Summary
Bu protokol ile veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq, güçlü bir nesil DNA dizileme teknolojisi, uygulamak için tam ve ayrıntılı prosedür sunar. Bu protokol, farklı reaktifler veya hastalık durumlarında etkilenen çeşitli hücreleri veya dokulara genellenebilir olduğunu.
Abstract
MRNA seviyelerinin ölçümü yoluyla hücrelerinde gen ekspresyonu karakterizasyonu hücrenin transkripsiyonel makine harici sinyaller (örneğin uyuşturucu tedavisi), veya nasıl hücreler sağlıklı bir devlet ve bir hastalıklı durum arasındaki farklılıklar nasıl etkilendiğini belirlemede yararlı bir araçtır. Nesil DNA dizileme teknolojinin gelişi ve sürekli arıtma ile, RNA-sıralama (RNA-seq), transkript bütün türlerin kataloğa tüm ifade genlerin transkripsiyonel yapısını belirlemek ve ölçmek için transcriptome analiz giderek daha popüler bir yöntem haline gelmiştir belirli bir hücre, doku veya organizma 1,2 transkript toplam grubu değişen ifade seviyeleri. RNA-seq kademeli olarak tam bir profil transcriptome avantajlara sahiptir çünkü, transcriptome analiz için tercih edilen bir yöntem olarak DNA mikroarrayleri yerine bir tür dijital veri (herhangi bir transkript kopya sayısı) sağlayan ve bilinen herhangi bir genomik istif güvenmek içince 3.
Burada, biz veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq uygulamak için tam ve ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol başlıklı bizim son yayınlanan araştırmaya dayanmaktadır başarılı insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin ilk tam transcriptome analizi icra ettiği 4 "RNA-seq Trombin ile Tedavi İnsan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde Genlerin ve Bunların İzoformlar, Romanı transcriptome ortaya çıkarır" trombin RNA-seq kullanarak tedavi. Bu inflamatuvar koşulları, kanser, diyabet ve koroner kalp hastalığı patogenezinde trombin aracılı endotel disfonksiyonu moleküler mekanizmaları içgörüler kazanmak için daha sonraki denemeler için görülmemiş kaynaklar vermiştir ve bu hastalıklar için tedavi hedefleri için potansiyel yeni müşteriler sağlar.
Bu protokolün açıklayıcı metindört bölüme ayrılmıştır. Birinci bölüm trombin ve RNA izolasyonu, kalite ve miktar ile analiz insan akciğer mikrovasküler endotel hücrelerinin tedavisi açıklanmaktadır. İkinci bölümde kütüphane oluşturma ve sıralama açıklar. Üçüncü kısım veri analizi açıklanmıştır. Dördüncü bölüm, bir RT-PCR testi doğrulama açıklanmaktadır. Birkaç kilit adımlar Temsilcisi sonuçları görüntülenir. Önemli adımlar başarı artırmak için Yararlı ipuçları veya önlem Tartışma bölümünde verilmiştir. Bu protokol trombin ile tedavi insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde kullanmasına rağmen, memeli ve non-memeli hücrelerinde hem de farklı uyaranlara veya inhibitörleri, ya da sağlıklı bir devlet arasındaki hücre veya dokularda transcriptomes karşılaştırmak ile tedavi dokularda profili transcriptomes jeneralize olabilir ve bir hastalık durumu.
Protocol
Bu protokol özetleyen bir akış şeması Şekil 1 'de gösterilir.
1. Trombin, RNA İzolasyonu, RNA Kalitesi Değerlendirme ve Ölçülmesi ile Hücre Tedavisi
- % 5 FBS, büyüme faktörleri ve antibiyotik ile EGM-2 orta boy 6-kuyucuğu yılında% 90-100 izdiham Kültür İnsan Akciğer Mikrovasküler Endotel Hücreleri (HMVEC-LBL) (Lonza, cat # CC-3202).
- Açlık medya (0% FBS) öncesinde trombin ile tedaviye 30 dakika ortam değiştirin.
- 0.05 U / ml trombin ile hücrelerin tedavi ya da ° C ve% 5 CO2 37, 6 saat süreyle, bir kontrol olarak tedavi bırakın.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak Ambion mir Vana kiti kullanılarak tedavi edilen ve kontrol hücrelerinden toplam RNA izole edin.
- Experion Otomatik Elektroforez İstasyonu (ilgili standart protokole göre bir Experion StdSense Ökaryotik RNA çip ile RNA kalitesini değerlendirmek= "_blank"> Www.bio-rad.com).
- Bir standart spektrofotometrik yöntem kullanılarak RNA ölçülmesine imkan verirler.
2. Kütüphane İnşaat ve Dizileme
- Başlangıç maddesi olarak örnek için yüksek kalitede toplam RNA'nın 1 mg kullanımı.
- Kütüphane oluşturmak için, Illumina (protokol # 15008136 Rev A) 'dan standart prosedürü izleyin. Bu protokolde, poli iki tur (A) içeren mRNA seçimleri rRNA dizi minimize etmek rRNA kaldırmak için yapılır.
- Experion Otomatik Elektroforez İstasyonu (ilgili standart protokole göre bir Experion DNA 1K çip kullanan kütüphanelerin kalitesini değerlendiriniz www.bio-rad.com ).
- QPCR kullanarak kütüphane sayısal: önce bir standart eğri ve bağlanan bağdaştırıcıları için spesifik primerler olarak dizisi edilmiş bir kütüphane kullanın. Bilinmeyen kütüphaneleri (yani 1:100, 1:500 ve 1:1,000) dilüsyonlarının bir dizi kullanın. QPCR ACCO çalıştırınSyberGreen MM protokol rding ve her kütüphanenin orijinal stok miktarını hesaplamak.
- Küme bir akış hücresi hazır olana kadar -20 ° C'de 10 nM ve saklamak için kütüphane stok sulandırınız.
- Ne zaman küme bir akış hücresi hazır, bir su banyosunda CBOT reaktif plaka eritin. CBOT küme oluşturma sürecini hızlandırmak için kullanılan bir Illumina araçtır.
- CBOT enstrüman yıkayın.
