, целенаправленной и яркие) базы;. B) Base C, C) База G, D) Base T.

<TD> 19892

Метрика	Lane 1		Переулок, дом 3	Lane 4	Lane 5	Переулок, 6	Переулок 7	Lane 8
Плотность кластера (к / мм 2)	420,94	412,95	410,81	408,54	416,71	416,56	410,02	411,84
Интенсивность	25870,5	23886	23891,38	23735,83	23949,38	24933,08	24305,79	23950,29
C интенсивность	21559,62	19822,33	19759,33	19472	19954,21	20611,75	19438,29
G Intensity	13619,46	11756,67	11486,44	10498,38	12186,62	12195,5	11826,88	11010,5
T Intensity	19402,67	17663,79	17854,42	17353,75	17545,54	18060,67	18457,92	17397,12
Фокус Оценка	68,2	67,46	67,67	67,75	67,41	67,43	67,63	67,05
C Фокус Оценка	67,93	67,33	67,56	67,66	67,33	67,39	67,46	66,9
G Фокус Оценка	65,4	64,14	63,98	63,92	63,29	63,41	63,47	63,74
T Фокус Оценка	66,45	65,57	65,5	65,49	65,03	65,23	65,57	65,59

Рисунок 6. Первый доклад базы, созданные после первого цикла завершена. Кластера плотность (хотя и недооценивать на данном этапе) является целесообразным. Интенсивность хорошо выглядеть (10,000-26,000, с G с наименьшим интенсивности). В центре внимания оценки также необходимо, падение около 65-70, хотя более высокие значения также необходимо.

g7.jpg "ALT =" Рисунок 7 "/>
Рисунок 7. Кластере плотность рассчитывается после цикла 4 кластера плотность ниже, чем 850 к / мм ² и даже во всех переулках) табличной форме;... B) График форму Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 8. Постепенный (не добавляя базу в течение цикла) и предварительного постепенного (с добавлением двух баз в течение цикла). Оба значения в 0,25 или ниже, с указанием соответствующих постепенно / предварительный постепенный уровней.) Постепенно и предварительно постепенно численные значения . B) постепенно значений в графической форме. C) предварительно постепенно значений в графической форме. Clic К здесь, чтобы просмотреть большую фигуру.

Рисунок 9. Различные представления Q30 баллов после цикла 24. Счетом 30 или выше указывает 1 в 1000 вероятность того, что база вызов неправильно. Около 90% из десятков Q выше 30 А) табличной форме (Q30 оценкам здесь от полноты перспективе, через цикл 24);. B) Q30 баллов по циклу. Каждая панель представляет собой распределение читает, приходящихся на Q30 или выше для данного цикла. C) Q30 оценка распределения по циклу 24. Распределение баллов Q на кумулятивной основе через цикл 24. Q балл по оси Х и миллионы прочтений находится на оси ординат. Читает с Q30 выше 30 представлены в зеленый цвет.oad/4393/4393fig9large.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.

Рисунок 10. Различные представления кластеров прохождение фильтра. Кластеры проходящего фильтр на основе нескольких параметров, включая Q30, интенсивности и постепенно / предварительной фазы. По крайней мере, 85% от кластеров проходят фильтр в каждой полосе) табличной форме;. B) График форме, синие прямоугольники представляют общее количество кластеров, зеленые ящики представляют собой кластеры проходящих фильтры. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 11. . Процентов кластеров приведены в соответствие с геномом PhiX примерно 0,5% от кластеров привести к геному PhiX, соответствующие на сумму PhiX шипами в образцах) табличной форме;.. B) График форму Нажмите, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 12. Гены-разному экспрессируются в тромбин лечения HMVEC-LBL в тромбин сигнального пути. Пути Тромбин Сигнализация была построена изобретательность. В пути, красный цвет указывает вверх-регулируемых генов ⁽³ в 1,3 раза) и зеленый вниз-регулируемых генов ( таблице 2. Эта цифра приводится на рисунке 4 в справочном 4. Нажмите, чтобы увеличить рисунок