- Kütüphaneleri denatüre:, tüpün yönünde 13 ul TE 1x ve 6 ul 10 uM ve kütüphane, Kombine 1 ul 1 N NaOH (Illumina tarafından sağlanan) ekleyin. Vorteks, aşağı dönüş 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve buz üzerinde denatüre kütüphaneleri yerleştirin.
- Kütüphaneleri inceltilir 12:00 arasında bir nihai konsantrasyon için 996 ul HT1 ve 4 ul denatüre kütüphane birleştirilmesi ile önceden soğutulmuş bir hibridizasyon tampon ile denatüre kütüphaneleri (HT1, Illumina tarafından sağlanmaktadır) seyreltilir. Buz üzerinde denatüre ve seyreltilmiş kütüphaneler yerleştirin.
- , CBOT levha tüplerin her sıra InvertTüm reaktifler çözülmüş olmasının sağlanması. Plaka aşağı Spin, / delinmeye folyo mühürler kaldırmak ve CBOT üzerine yerleştirin.
- Bir şerit tüp seyreltilmiş, denatüre kütüphanelerin kısım 120 ul, 1-8 etiketli. Bir kontrol başak-gibi her tüpe 1,2 ul seyreltilmiş, denatüre phix kontrol kitaplığı (Illumina dan itibaren) ekleyin. Vortex ve tüpler aşağı spin ve doğru yönde CBOT (sağ tüp # 1) yükleyin.
- CBOT üzerine bir akış hücresi ve manifoldu yükleyin.
- Akışını kontrol ve kümelenme çalışma başlar tamamlayın.
- Çalışma tamamlandıktan sonra, tüm kulvarları arasında reaktif teslim edin. Herhangi bir anormallik not edin. Ya 4 ° C'de hemen dizi çalışma başlatmak veya sağlanan tüp içinde akış hücresi depolamak
- Sıralama-by-sentez (SBS, Illumina) reaktifler çözülme.
- Dilinim karışımı dokunduktan sonra diğer reaktifler dokunmamaya dikkat ederek, reaktif tepsileri uygun noktalar reaktifleri yerleştirin.
- Bir hayır kullanman-sıralama akış hücresi (yani önceden sıralandı biri), asal reaktif çizgiler iki kez.
- İyice% 70 EtOH ve lens kağıt ardından% 70 EtOH ve Kimwipes ile sıralama akış hücresi, temizleyin. Herhangi çizgiler akış hücresi inceleyin. Gerekirse yeniden temizleyin.
- Sequencer üzerine akış hücresi yükleyin ve manifoldlar ve akış hücresi arasındaki mühür sıkı olduğundan emin olmak için kontrol akışı gerçekleştirin.
- Sıralama çalışma başlatın.
- Onlar çalıştırması sırasında kullanılabilir hale kalite ölçütleri (küme yoğunluğu, örneğin filtre geçen kümeleri, S30, yoğunluk) değerlendirin.
- Çalışma süresince yoğunluğunu izleyin.
- 101 döngüleri tamamlandıktan sonra, ikinci okumak tamamlamak için dönüş kimya gerçekleştirin: Eşleştirilmiş sonuna reaktifler ve ikinci okuma Ortaklığımız Buffer (ICB, SBS reaktiflerin bir bileşeni, Illumina) çözülme ve reaktifler yükleyin.
- 2. yoğunluğu, S30 bir okuma değerlendirirken, sıralama çalışma devamçalışma ilerledikçe nd diğer kalite ölçütleri.
3. Veri Analizi
- Her numune için tek fastq dosyasının oluşturulmasını sağlamak için 0 fastq-küme sayısı ayarı. Fastq dosyaları tabanı çağrı dosyaları (. Bcl) dosyalarını dönüştürmek için casava (Illumina, şu anda 1.8.2) en son sürümünü kullanın . Aşağı analiz için fastq dosyaları açın.
- RNA-seq ultra high-throughput kısa okuma hizalama (Papyon, 0.12.7) 6 ve SAMtools (0.1 kullanarak memeli ölçekli genom okur hizalar Tophat (1.4.1) 5, en son sürümlerini kullanarak eşleştirilmiş sonuna hizalama gerçekleştirin. 17) 7. SAMtools SAM biçiminde sonrası işleme hizalanmalar için çeşitli araçlar uygular. Referans insan transcriptome iGenomes (indirilebilir www.illumina.com ). Tophat çalıştıran, biz fr-unstranded (varsayılan) olarak kütüphane türü seçeneği dahil olmak üzere tüm varsayılan parametre ayarları kullanılır.
- Bize8. yazılım paketi programı CuffDiff, kol düğmesi parçası (1.3.0) 'a ing insan referans transcriptome esas olarak önceki farklı olarak ifade edilen gen transkript dışarıda bırakmak için, kontrol hücreleri ile trombin ile tedavi edilen hücreler karşılaştırın. Bu karşılaştırma bilinen transkript diferansiyel ifadesi algılar. Tablo şeklinde sonuç görselleştirmek için Microsoft Excel kullanın. Kol Düğmeleri program çalışırken, biz tüm varsayılan parametre ayarları kullanılır. FPKM <0.05 ve p> olanlar gen transkript 0.05 filtrelenir.
- Roman izoformları algılamak için, bir referans transcriptome olmadan Kol Düğmeleri çalıştırın. Cuffcompare kullanılarak referans genomuna örnek transkript dosyaları karşılaştırın ve bir analiz için referans genomu ve bir ikinci analiz için referans genom olarak birleştirilmiş kontrol transkript dosyaları olarak birleştirilmiş trombin transkript dosyaları kullanılarak Cuffdiff ile diferansiyel ifade test edin. Tablo biçiminde sonuç görselleştirmek için Microsoft Excel kullanın. Yine, ThosFPKM <0.05 ve p> E gen transkript 0.05 filtrelenir. Bu adımdan sonra, araştırmacılar UCSC Genom Tarayıcı web sitesi (için yeni rapor transkript bir listesini yüklemeyi tercih edebilirler http://genome.ucsc.edu/ bir elle muayene ederek geçerliliğini doğrulamak için).