Рисунок 13. QRT-PCR проверки трех разному экспрессируются гены от тромбина обращение HMVEC-LBL РНК-последующие данные. QRT-PCR проводили, как описано в протоколе. Fold изменений определяется из относительных значений Ct Выражения анализа генов TaqMan для CUGBP, ELAV-как член семьи 1 (CELF1), анемия Фанкони, D2 дополнения группа (FANCD2) и TNF рецептора соответствующий коэффициент 1 (TRAF1)Были сравнению с теми обнаружены РНК-след. Репликация (п = 4) для каждого образца проводились и Ct значения усредняются. Все Ct значения нормированы на β-актина. Погрешности представляют диапазон изменения как раз определяется по данным Assist программного обеспечения. р <0,05 считали статистически значимыми в относительной раза изменениях между тромбином удовольствием группе и контрольной группе как РНК-след и QRT-PCR анализа. Уровня мРНК в контрольных группах по каждой пробе был произвольно установлен как один, который не показан. * Р <0,05; **, р <0,01. Эта цифра приводится на рисунке 6 в номер 4.

Discussion

Ключевые шаги

РНК-разгрузочные работы: РНКаз будет деградировать даже самого высокого качества РНК, поэтому необходимо соблюдать осторожность во время выделения, хранения и использования ^РНК-10. Перчатки всегда носили, чтобы предотвратить загрязнение РНКазы найдены на человеческих рук. Перчатки следует менять часто, особенно после контакта с кожей, дверные ручки или другие общие поверхности. Набор из пипетки должна быть посвящена исключительно РНК работы и все советы и трубы должны быть РНКазы. Выделение РНК и вниз по течению заявка должна быть выполнена в низких местах движения, которые обычно обеззаражены продуктов, таких как РНК-Зап. Деградация может происходить и при повторных циклов замораживания-оттаивания. Они могут быть сведены к минимуму аликвоты и РНК для последующего применения сразу же после изоляции. Кроме того, ДНК может быть сделано для последующих приложений, таких как QRT-PCR непосредственно после изоляции. РНК должна храниться при температуре -80 ° С и держится на льду во время использования. Кроме того, импortant тщательно оттаивать и вихревой РНК образцов до и во время использования.

Исходное качество РНК имеет важное значение для успеха этого протокола. Использование унизил или иным низкого качества РНК может привести к библиотеке подготовки к сбою или привести к низкой доходности, что будет недостаточно для секвенирования. Даже если достаточно библиотеке могут быть сделаны из деградированных или низкого качества РНК, она не будет точно представлять транскрипты присутствуют в образце, в результате неточного количественное выражение. Кроме того, любой неудаленных геномной ДНК в РНК изоляции может привести к переоценке количества РНК, используемых в протоколе, но если суммы (например, 1-2 мкг) в середине предложенного диапазона (0,1-4 мкг) Используется, фактическое количество РНК будет достаточно для протокола. Кроме того, любой геномной ДНК, скорее всего, не будет подхвачен олиго (DT) грунтовка на основе строительства библиотеки в стандартный протокол Illumina и, следовательно, это не вызовет вниз по течению МКСЕЭС с выраженными уровнями мРНК. Количественной оценки, начиная РНК с использованием регулярных спектрофотометрического показания должны быть достаточными, и нет необходимости использовать очень точные количественные методы, такие как RiboGreen с библиотеками будет точно количественно после подготовки КПЦР и уровня экспрессии гена нормированы по отношению к общему числу читает во время шага анализа данных.

Библиотека Количественное. Точный количественный библиотек является жизненно важным для соответствующего поколения кластеров. Только молекул ДНК с успехом лигировали адаптеры образуют кластеры. Спектрофотометрическое показаний не будет различий между ДНК с ДНК адаптеры и без него, что приведет к завышению концентрации в библиотеке и в конечном счете привести под кластеризации потоков клетки. Количество ДНК без лигированную адаптеры будут отличаться от библиотеки к библиотеке, даже если тот же РНК используется как начатьния материала, поэтому никто не может точно предположить, что стандартный процент от спектрофотометрического чтения ДНК с перевязанной адаптеров. Выполнение КПЦР с праймерами, специфичными к адаптерам будет обнаруживать только те молекулы ДНК с адаптерами успешно лигируют с обоих концов молекулы. Это позволяет абсолютного количественного библиотек и, в свою очередь точной плотности кластера. Оценка библиотек с инструментом Experion или bioanalyzer также важно. Это позволяет визуализировать диапазон размеров библиотеки, которая является важным шагом в анализе данных и гарантирует, что нет никаких загрязнений, которые могут помешать кластера поколения.