- Yaratıcılık Pathway Analizi (IPA, değişik şekillerde ifade genlerin listeleri gönderin www.ingenuity.com trombin tedavi etkilenen genlerin ve yolların karakterizasyonu için). Bu adımda, müfettişler kuşak (kullanmayı tercih edebilir http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ görselleştirmek, yönetmenize yardımcı olmak için), Kol Düğmeleri RNA-seq çıkış irdeleme görevini yardım ve kolaylaştırmak için tasarlanmış bir R paketi, ve bir analiz Cuffdiff tarafından üretilen verinin her entegre.
4. Kantitatif Gerçek-zamanlı-Po tarafından RNA-seq Sonuçlar Validasyonulymerase Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR)
- Kontrol ve trombin-işlenmiş HMVEC-LBL hücreleri, RNA kalite değerlendirmesi ve 1.6 Adımlar 1,4 açıklanan RNA miktarının toplam RNA izolasyonu gerçekleştirin.
- Üreticinin talimatlarına (Invitrogen, 18080-051) takip Üst Simge III Üretim-Strand Sentez Sistemi RT Kitleri ile her bir örnek 1 mg total RNA, gelen tamamlayıcı DNA oluşturun.
- CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor tespiti için Taqman Assay-on-Demand tasarlanmış oligonükleotidler kullanılarak Uygulamalı Biyosistem VIIa 7 Real-Time PCR Sistemi qRT-PCR analizi gerçekleştirin ilişkili faktör 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) ve β-aktin (ACTB, Hs99999903_m1). Her numune toplam RNA 5 ng eşdeğer bir şablon vardı. DDCt yöntemiyle kantitatif ölçün ve β-aktin normalleştirmeniz. Her bir tahlil çoğaltır, en az üç biyolojik karşısında gerçekleştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adım 1 için: 28s: 18s oranı geleneksel RNA bozulmanın bir göstergesi olarak kullanılmaktadır. İdeal olarak, 28s tepe 18s bant (2 oranında) yaklaşık iki katı alan olmalıdır, ancak bu ideal oran genellikle uygulamada görülmemektedir. Ayrıca, 28s: spektrofotometrik yöntem ile elde edilen 18s oranları RNA bozulma miktarı göz ardı edebilir. Daha doğru bir şekilde parçalanması ve bu nedenle RNA örnek kalitesini ölçmek için, Experion sistem, bir RNA kalite göstergesi (RQI) sayısını hesaplar. RQI algoritması standardize edilmiş, bozulmuş RNA örnekleri arasında bir dizi verilerine RNA örnekleri arasında elektroferogram karşılaştırır ve otomatik olarak 10 (bozulmamış RNA) ve 1 (bozulmuş RNA) arasında bir sayı ile döner. RNA kalite 8 daha ideal büyük en az 7 bir RQI, olmalıdır. Şekil 2 8.4 bir RQI ile yüksek kalitede RNA örneği kullanarak Experion sonuçlarını gösterir.
IçinAdım 2: kütüphaneler, yaklaşık 250-300 bp geniş bir bant olmalıdır Şekil 3 yüksek kaliteli kütüphane Experion sonuçlarını gösteren Şekil 4 qPCR standart eğrinin numunelerin sonuçları ve bir bilinmeyen numune (koyu mavi ile gösterilir) gösterir... Sıralama koşmak ilerleme ve kalite sürekli çalışma süresince uyulmalıdır Şekil 5 İlk döngü görüntüleme adımında uygun küme yoğunluğu gösterir;. Bu çalışma kalite ilk belirtisidir. Kümeler parlak ve odaklı olmalıdır. Şekil 6 birinci devreden sonra oluşturulan First Base Raporu tamamlandı gösterir. Bu noktada tahmin kümelenme yoğunluk, yoğunluk düzeyleri ve odak kalitesini değerlendirmek için önemlidir. Döngü sonra 4 sonraki kalite kontrol noktası, Şekil 7 'de gösterilmiştir. Bu her kulvar için mutlak küme yoğunluğunu göstermektedir. Küme yoğunluğu 850 K / mm 2 'üzerinde olmamalıdır. Döngüsü 13 sonra,Şekil 8 de gösterildiği gibi fazlama (bir baz, bir döngü sırasında ilave olmadığı zaman) ve (iki taban, bir döngü sırasında eklendiği zaman) prephasing istatistikler hesaplanır edilir. Tipik sayılar, 0.1 ve 0.25 arasında bulunmaktadır. Önemli kalite değerlendirmesi birçok kalite ölçütleri hesaplanmıştır döngüsü 24, sonra mümkündür. Şekil 9'da gösterildiği S30 yukarıda okur ve yüzde, baz çağrısı içinde güven bir ölçüsüdür. 30 Q skoru ile salt baz çağrısı yanlış olduğunu 1 1.000 şansı var demektir. Q skorları çalışma ilerledikçe azalır, ancak toplantı veya S30 aşan okur arasında% 95'ten daha fazla ile başlamalıdır. Şekil 10'da gösterildiği gibi filtre (PF) geçen kümeleri, gerçek sekans verileri alınır hangi kümeleridir. İdeal olarak, bu% 85 üzerinde olmalıdır. Küme PF fazlama, prephasing, yoğunluğu ve S30 dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Bu çalışma ilerledikçe değişiklik olmayacaktır. Yüzde hizalanmış ( Adım 3 için: Tablo 1 genlerin kontrol ve trombin tedavi insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde hem izoformları sunuyor. Özellikle, gücünü göstermektedir tespit Yaklaşık 26.000 romanı izoformu vardır RNA-seq-it mikroarray teknikleri 3 tarafından algılanamaz bilinmeyen RNA'lar, alternatif örgülü transkript ve alternatif organizatörü kullanımını belirleyebilirsiniz. RNA-seq da yanlış mikroarrayler tarafından sayısallaştırılmış veya algılanmaz az bol transkript ölçebilirsiniz. Şekil 12 ve Tablo 2 ekran differentially trombin sinyal yolunun genlerin ifade. Yolu topolojisi bazlı yaklaşımlar, Ingenuity Pathway Analysis yazılımı kullanılarak: Bu üçüncü jenerasyon bilgi tabanına dayalı yolun analiz 9, örnek olarak verilebilir. Bu trombin reseptör Par 1 ifadesinde hiçbir değişiklik yokken, altı saat trombin tedavisinde önemli trombin reseptör Par 4 up-regüle ve trombin reseptör Par 3 aşağı-regüle olduğunu göstermektedir. NFkB1 ifadesi, NF kB2 ve Src da önemli up-regüle vardır. Diğerleri (Rho J, Q, T1, U ve V)-düzenlenmiş aşağı (Tablo 4) ise Rho gen ailesinin bazı (Rho B, C, F ve G) up-regüle vardır. MYL12B aşağı-regüle iken miyozin hafif zincir gen 9 (MYL9) up-regüle olduğunu. Diğer genlerin ekspresyonu ya da aşağı-regüle ya da etkilenmez. Adım 4 için: alternatif bir yaklaşım kullanarak RNA-seq sonuçları doğrulamak için, biz test üç yönün bir qRT-PCR deney gerçekleştirdikiralık gen (Şekil 13). RNA-seq veriler, TRAF1 7.96 kat-regüle kadar oldu; CELF1 1.16 kat aşağı-regüle oldu ve FANCD2 1.70 kat aşağı düzenlenmiştir. QRT-PCR veriler, bu gelen sayıların 7,25 kat, -1.15 kat ve kat -2,07, sırasıyla. RNA-seq ve qRT-PCR ile tayin bu üç genlerin sonuçlar RNA-seq sonuçları doğrulamıştır iyi bir uyum içinde bulunmaktadır. Tablo 1. Gene / izoform İfade Özet *. Bu tablo genler, bilinen izoformu kontrol ve trombin tedavi HMVEC-LBL hücrelerinde eksprese romanı izoformlarının listeler. Kıvrım değişim FPKM kontrol etmek için (FPKM) eşlenen transkript perMillion parçalarının trombin FragmentsPerKilobase oranıdır. İki grup arasındaki 2 kat veya daha fazla fark ile bu genler, bilinen izoformu ve roman izoformları istatistiksel olarak farklı ekspresyon düzeyleri (as Benjamini-Hochberg düzeltildikten sonra belirlenir) var. * Bu tablo Referans 4 Tablo 2 den üretilir. Tablo 2. Trombin Sinyal Pathway farklı biçimde ifade Genler ve İzoformlar *. * Bu tablo, küçük bir değişiklik ile Referans 4 Tablo S4 üretilir. **, Q-değer, p-değeri ayarlanabilir bir yanlış keşif hızı. 93/4393fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/> Genler Kontrol Trombin Toplam Genler ifade 16,636 16,357 Sadece kontrol 783 Sadece Trombin 504 Yukarı-regüle (2-kat ya da daha büyük bir farklılık) 152 Aşağı-regüle (2-kat ya da greater farkı) 2,190 Bilinen İzoformlar Kontrol Trombin Toplam Bilinen İzoformlar ifade 26,807 26,300 Sadece kontrol 1,492 Sadece Trombin 985 Yukarı-regüle (2-kat ya da daha büyük bir farklılık) 480 (2-kat ya da daha büyük bir farklılık) aşağı-regüle 3,574 Roman İzoformlar Kontrol Trombin Toplam Roman İzoformlar ifade 25,880 25,886 Sadece kontrol 418 Sadece Trombin 424 Yukarı-regüle (2-kat ya da daha büyük bir farklılık) 1,775 (2-kat ya da daha büyük bir farklılık) aşağı-regüle 12,202 Aşağı-Ayarlı Genler Gen Sembolü Genel Kıvrım Değiştir Üyeler Bireysel Kıvrım Değiştir ** q_value Kontrol FPKM FPKM Trombin PLC -2.49 PLCB1 -2.97 0 6.75585 2.27611 PLCB2 -1.32 0.00183634 1.80892 1.36957 PLCB4 -10.04 6.28386E-14 0.682668 0.0679837 PLCL1 -2.53 5.26728E-09 0.602879 0.238017 GAQ -1.87 GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996 Gai -1.56 GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795 GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198 PKC -2.15 PRKCE -1.65 0 9.36364 5.67305 PRKCI -2.14 0 6.63566 3.09818 PRKD3 -2.61 0 16.0215 6.12878 IP3R -2.60 ITPR1 -1.39 0.000018734 1.51592 1.09009 ITPR2 -3.19 0 7.23283 2.26944 CREB -2.36 CREB1 -2.36 0 5.19117 2.2004 GATA -2.33 GATA3 -2.33 0.0228108 0.716773 0.307131 TBP -1.35 TBP -1.35 2.66E-05 8.48689 6.30476 G-proteini alfa -1.64 GNA14 -1.49 0.000122496 2.78076 1.86573 GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795 GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198 GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996 PAR3 -1.87 F2RL2 -1.87 1.02474E-06 1.51286 0.810286 SOS1 SOS1 -2.27 0 8.94353 3.94679 Ras -1.69 KRAS -2.03 0 11.2766 5.5659 NRA'lar -1.61 0 38.0874 23.6491 AKT -1.77 AKT3 -1.77 0 15.8228 8.94223 MLKP -2.38 PPP1CB -2.10 0 39.585 18.8199 PPP1R12A -3.56 0 15.2274 4.27516 PPP1R12B -2.66 5.28466E-13 1.92123 0.722188 FAK -1.31 PTK2 -1.31 4.3856E-10 39.7935 30.3044 p70 S6K RPS6KB1 -1.99 0 8.46312 ROCK -3.68 ROCK1 -3.54 0 19.5921 5.53112 ROCK2 -3.86 0 16.0054 4.14759 CAMK -1.17 CAMK1 1.30 0.000255587 7.90794 10.296 CAMK2D -1.74 2.22911E-12 11.4497 6.56804 CAMK4 -2.58 0.000619045 0.62714 0.243277 Up-Ayarlı Genler Sembol Genel Kıvrım Değiştir Üyeler Bireysel Kıvrım Değiştir ** q_value Kontrol FPKM FPKM Trombin PAR4 1.59 F2RL3 1.59 9.19043E-13 4.99867 7.9253 Src 1.47 Src 1.47 0 14.1085 20.675 NF-kB 1.65 NFKB1 1.66 0 19.5113 32.3457 NFKB2 2.02 0 28.7563 58.1293 RELA 1.45 0 55.3482 80.28 Kısmi Up-/Partial Aşağı Ayarlı Genler Sembol Genel Kıvrım Değiştir Üyeler Bireysel Kıvrım Değiştir ** q_value Kontrol FPKM FPKM Trombin G-proteini ile gamanne 1.22 GNG10 -1.34 2.17216E-08 27.192 20.2206 GNG11 1.31 5.66209E-05 770.922 1011.05 GNG12 -1.44 5.11591E-13 112.397 78.3023 GNG2 2.43 6.38453E-09 0.465705 1.13132 G-protein beta 1.27 GNB2 1.36 1.91268E-10 137.786 187.43 GNB3 -2.69 4.71259E-11 2.58703 0.962504 GNB4 -1.61 0 15.8275 9.85484 Rho GEF -1.16 ARHGEF12 -1.67 0 30.6424 18.3015 ARHGEF2 1.33 5.80478E-08 27.6288 36.758 ARHGEF3 -1.48 0 20.3279 13.7813 ARHGEF6 -2.08 0 2.67944 1.28635 ARHGEF9 -1.54 0.00469498 1.56367 1.0159 PI3K -1.80 ATM -6.84 0 4.98972 0.729483 PIK3C2A -5.09 0 17.7894 3.49234 PIK3C3 -1.49 4.66294E-15 12.6504 8.50852 PIK3CA -3.14 0 16.8398 5.36228 PIK3CB -1.36 8.4357E-09 9.68516 7.12129 PIK3CD 1.86 0 5.6579 10.5507 PIK3CG -1.76 2.32945E-10 1.86962 1.06419 PIK3R1 -1.79 0 5.48118 3.06256 PIK3R3 -1.59 1.50915E-05 5.24549 3.30763 PIK3R4 -1.40 7.18425E-12 8.34176 5.97942 Rho 1.19 RHOB 1.31 9.48429E-06 232.232 304.587 RHOC 1.38 458.267 630.235 RHOF 1.65 0 8.29676 13.7268 RHOG 1.40 1.02141E-14 58.6003 82.0172 RHOJ -1.57 0 127.446 80.9317 RHOQ -1.52 0 16.4802 10.8122 RHOT1 -1.96 3.00071E-12 8.48834 4.33755 RHOU -1.54 0.00184367 0.900141 0.586092 RHOV -3.32 0.0056467 1 0.413912 0.124591 RND3 -1.95 0 58.0564 29.7075 MLC -1.06 MYL12B -1.43 4.87832E-11 872.075 608.472 MYL9 1.48 0 202.636 299.559
Şekil 1. Insan akciğer mikrovasküler endotel hücrelerinin trombin-aracılı transcriptome of RNA-seq profil için protokol akış diyagramı. İlk olarak, hücreler tedavi etmek ve RNA izole etmek ve ölçmek. Yüksek kalitede RNA kütüphaneler hazırlayın ve daha sonra konsantrasyon (qPCR yoluyla) ve kalite (bir Bioanalyzer yoluyla), bir akış hücresi üzerinde küme değerlendirmek. Sekanslama çalışma başlatın ve çalışma kalitesini boyunca analiz. Önemli kalite kontrol noktası çevrimleri 1, 4, 13 ve 24 vardır. Casava kullanarak, bcl dosyaları fastq dosyaları dönüştürmek ve sonra Tophat ile genom için bu hizalayın. Kol Düğmeleri kullanarak bilinen ve bilinmeyen izoformları Algıla ve CuffDiff ile diferansiyel ifadesini belirleyin. Excel çıktı dosyalarını görüntüleme ve daha az 0.05 FPKM bir ifade düzeyi veya 0.05 daha büyük bir p-değerine sahip genleri filtre. Gen işlevleri hakkında daha fazla bilgi için Yaratıcılık Pathway Analizi kalan genler Gönder ve patikaların birtrombin ile muamele ffected. Genellikle, farklı olarak ifade edilen genlerin setinde böyle qRT-PCR gibi alternatif bir yaklaşım tarafından doğrulanır. 
Şekil 2. Olarak Experion Otomatik Elektroforez İstasyonu tarafından analiz 8.4 bir RQI sahip bir temsilci RNA numune A) yüksek kalitede RNA bireysel izleme -.. X-ekseni zamanı gösteriyor ve y-ekseni floresan sinyal resmediyor B) sanal jel resmi Yüksek kaliteli bir RNA örnek. 28S doruk şiddeti 18S tepe daha büyük olduğunda ve hiçbir kirlenme görülmektedir. Hem bantları keskin ve tanımlanmıştır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. RNA hazırlanan Yüksek kaliteli kütüphane olarak Experion Otomatik Elektroforez İstasyonu tarafından analiz 250 ve 300 bp arasında geniş bir pik tespit edilir ve hiçbir yüksek molekül ağırlıklı DNA (DNA kirlenmesine) gözlenir A) yüksek kaliteli kütüphane bireysel izleme.. - x-ekseni zamanı göstermektedir ve y-ekseni floresan sinyali, bir yüksek kaliteli bir kütüphane B) sanal jel görüntü göstermektedir. 250 ve 300 bp arasında geniş bir pik tespit edilir ve hiçbir yüksek molekül ağırlıklı DNA (DNA kirlenmesine) görülmektedir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
<strong> Şekil 4. SyberGreen ve primerler Illumina bağlanan bağdaştırıcıları için spesifik kullanılarak qPCR ile sonuçlanır. bir önceden kümelenmiş bir kütüphane yeni hazırlanmış kütüphane için optimum kümelenme konsantrasyonunu belirlemek için standart eğri olarak kullanılır. Bilinmeyen kütüphane seyreltme standart eğri konsantrasyonları içinde düşer. Standart eğri örnekleri okları tarafından suçlanan ve bilinmeyen numune bir okla mavi ve ayrıca belirtilir karanlık vardır.
Şekil 5,. . Ilk çevrimi görüntüleme adımında Uygun küme yoğunluğu kümeler, net odaklı ve aydınlık A) Baz A;. B) Baz C, C) Baz G, D) Taban T.
| Metrik | Lane 1 | | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Lane 7 | Lane 8 | |
| Küme Yoğunluğu (k / mm 2) | 420.94 | 412.95 | 410.81 | 408.54 | 416.71 | 416.56 | 410.02 | 411.84 |
| Bir Yoğunluğu | 25870.5 | 23886 | 23891.38 | 23735.83 | 23949.38 | 24933.08 | 24305.79 | 23950.29 |
| C Yoğunluğu | 21559.62 | 19822.33 | 19759.33 | 19472 | 19954.21 | 20611.75 | <td> 1989219438.29 | |
| G Yoğunluğu | 13619.46 | 11756.67 | 11486.44 | 10498.38 | 12186.62 | 12195.5 | 11826.88 | 11010.5 |
| T Yoğunluğu | 19402.67 | 17663.79 | 17854.42 | 17353.75 | 17545.54 | 18060.67 | 18457.92 | 17397.12 |
| Bir Odak Puan | 68.2 | 67.46 | 67.67 | 67.75 | 67.41 | 67.43 | 67.63 | 67.05 |
| C Odak Puan | 67.93 | 67.33 | 67.56 | 67.66 | 67.33 | 67.39 | 67.46 | 66.9 |
| G Odak Puan | 65.4 | 64.14 | 63.98 | 63.92 | 63.29 | 63.41 | 63.47 | 63.74 |
| T Odak Puan | 66.45 | 65.57 | 65.5 | 65.49 | 65.03 | 65.23 | 65.57 | 65.59 |
Şekil 6. Ilk döngüsü sonra oluşturulan First Base Raporu tamamlandı. Küme yoğunluğu (bu aşamada hafife rağmen) uygundur. Yoğunlukları (10,000-26,000, G düşük yoğunluk olması ile) iyi görünüyorsun. Daha yüksek değerler de uygun olmasına rağmen odak puanları, 65-70 etrafında düşen de uygundur.
g7.jpg "alt =" Şekil 7 "/>
Şekil 7. Küme yoğunluğu döngüsü 4 sonra hesaplanan küme yoğunluğu 850 k / mm 2 daha düşük ve hatta tüm kulvarları karşısında A) Sekmeli formu;... B) Grafik şeklinde büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 8. Faz (bir devir sırasında bir baz ekleme değil) ve (a döngüsü sırasında iki baz ekleme) Pre-açmaktadır. Her iki değer aşağıda 0.25 'de ya da, uygun ön-aşamalı / fazlama seviyelerini gösteren a.) Fazlama ve ön aşamaları sayısal değerler b.) grafik şeklinde fazlama değerleri, c.) ön aşamaları grafik şeklinde değerleri. Clic büyük bir rakam görmek için buraya k.
9 Şekil. Döngüsü 24 saat sonra S30 puanlarının farklı temsilleri. 30 veya daha yüksek bir puan tabanı çağrı yanlış olduğunu 1 1,000 şans göstermektedir. Q puan yaklaşık% 90'ı 30 üzerindedir A) tablo şeklinde (burada S30 puanları döngüsü 24 ile, çalışma bütünü vardır);. Döngüsü B) S30 puanları. Her çubuk döngüsü 24 ile belirli döngüsü için yukarıda S30 ya da düşme okur. C) S30 puan dağılımlarının dağılımını temsil eder. Döngüsü 24 ile kümülatif bazda Q puan dağılımı. Q skoru x-ekseni ve okuma milyonlarca y-ekseni üzerinde yer almaktadır. 30 üzerinde S30 yeşil temsil edilmiştir okur.oad/4393/4393fig9large.jpg "target =" _blank "> büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.
10 Şekil. Filtre geçen filtre. Kümeler geçen kümelerinin farklı gösterimi S30, yoğunluk ve ön aşamaları / aşamaları da dahil olmak üzere çeşitli parametrelere dayanır. Kümelerin en az% 85 her kulvarda filtre geçiyoruz A) Sekmeli formu;. B) Grafik formu, mavi kutular kümelerin toplam sayısını temsil, yeşil kutuları filtreleri geçen kümeleri temsil etmektedir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
11 Şekil. . Phix genomuna hizalanmış kümelerinin yaklaşık% 0.5 kümelerin yüzde örnekleri içine çivili phix miktarı için uygun, phix genomuna hizalamak A) Sekmeli formu;.. B) Grafik şeklinde büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 12. Ayirt Trombin Sinyal yolağındaki HMVEC-LBL ve trombin tedavi ifade Genler. Trombin Sinyal yolağı Yaratıcılık tarafından yaptırılmıştır. Yol, kırmızı renk genleri (3 1.3 kat) ve yeşil aşağı-regüle gen (regüle kadar gösterir
13 Şekil. trombin tedavi HMVEC-LBL RNA-seq verileri üç farklı olarak ifade edilen genlerin qRT-PCR doğrulama. protokolde tarif edildiği gibi qRT-PCR gerçekleştirilmiştir. CUGBP için TaqMan Gene Expression tahlil nispi Ct değerleri belirlenir Kıvrım değişikliği, aile üyesi 1 (CELF1), Fanconi anemisi, tümleme grup D2 (FANCD2) ve TNF gibi Elav reseptör ilişkili faktör 1 (TRAF1)RNA-seq ile tespit olanlarla karşılaştırıldı. Çoğaltır (n = 4) Her numune çalıştırın ve Ct değerleri ortalamaları alınmıştır. Tüm Ct değerlerini β-aktin normalize edildi. Hata çubukları Data yazılım Hazırlık tarafından belirlendiği gibi kat değişim aralığı temsil eder. p <0.05 RNA-seq ve qRT-PCR hem trombin tedavi grubu ve kontrol grubu arasındaki göreli kat değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Her testte kontrol grubundaki mRNA düzeyi keyfi gösterilmez biri olarak kuruldu. *, P <0.05; ** p <0.01. Bu rakam Referans 4 Şekil 6 den üretilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anahtar adımlar
RNA Elleçleme: RNaz, hatta en yüksek kalitede RNA düşer dolayısıyla bakım RNA 10 izolasyonu, depolanması ve kullanılması sırasında alınmalıdır. Eldiven her zaman insan elinde bulunan RNaz tarafından kirlenmesini önlemek için giyilir. Eldiven, özellikle dokunma deri, kapı kolu ya da başka ortak yüzeyleri sonra, sık sık değiştirilmesi gerekir. Pipetler bir dizi çalışma RNA sadece adanmıştır edilmeli ve tüm ipuçları ve tüpler RNaz arındırılmış olmalıdır. RNA izolasyonu ve uygulama mansap rutin gibi RNaz-Zap gibi bir ürün ile dekontamine edilir düşük trafik alanlarda yapılmalıdır. Bozulması da tekrarlanan donma-çözülme döngüleri ile oluşabilir. Bu izolasyon derhal downstream uygulamalar için RNA aliquoting minimize edilebilir. Alternatif olarak, cDNA direkt olarak tecrit sonra bu qRT-PCR olarak aşağı uygulama için yapılabilir. RNA -80 ° C'de depolanır ve kullanım sırasında buz üzerinde tutulmalıdır. Ayrıca, impiyice çözülmesini ortant ve vorteks RNA örnekleri önce ve kullanım sırasında.
RNA başlangıç kalitesi bu protokolün başarısı için esastır. Bozulmuş veya başka düşük kaliteli RNA kullanın sıralama için yetersiz kalacağı düşük verim başarısız veya sonuçlanması kütüphane hazırlık neden olabilir. Yeterli kütüphane bozulmuş ya da düşük kaliteli RNA yapılabilir olsa bile, bu kesin olarak ifade eksik miktar ile sonuçlanan, numune içinde mevcut transkriptlerin temsil edecektir. Ayrıca, RNA izolasyonu esnasında herhangi Çıkarılmayan genomik DNA protokolünde kullanılan RNA miktarı aşırı tahmin neden olabilir, ama eğer önerilen aralığının ortasında bir miktar (örneğin 1-2 mg) (0.1-4 ug) kullanılır, RNA gerçek miktar protokol için yeterli olacaktır. Buna ek olarak, herhangi bir genomik DNA standart Illumina protokolünde oligo (dt) astar tabanlı kütüphane inşaat tarafından yakalandı olması muhtemel değildir ve bu nedenle aşağı iss neden olmazifade mRNA transkript düzeyleri ile ues. Düzenli spektrofotometrik okumaları kullanarak başlangıç RNA miktarının yeterli olmalıdır ve kütüphaneler doğru qPCR ve gen ekspresyon düzeyleri tarafından hazırlandıktan sonra sayısal olarak beri böyle RiboGreen gibi son derece hassas sayısal yöntemler kullanmaya gerek toplam sayısına oranla normalleştirilir var veri analizi adımları sırasında okur.
Kütüphane Niceleme. Kütüphanelerin Doğru miktar kümelerinin uygun üretimi için hayati önem taşımaktadır. Başarıyla bağlandı adaptörleri Sadece DNA molekülleri küme oluşturacak. Spektrofotometrik okumalar kütüphane konsantrasyonunun aşırı tahmini neden olur, hangi olmadan adaptörleri ve DNA ile DNA arasındaki ayrım ve sonuçta akış hücresinin altında kümelenme neden olmayacaktır. Bağlanmış DNA adaptör olmaksızın miktarı aynı RNA başlangıç olarak kullanılmış olsa bile, kütüphanesinden kütüphane için farklı olacaktırzemesi, bu nedenle bir doğru spektrofotometrik okuma, standart bir yüzdesi bağlanan adaptörleri ile DNA olduğunu kabul edemeyiz. Bağdaştırıcıları için özel primerler ile başarılı bir şekilde yapılması qPCR molekülün her iki ucuna bağlanmakta ve adaptörleri ile sadece bu DNA molekülleri tespit eder. Bu kütüphanelerin mutlak bir miktar verir ve doğru bir küme yoğunluğu açın. Bir Experion enstrüman veya Bioanalyzer ile kütüphaneler değerlendirilmesi de önemlidir. Bu veri analizi adımları sırasında önemli kütüphane, boyut aralığı bir görselleştirme sağlar ve küme oluşturmanıza engel olabilecek herhangi bir kirlenme olduğunu garanti eder.
Veri Analizi. Bu protokol, RNA-seq, transkript araya yüzdeleri tahmin ve trombin-işlenmiş HMVEC-LBL hücrelerde farklı ifade test insan referans transcriptome ve Kol Düğmesi okur hizalamak Tophat uygulanır. Tophat ve Kol Düğmesi t vardırwo popüler araçları, ve ücretsiz, açık kaynak yazılım 11 vardır. Yakın tarihli bir çalışmada Kol Düğmeleri önce açıklamalı intronları 12 saptanmasında yüksek duyarlılık ve özgüllük olduğunu gösterdi. Ancak, Tophat ve Kol Düğmesi RNA-seq tüm uygulamalar ele vermez ne de RNA-seq analizi 11 için sadece araçlardır. Tophat ve Kol Düğmeleri Bir sıralı başvuru transcriptome veya genom gerektirir. Bunlar Illumina ya da katı sıralama makineleri, ancak 454 ya da platformun dizileme klasik kapiler elektroforez ya da elde edilen RNA-seq verilerin analizi için özel olarak uygundur. Bir sıralı referans genom olmadan çalışma Kullanıcılar, Trinity (gibi çeşitli araçları kullanarak de novo transcriptome montajı yapan düşünebilirsiniz http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), Trans-Abyss ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) ya da Oases ( / http://www.ebi.ac.uk/ ~ Zerbino / vahaların ). Birçok alternatif transcriptome analiz programları şimdi var. Farklı programlar bir araştırma için, okuyucular Garber ve ark tarafından yapılan çalışmada okumak isteyebilirsiniz. 13. ve karşılaştırmalı avantajları ve dezavantajları ve en güncel ve sık kullanılan programların teorik düşünceler tanımlamak Martin ve Wang 14, tarafından yorum. Transcriptome analizi stratejileri (referans tabanlı strateji, de novo strateji ve kombine strateji) ve programların seçimi bir referans genomun varlığı veya eksiksizliği, kaynakların sıralaması ve hesaplanmasının durumu, belirlenen veri türü dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır oluşturulan ve en önemlisi, dizileme projesi 14 herkesin ortak hedefi.
Başka bir nokta yapılmalıdır: cotranscriptome analizi için mputer programların tüm transkript raporlama% 100 doğruluk getirebilecek değil. Hata Dizileme başka bir husustur. Bu RNA-seq tarafından tespit edilen herhangi Farklı olarak ifade transkript real-time PCR ile doğrulanması her zaman tavsiye edilir. TaqMan probu tabanlı kimya gerçek zamanlı PCR için altın standart olarak kabul edilir. Ayrıca, yeni tespit transkript başka deney öncesi DNA dizi analizi ve Sanger metodu ile valide edilmelidir.
Sorun Giderme
Kütüphane Hazırlık: kütüphane hazırlık adımları neden olabilir yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA bir smear sonra taşıma-over kütüphane hazırlanması sırasında son boncuk saflaştırma adımı. Tam beş dakika manyetik stand kütüphaneleri dönersek sorunu giderebilir. Değilse, sorunu kütüphane hazırlık ilk adımları sırasında RNA eksik parçalanma kaynaklanıyor olabilir. Bu oluşabilir eğer düşük-kalite RNA kullanılır veya tam olarak protokol takip değilse. Örneğin, yanlış sırayla reaktifler ekleme veya parçalanma ve cDNA birinci şeridinin sentezinde arasına duraklatma inkübasyon süreleri veya sıcaklık değiştiren. Manyetik stand kütüphaneleri dönen yüksek MW DNA kaldırmak değilse, taze RNA örnekleri ile kütüphane hazırlık tekrarlamak için tavsiye edilir.
Düşük yoğunluk: birinci aşama yoğunluğu beklenenden daha düşük ise, bu primerler küme oluşturma veya akış hücresinin son adımı sırasında düzgün kümelere melezleşme vermedi mümkündür kümeleme ve sıralama başlaması arasında çok uzun süre saklandığı çalıştırın. Bu durumda, bir primer rehybridization Illumina ikinci bir astar rehyb kit kullanılarak uygulanmalıdır. Çoğu zaman, bu rehyb yoğunluğu sorunları çözer ve çalışma herhangi bir sorun olmadan tekrar başlatılabilir. Bir rehyb sonra şiddetleri hala düşük olan, varsa, sorunu olabilirsentezi (SBS) reaktifleri ve Illumina teknik servis tarafından kütüphaneler veya sırası ile daha fazla sorun giderme için temasa geçilmelidir. Ilk okuma en şiddetleri iyi, ama yoğunlukları etrafında açtıktan sonra düşükse, ikinci okuma astar astar rehyb gerekli olabilir. Bu sıralama enstrüman ve Illumina teknik servis prosedürü için temasa geçilmelidir gerçekleştirilir.
Phasing / prephasing Yüksek: phasing veya prephasing normalden yüksek görülürse, olası bir nedeni dilinim tamponu ile diğer SBS reaktiflerin kirliliğidir. SBS hazırlık adımları sırasında, dilinim tampon son işlemek ve dilinim tampon kullanımı ve diğer reaktifler arasındaki eldivenleri değiştirmek için gereklidir. Yarılma tampon kirlenme şüpheleniliyorsa, akış hücresi bir astar rehyb yapılmalıdır ve yeni bir SBS reaktiflerin hazırlanması gerekmektedir. Alternatif olarak, inst hatları içinde kirlenme olabilir rument. Bu şüpheleniliyorsa, enstrüman bakım yıkama (su son bir suyla yıkayın, ardından bir NaOH yıkama ardından yıkama) yaptırmalıdırlar, astar rehyb akış hücresi üzerinde yapılmalı ve yeni SBS reaktifler hazırlanmalıdır. Phasing / prephasing değerleri (~ 0.5) orta derecede yüksek ise filtre geçirerek S30 puanları ve kümeler hesaplanır kadar vadede devam edilebilir. Bu seviyeler, yine de daha da yüksek fazlama ve / veya prephasing ile kabul edilebilir sınırlar içinde olabilir.
Bu protokol Genellenebilirlik
Bu Illumina HiScanSQ özel olsa da, bu protokol HiSeq aile veya Illumina araçların Genom Analyzer II (herhangi uygulanabilir www.illumina.com küme nesil adımları ve sıralama reaktiflerin küçük değişiklikler ile birlikte). Böyle Solid serisi gibi diğer yeni nesil DNA dizileme platformları ("_blank"> Www.lifetechnologies.com), GS sistemi ( www.454.com ) hem de gelişmekte olan yeni sistemlerde de RNA-seq 11 amacıyla kullanılmıştır. Onların kütüphane yapım ve sıralama işlemleri biraz farklı olabilir, ancak RNA işleme ip uçları, RT-PCR ile veri analizi kısımları (casava adımları aşağı) ve doğrulama kendi RNA-seq uygulamaları referans değeri olabilir bu protokolü sunulmuştur .
Ayrıca bu protokol trombin tedavi HMVEC-LBL hücrelerin bir zaman noktasında RNA-seq özgü olduğuna işaret edilmelidir, ancak kolayca çok zaman noktasında çalışma veya diğer hücrelerde çalışmalara adapte olabilir, dokular ile tedavi farklı uyarı ya da inhibitörleri veya sağlıklı bir devlet ve bir hastalık durumu ile hücre veya dokularda transcriptomes arasında karşılaştırmalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar bizim veri analizi için kendi bilgisayar kümelerinin kullanımı için Çocuk Merhamet Hastaneler ve Klinikler Dr Stephen Kingsmore ve Pediatrik Genom Tıp Merkezi teşekkür etmek istiyorum, Illumina saha servis ekibi (Elizabeth Boyer, Scott Cook ve Mark Cook) ve teknik Onların hızlı tepkiler ve yeni nesil DNA dizileme enstrüman, HiScanSQ ve veri kalitesi analizi çalışmasını yararlı öneriler için danışman ekibi. Bu çalışma Sağlık Hibe HL080042 (SQY için) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenen ve Çocuk Merhamet Hastaneler ve Klinikler start-up fon ve bağış, Kansas City Missouri Üniversitesi (SQY için). Edildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine - Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. | |||
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
- Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
- Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
- Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).