Анализ данных. Кроме этого протокола, мы применили TopHat для выравнивания РНК-след читает человека транскриптом ведения и запонки собрать стенограммы, оценить их содержания, а также тест для дифференциального выражения в тромбин обработанных HMVEC-LBL клеток. TopHat и запонки тгоре популярных инструментов, и они свободно, с открытыми исходными кодами ^11. Недавнее исследование показало, что запонки обладает высокой чувствительностью и специфичностью при выявлении ранее аннотированный интронов ^12. Тем не менее, TopHat и запонки не решают всех приложений РНК-след они не являются единственными инструментами для РНК-анализ последующих ^11. TopHat и запонки требуют транскриптом последовательный ссылку или геном. Они особенно подходят для анализа РНК-последующие данные, полученные либо из Illumina или твердого секвенирования, но не 454 или классический капиллярного электрофореза последовательности платформы. Пользователи, работающие без генома ссылкой последовательными может рассмотреть выполнение De Novo транскриптом сборки с помощью одного из нескольких инструментов, таких как Троица ( http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), Trans-Abyss ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) или оазисы ( http://www.ebi.ac.uk/ ~ Зербино / оазисы / ). Многие альтернативные программы транскриптом анализа в настоящее время существуют. Для обследования различных программ, читатели могут прочитать исследование Гарбер и соавт. ¹³ и обзор Мартин Ван и ^14, которые описывают сравнительные преимущества и недостатки, и теоретическими соображениями и в настоящее время наиболее часто используемых программ. Выбор стратегии транскриптом анализа (ссылка основе стратегии, De Novo стратегии и комбинированной стратегии) ​​и программы зависит от многих факторов, включая наличие или полноты ссылкой генома, наличие последовательности и вычислительные ресурсы, типа набора данных генерируется и, самое главное, главная цель проекта секвенирования ^14.

Еще один момент, должно быть: сотрудничествоmputer программ для транскриптом анализ не может дать 100% точность всех стенограммы докладов. Секвенирование ошибки является другой проблемой. Это всегда целесообразно, что любая дифференциально экспрессируются расшифровка определенных РНК-след быть подтверждено ПЦР в реальном времени. TaqMan зондов на основе химии считается золотым стандартом для ПЦР в реальном времени. Кроме того, вновь выявленные стенограммы должно быть подтверждено методом Sanger секвенирования ДНК до дальнейших экспериментов.

Поиск и устранение неисправностей

Библиотека Приготовление: мазок с высоким молекулярным весом геномной ДНК после действия библиотеке подготовки может быть вызвано перенос из конечного борта стадии очистки в библиотеке подготовки. Возвращаясь библиотек в магнитном стенде в течение полных пяти минут может решить эту проблему. Если нет, то вопрос может быть связано с неполным фрагментации РНК во время первых шагов в библиотеке подготовки. Это может произойти при низкойКачество РНК используется или если протокол не выполняется в точности. Например, изменение времени инкубации или температуры, добавления реагентов в неправильном порядке или паузы между фрагментацией и синтеза первой нити кДНК. При возвращении библиотеки в магнитном стенде не снимает высокую ДНК МВт, желательно повторить библиотеке подготовки свежих образцов РНК.

Низкая интенсивность: Если первый цикл интенсивность ниже, чем ожидалось, вполне возможно, что праймеры не гибридизуются с кластерами правильно на последнем этапе генерации кластеров или проточной ячейке хранится слишком долго между кластеризации и начала секвенирования бежать. В этом случае грунтовка rehybridization должны быть выполнены с использованием набора праймеров rehyb от Illumina. Чаще всего, это rehyb решает интенсивность вопросов и выполнения может быть запущена без всяких проблем. Если после rehyb, интенсивности прежнему остаются низкими, проблема может бытьс библиотеками или последовательности путем синтеза (SBS) реагентов и Illumina технического обслуживания следует обращаться для дальнейшего поиска неисправностей. Если интенсивность первого чтения являются хорошими, но низкой интенсивности после поворота вокруг, грунтовки rehyb второй праймер для чтения может быть необходимым. Это выполняется на последовательности инструмент и Illumina технического обслуживания следует обращаться за процедуру.

Высокая постепенно / prephasing: Если выше, чем обычно постепенно или prephasing наблюдается, возможной причиной является загрязнение другими реагентами SBS с декольте буфера. Во время действия SBS подготовки, важно, чтобы справиться с расщеплением последнего буфера и менять перчатки при обращении с расщеплением буфера и любых других реагентов. Если загрязнение расщепления буфера подозревают, грунтовки rehyb потока ячейки должны быть выполнены и новых реагентов SBS должны быть подготовлены. Кроме того, не может быть загрязнение в линиях инст rument. Если есть подозрения, прибор должен пройти техническое обслуживание стирки (промывной воды следует мыть NaOH, после последней промывки водой), грунтовки rehyb должны быть выполнены на поток клеток и новых реагентов SBS должны быть подготовлены. Если постепенном / prephasing значения умеренно высоких (~ 0,5), перспективе может быть продолжен до Q30 оценки и кластеров прохождение фильтра рассчитываются. Эти уровни могут по-прежнему находиться в допустимых пределах даже при высоких этапов и / или prephasing.

Обобщаемость этот протокол

В то время как специфичные для Illumina HiScanSQ, этот протокол применяется к любой семьи HiSeq или Genome Analyzer II из Illumina инструментов ( www.illumina.com ) с незначительными изменениями кластера поколения шаги и последовательность реагентов. Другие следующего поколения секвенирования ДНК платформ, таких как твердый серии ("_blank"> Www.lifetechnologies.com), GS систем ( www.454.com ), а также некоторые страны с формирующимся новых системах также используются для РНК-след ^11. Хотя их строительство библиотеки и последовательности процедур может немного отличаться, советы РНК обработки, анализа данных частей (на выходе из шагов CASAVA) и проверка ОТ-ПЦР, представленные в этом протоколе может быть эталонное значение их след РНК-приложений .

Следует также отметить, что данный протокол является специфическим для РНК-след в одной временной точке тромбина обращение HMVEC LBL-клеток, но она может быть легко адаптирована к многопартийной время исследования точке или исследованиях в других клетках, тканях, обработанных различные стимулы или ингибиторы, или сравнение transcriptomes в клетки или ткани между здоровым состоянием и болезненного состояния.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC-2815
Lonza, Bullet Kit	Lonza	CC-3202	Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics
Thrombin	Sigma	T4393
Ambion mirVana Kit	Life Technologies	AM 1560
RNase-Zap	Life Technologies	AM9782
Experion StdSens RNA	Bio-Rad	700-7103
TruSeq RNA Preparation Kit	Illumina	FC-122-1001
AMPureXP Beads	Beckman Coulter	A63881
Superscript Reverse Transcriptase II	Life Technologies	18064-014
Experion DNA 1K	Bio-Rad	700-7107
QuantiTect SyberGreen	Qiagen	204163
PE Cluster Generation Kit	Illumina	PE-401-3001
PhiX Control Kit	Illumina	FC110-301
200 Cycle SBS Kit	Illumina	FC-401-3001
HiScanSQ*	Illumina	SY-103-2001
cBot	Illumina	SY-301-2002
qPCR machine - Viia7	Life Technologies	Model #VIIA7 / Equipment #10631261	Or equivalent
Experion System	Bio Rad	7007001	Bioanalyzer is an alternative system
Spectrophotometer	Bio-Tek	Epoch Microplate Spectrophotometer	Or equivalent
Centrifuge - Sorvall Legend XTR	Thermo Scientific	75004521	Or equivalent
Magnetic stand	Life Technologies	AM10027
96-well thermocycler	General Lab Supplier
Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated.