Summary
该协议提供了一个完整而详细的程序，申请一个功能强大的下一代DNA测序技术，RNA-seq技术，在人肺微血管内皮细胞或无凝血酶治疗的个人资料转录。这个协议是一般化到各种细胞或组织中的影响不同的试剂或疾病状态。
Abstract
通过测量细胞中的mRNA水平的基因表达的特征是确定如何转录机制的细 胞受到外部信号（ 如药物治疗），或不同的细胞如何健康状态和疾病状态之间的一个有用的工具。随着新一代DNA测序技术的出现和不断改进，RNA测序（RNA-seq的）已成为越来越受欢迎的转录组分析的方法进行编目所有种类的成绩单，以确定所有基因表达的转录结构和量化的表达水平的变化在一个给定的细胞，组织或生物体1,2的总组转录。 RNA-Seq是逐渐取代DNA微阵列转录组分析的首选方法，因为它有一个完整的转录组分析的优势，提供一个数字型数据（拷贝数的任何誊本），而不是依靠任何已知的基因组sequenCE 3。
在这里，我们提出了一个完整的，详细的协议，适用个人资料转录RNA-seq的人肺微血管内皮细胞或无凝血酶治疗。该协议是基于我们最近发表的研究报告，题为“RNA-seq的揭示新型转录的基因及其亚型在人肺微血管内皮细胞凝血酶治疗，”4中，我们成功地完成了第一个完整的人肺微血管内皮细胞的转录组分析与凝血酶使用RNA-seq的治疗。进一步的实验，取得了前所未有的资源，获得洞察的分子机制，凝血酶介导的内皮功能紊乱的炎症性疾病，癌症，糖尿病和冠状动脉心脏疾病的发病机制，并为这些疾病的治疗目标，以提供潜在的新的线索。
此协议的描述性文本被分成四个部分。第一部分介绍了人肺微血管内皮细胞的凝血酶和RNA的提取，质量分析和定量分析的治疗。第二部分介绍了图书馆的建设和测序。第三部分描述了数据分析。第四部分描述的RT-PCR验证试验。显示了有代表性的几个关键步骤的结果。在讨论中提供有用的提示或预防措施，以提高成功的关键步骤。虽然该协议使用人肺微血管内皮细胞用凝血酶，它可以是广义在哺乳动物和非哺乳动物的细胞和组织中具有不同刺激物或抑制剂，或在细胞或组织之间的健康状态来比较转录处理的档案中转录和疾病状态。
Protocol
概述本协议的流程图显示在图1。
1。处理过的细胞凝血酶，总RNA的提取，质量评价和定量RNA
- 培养人肺微血管内皮细胞（HMVEC-LBL）90-100％汇合在EGM-2培养基的6孔板中，5％FBS，生长因子和抗生素（龙沙，猫＃CC-3202）。
- 变更媒体饥饿媒体（0％FBS）30分钟前，用凝血酶处理。
- 治疗的细胞用0.05 U / ml凝血酶或留下未处理的作为控制6小时，在37℃和5％CO 2。
- 根据制造商的说明使用Ambion公司的的MIR瓦纳套件组和对照组的细胞，提取总RNA。
- 根据标准协议，在Experion的全自动电泳站（评估质量的RNA与的Experion StdSense真核RNA芯片的=“_blank”>生物技术有限公司www.bio-rad.com）。
- 量化的RNA，使用标准的分光光度测定方法。
2。图书馆的建设和测序
- 使用高品质的每个样品的总RNA作为起始原料的1微克。
- 要构建库，按照标准的程序，从Illumina公司（协议＃15008136修订版A）。在这个协议中，两回合的poly（A）含有基因的选择进行删除rRNA基因，以尽量减少rRNA序列。
- 评估质量的图书馆使用的Experion DNA 1K芯片根据协议在Experion自动电泳站（ 生物技术有限公司www.bio-rad.com ）的标准。
- 使用定量PCR量化库：使用一个库，先前已被测序的标准曲线和特异性引物的连接适配器。未知的库（ 即 1:100，1:500和1:1000）稀释的使用范围。运行的qPCR ACCO富于到的SyberGreen的MM协议，并计算每个库的原始股票的浓度。
- 10纳米和储存在-20°C，直到准备群集流动池稀释库股票。
- 在准备群集流动池，在水浴中解冻CBOT试剂板。 CBOT是一个Illumina公司的仪器，用于简化集群生成过程。
- 洗芝加哥期货交易所的仪器。
- 变性图书馆：联合13微升1×TE和6μl10μM的库，侧管，加入1微升的1 N NaOH（Illumina公司提供）。漩涡，旋转，室温孵育5分钟，放置在冰的变性库。
- 稀释库：用预先冷却的杂交缓冲液中稀释的变性图书馆（HT1，Illumina公司提供）由结合下午12点的最终浓度为996微升HT1和4微升变性库。将冰的变性及摊薄库。
- 反转每一行的CBOT板，管，确保所有试剂融化。自旋向下的板块，删除/穿刺的铝箔密封件，并加载到芝加哥期货交易所。
- 等分的120微升稀释的，变性的图书馆的带状管，标记为1-8。每管加入1.2μl稀释，变性PhiX控制库（Illumina公司）有穗的控制。涡街流量计和旋管，并加载它们在正确的方向芝加哥期货交易所（管＃1在右边）。
- 到芝加哥期货交易所加载的流动池和歧管。
- 完成流量检查，并开始运行的集群。
- 运行完成后，检查试剂提供的所有车道。请注意任何异常。无论是立即开始测序运行流动池或存储在所提供的管，在4℃下
- 解冻合成边测序（SBS，Illumina公司）试剂。
- 装入试剂的试剂盘到适当的位置，确保不要接触到其他试剂接触后的切割组合。
- 使用无N-测序流通池（ 即一个被测序），两次总理的试剂管线。
- 彻底清洁序流通池，用70％的乙醇和Kimwipes，其次是70％的乙醇和镜头纸。检查任何条纹的流动池。重新必要时进行清理。
- 加载到定序器的流动池，执行流量检查，以确保歧管之间的密封和流动池是紧。
- 启动的顺序运行。
- 评估，因为他们成为可用在运行过程中的质量指标（ 如群密度，通过过滤器的集群，Q30，强度）。
- 监视整个运行强度。
- 101周期完成后，执行完成第二次读取周转化学：解冻的的配对末端试剂和第二个读法团缓冲器（ICB，SBS试剂的一个组成部分，Illumina公司）和加载的试剂。
- 继续测序运行，评估第二次读强度，Q30一在运行过程中的第二等质量指标。
3。数据分析
- 使用最新版本的CASAVA（Illumina公司，目前为1.8.2）转换基地调用文件（BCL）文件。fastq文件，fastq簇数为0，以确保每个样品的一个单一的fastq文件的创建。用于下游分析解压缩的fastq的文件。
- 执行成对的末端对齐使用最新版本的顶帽（1.4.1）5，对齐RNA-seq的读取大小的哺乳动物基因组的超高通量短读定位器（蝴蝶结，0.12.7）6和SAMtools（0.1。 17）7。 SAMtools实现各种工具，用于处理后的SAM格式的结盟。参照人类转录组，可以下载从iGenomes（ www.illumina.com ）。在运行的顶帽，我们使用默认的参数设置，包括库类型“选项（默认）FR-unstranded。
- 我们8软件包ING方案CuffDiff的，部分的袖扣（1.3.0），比较凝血酶处理的细胞的控制细胞，筛选出的差异表达的基因转录在前者基于人类基准转录。这种比较检测到的差异表达已知的成绩单。使用Microsoft Excel的可视化结果以表格的形式。在运行袖扣程序，我们使用默认参数设置。这些基因的转录与FPKM <0.05和P> 0.05被过滤掉。
- 检测新亚型，运行袖扣无参考转录。比较样本抄本文件的参考基因组Cuffcompare，用合成凝血酶抄本文件作为一个分析和综合控制的参考基因组转录文件作为参考基因组的第二个分析测试的差异表达Cuffdiff，。使用Microsoft Excel在表格的形式来显示结果。同样，茨艾伦E基因转录与FPKM <0.05和P> 0.05被过滤掉。在这一步之后，研究人员可以选择上传一个新报告的成绩单列表的UCSC基因组浏览器网页（ http://genome.ucsc.edu/ ），通过手动检查以验证其有效性。
- 提交列表中差异表达的基因，以别出心裁的途径分析（IPA， www.ingenuity.com ）为特征的凝血酶治疗的基因和通路的影响。在这个步骤中，调查人员可以选择使用腰带（ http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ）的R套件，旨在帮助和简化的任务分析袖扣RNA-seq的输出，来帮助管理，可视化和整合生产的Cuffdiff分析所有的数据。
4。验证RNA-seq的结果实时定量宝lymerase链反应（定量RT-PCR）
- 执行提取总RNA控制的凝血酶治疗的HMVEC的-LBL细胞中，RNA质量评估和RNA定量描述的步骤1.4至1.6。
- 产生互补DNA来自1微克的总RNA，每个样品的SuperScript III第一链合成系统的RT试剂盒，按照制造商的说明（Invitrogen公司制，18080-051）。
- 一个美国应用生物系统公司VIIA 7实时PCR系统，利用TaqMan分析的需求设计的寡核苷酸检测CUGBP，ELAV likefamilymember1（CELF1，Hs00198069_m1），Fanconianemia，complementationgroupD2（FANDCD2，Hs00276992_m1），TNFreceptor进行定量RT-PCR分析相关因子1（TRAF1，Hs01090170_m1），和β-肌动蛋白（ACTB，Hs99999903_m1）。每个样品有一个相当于5 ng总RNA的模板。测量定量使用DDCT方法和规范，以β-肌动蛋白。每个试验进行过至少3次生物学重复。
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Representative Results
对于步骤1：28秒：18比传统使用的RNA的降解是一个指标。在理想的情况下，28秒峰值应具有约两倍的面积的18带（2）的比率，但是这理想比例往往不能在实践中看到。此外，28秒：18秒从分光光度测定方法得到的比率可以低估的量的RNA的降解。为了更精确地量化的退化，并因此的RNA样品的质量，的Experion系统计算的RNA质量指示符（RQI）号码。 RQI算法RNA样品的电泳图谱进行比较，从一系列的标准化，降解的RNA样品的数据，并自动返回10（完好核糖核酸）和1（降解的RNA）之间的一个数。 RNA的质量应该有一个RQI至少为7，最好大于8， 图2示出了使用高品质的RNA样品与8.4的RQI在Experion结果。
为第2步：图书馆应该有一个广阔的频段在约250-300基点。 图3示出了高品质的图书馆的Experion结果， 图4示出了标准曲线样品和一个未知样品（深蓝色中所示）的qPCR结果。整个运行的测序运行的进度和质量，应不断观察图5显示了相应的集群密度在第一个周期成像步骤，运行质量，这是第一个迹象。集群应该是光明的，重点突出。 图6显示了一垒报告生成后的第一个周期是完整的。在这一点上，重要的是要评估的估计群密度，强度水平，和焦点质量。质量的下一个检查点后，周期4， 图7中所示。这显示了绝对群密度为每车道。的群密度不应该是850公里/毫米2以上。循环13后，相控（不添加碱时，在一个周期内）和prephasing（当两个基地被添加在一个周期内）的统计计算，如在图8中示出。典型值是在0.1和0.25之间。 24个周期，当数质量指标计算后，可能会出现重大质量评估。 ％以上的读取Q30，在图9中所示，是在基座致电的信心的措施。的读操作与一个Q 30分装置，有一个1千基通话错误的机会。的Q分数将减少在运行过程中，但应大于95％的读取达到或超过Q30。的簇通过滤波器（PF）， 如图10中所示，是从实际的序列数据，将采取的集群。理想情况下，这应该是在85％以上。集群PF是基于许多因素，包括逐步取消，prephasing，强度和Q30。它在运行过程中不会改变。百分比对齐（ 步骤3：表1列出控制和凝血酶处理人肺微血管内皮细胞的基因表达和亚型。值得一提的是，有大约26,000新亚型检测到，这说明了实力的RNA-seq的，它可以识别未知的RNA的选择性剪接和替代启动的使用是无法检测的基因芯片技术3。 RNA-seq的，还可以测量低丰度转录，不准确量化或不检测的基因芯片。 图12和表2显示differentiallŸ表达的基因在凝血酶信号转导通路中的。这是基地带动的第三代知识的途径分析：通路的拓扑结构为基础的方法，采用别出心裁的途径分析软件的一个例子。这表明，六Ĥ凝血酶处理显着向上调节凝血酶受体票4并下调凝血酶受体标准杆3的凝血酶受体票1的表达，而没有变化。 NFKB1的表达，NF KB2和Src也显着上调。一些的Rho家族基因（RHO B，C，F，G）上调，而其他人（RHO J，Q，T1，U和V）是下调（ 表4）。肌球蛋白轻链基因（MYL9）上调，而MYL12B下调。其他基因表达的下调，或完全不受影响。 第4步：为了验证RNA-seq的结果，使用另一种方法，我们进行了定量RT-PCR实验检测3迪菲租金基因（ 图13）。 RNA-Seq数据，TRAF1上调7.96倍; CELF1下调了1.16倍;和FANCD2下调1.70倍。在定量RT-PCR数据，这些相应的数字是7.25倍-1.15倍和-2.07倍。这三个基因通过RNA-seq和定量RT-PCR检测的结果是很好的一致性，证实了RNA-seq的结果。 表1中。基因/亚型表达摘要*此表列出了基因，被称为异构体和新亚型表达在控制和凝血酶治疗HMVEC-LBL细胞的。的倍数变化的比例映射的的成绩单perMillion片段（FPKM）来控制FPKM的凝血酶FragmentsPerKilobase的。这些基因，被称为异构体和新的亚型2倍或以上，两组间差异有统计学意义表达水平（Benjamini霍赫贝格修正后确定）。 *此表从参考文献4中的表2被再现。 表2中。基因表达差异与异构体的在凝血酶信号转导通路*。*此表转载自参考文献4 表S4进行了小修改。 **，Q值，一个虚假的发现率调整p值。 93/4393fig1.jpg“ALT =”图1“/> 基因 控制 凝血酶 总的基因表达 16,636 16,357 只控制 783 凝血酶只有 504 上调（2倍或更大的差别） 152 下调（2倍或greater差） 2190 已知的亚型 控制 凝血酶 已知亚型表达 26,807 26,300 只控制 1492 凝血酶只有 985 上调（2倍或更大的差别） 480 下调（相差2倍或以上） 3574 新亚型 控制 凝血酶 总小说异构体的表达 25,880 25,886 只控制 418 凝血酶只有 424 上调（2倍或更大的差别） 1775 下调（相差2倍或以上） 12,202 下调基因 基因符号 总体倍 会员 个人倍 q_value ** FPKM控制 FPKM凝血酶 PLC -2.49 PLCB1 -2.97 0 6.75585 2.27611 PLCB2 -1.32 0.00183634 1.80892 1.36957 PLCB4 -10.04 6.28386E-14 0.682668 0.0679837 PLCL1 -2.53 5.26728E-09 0.602879 0.238017 GAQ -1.87 GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996 盖 -1.56 GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795 GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198 PKC -2.15 PRKCE -1.65 0 9.36364 5.67305 PRKCI -2.14 0 6.63566 3.09818 PRKD3 -2.61 0 16.0215 6.12878 IP3R -2.60 ITPR1 -1.39 0.000018734 1.51592 1.09009 ITPR2 -3.19 0 7.23283 2.26944 CREB -2.36 CREB1 -2.36 0 5.19117 2.2004 GATA -2.33 GATA3 -2.33 0.0228108 0.716773 0.307131 TBP -1.35 TBP -1.35 2.66E-05 8.48689 6.30476 G-蛋白阿尔法 -1.64 GNA14 -1.49 0.000122496 2.78076 1.86573 GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795 GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198 GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996 PAR3 -1.87 F2RL2 -1.87 1.02474E-06 1.51286 0.810286 SOS1 SOS1 -2.27 0 8.94353 3.94679 拉斯 -1.69 KRAS -2.03 0 11.2766 5.5659 NRAS -1.61 0 38.0874 23.6491 AKT -1.77 AKT3 -1.77 0 15.8228 8.94223 MLCP -2.38 PPP1CB -2.10 0 39.585 18.8199 PPP1R12A -3.56 0 15.2274 4.27516 PPP1R12B -2.66 5.28466E-13 1.92123 0.722188 FAK -1.31 PTK2 -1.31 4.3856E-10 39.7935 30.3044 P70 S6K RPS6KB1 -1.99 0 8.46312 ROCK -3.68 ROCK1 -3.54 0 19.5921 5.53112 ROCK2 -3.86 0 16.0054 4.14759 CAMK -1.17 CAMK1 1.30 0.000255587 7.90794 10.296 CAMK2D -1.74 2.22911E-12 11.4497 6.56804 CAMK4 -2.58 0.000619045 0.62714 0.243277 上调基因 符号 总体倍 会员 个人倍 q_value ** FPKM控制 FPKM凝血酶 PAR4 1.59 F2RL3 1.59 9.19043E-13 4.99867 7.9253 SRC 1.47 SRC 1.47 0 14.1085 20.675 NF-kB的 1.65 NFKB1 1.66 0 19.5113 32.3457 NFKB2 2.02 0 28.7563 58.1293 RELA 1.45 0 55.3482 80.28 部分Up-/Partial下调基因 符号 总体倍 会员 个人倍 q_value ** FPKM控制 FPKM凝血酶 G-蛋白GAM妈 1.22 GNG10 -1.34 2.17216E-08 27.192 20.2206 GNG11 1.31 5.66209E-05 770.922 1011.05 GNG12 -1.44 5.11591E-13 112.397 78.3023 GNG2 2.43 6.38453E-09 0.465705 1.13132 G-蛋白β 1.27 GNB2 1.36 1.91268E-10 137.786 187.43 GNB3 -2.69 4.71259E-11 2.58703 0.962504 GNB4 -1.61 0 15.8275 9.85484 卢GEF -1.16 ARHGEF12 -1.67 0 30.6424 18.3015 ARHGEF2 1.33 5.80478E-08 27.6288 36.758 ARHGEF3 -1.48 0 20.3279 13.7813 ARHGEF6 -2.08 0 2.67944 1.28635 ARHGEF9 -1.54 0.00469498 1.56367 1.0159 PI3K -1.80 自动取款机 -6.84 0 4.98972 0.729483 PIK3C2A -5.09 0 17.7894 3.49234 PIK3C3 -1.49 4.66294E-15 12.6504 8.50852 PIK3CA -3.14 0 16.8398 5.36228 PIK3CB -1.36 8.4357E-09 9.68516 7.12129 PIK3CD 1.86 0 5.6579 10.5507 PIK3CG -1.76 2.32945E-10 1.86962 1.06419 PIK3R1 -1.79 0 5.48118 3.06256 PIK3R3 -1.59 1.50915E-05 5.24549 3.30763 PIK3R4 -1.40 7.18425E-12 8.34176 5.97942 卢 1.19 RHOB 1.31 9.48429E-06 232.232 304.587 RHOC 1.38 458.267 630.235 RHOF 1.65 0 8.29676 13.7268 RHOG 1.40 1.02141E-14 58.6003 82.0172 RHOJ -1.57 0 127.446 80.9317 RHOQ -1.52 0 16.4802 10.8122 RHOT1 -1.96 3.00071E-12 8.48834 4.33755 RHOU -1.54 0.00184367 0.900141 0.586092 RHOV -3.32 0.0056467 1 0.413912 0.124591 RND3 -1.95 0 58.0564 29.7075 MLC -1.06 MYL12B -1.43 4.87832E-11 872.075 608.472 MYL9 1.48 0 202.636 299.559
图1。流程图的协议对人肺微血管内皮细胞的凝血酶介导的转录的RNA-seq的分析。首先，处理细胞分离和量化RNA。准备从高品质的RNA库，并评估它们的浓度（通过定量PCR）和质量（通过生物分析仪），然后群集上的流动池。启动测序运行和整个分析运行质量。主要的质量检查点周期1，4，13和24。使用CASAVA，BCL的文件到fastq文件转换，然后再调整的基因组与顶帽。使用袖扣检测已知和未知的异构体和确定差异表达CuffDiff。查看在Excel中的输出文件，并筛选出基因的表达水平小于0.05 FPKM或一个p-值大于0.05。提交剩余的基因以别出心裁的途径分析基因功能的进一步了解和途径一凝血酶治疗ffected通过。通常情况下，选择的差异表达基因的一种替代方法，如定量RT-PCR验证。 
图2。一位代表RNA样品与一个RQI 8.4如由在Experion自动电泳站分析。）高品质的RNA的单个跟踪- x轴描绘的时间和y-轴示出荧光信号B）虚拟凝胶图片的高品质的RNA样品。的28S峰的强度是大于18S的峰值，并且被看作没有污染。这两个频段是雪亮的定义。 点击此处查看大图 。
图3。高品质的制备RNA库的Experion自动电泳分析，检测到250和300个基点之间并没有很高的分子量DNA（DNA污染）观察到一个宽峰A）的单个跟踪的高品质的图书馆- x轴表示时间和y-轴示出荧光信号B）的虚拟凝胶图像的高品质的库。 250和300个基点的宽峰之间是不高的分子量DNA（DNA污染）检测和观察。 点击此处查看大图 。
<图4强。定量PCR的结果使用SyberGreen和特异性引物，以Illumina公司结扎适配器。先前聚集的库作为标准曲线，以确定新的备库的的最优聚类浓度为。未知的库的稀释范围内的标准曲线的浓度。标准曲线样品被起诉的箭头和未知样品是深蓝色和也由箭头表示。
图5。在第一个周期成像步骤。相应的集群密度集群清晰，重点突出，明亮。A）碱基A，B）基地C，C）碱基G D）基地T.
| 公 | 1巷 | | 3巷 | 4巷 | 5巷 | 巷6号 | 7巷 | 8巷 | |
| 群集密度（K /毫米2） | 420.94 | 412.95 | 410.81 | 408.54 | 416.71 | 416.56 | 410.02 | 411.84 |
| 阿强 | 25870.5 | 23886 | 23891.38 | 23735.83 | 23949.38 | 24933.08 | 24305.79 | 23950.29 |
| 时强度 | 21559.62 | 19822.33 | 19759.33 | 19472 | 19954.21 | 20611.75 | <TD> 1989219438.29 | |
| G辉 | 13619.46 | 11756.67 | 11486.44 | 10498.38 | 12186.62 | 12195.5 | 11826.88 | 11010.5 |
| Ţ强度 | 19402.67 | 17663.79 | 17854.42 | 17353.75 | 17545.54 | 18060.67 | 18457.92 | 17397.12 |
| A对焦分数 | 68.2 | 67.46 | 67.67 | 67.75 | 67.41 | 67.43 | 67.63 | 67.05 |
| C聚焦分数 | 67.93 | 67.33 | 67.56 | 67.66 | 67.33 | 67.39 | 67.46 | 66.9 |
| ĝ焦点分数 | 65.4 | 64.14 | 63.98 | 63.92 | 63.29 | 63.41 | 63.47 | 63.74 |
| T重点分数 | 66.45 | 65.57 | 65.5 | 65.49 | 65.03 | 65.23 | 65.57 | 65.59 |
图6。第一相应的报告生成后的第一个周期就完成了。群集密度（虽然在此阶段低估）是适当的。的强度好看（10,000-26,000，与强度最低的ĝ），。的重点分数也合适，下降约65-70更高的价值，虽然也适当。
g7.jpg“ALT =”图7“/>
图7。后群密度计算周期4。群密度低于850 K /毫米2，甚至在所有通道。A）表格的形式，B）曲线图的形式。 点击此处查看大图 。
图8。相位（在一个周期内不加碱）和预相（在一个周期内增加两个基地）。这两个值都在0.25以下，这表明适当的相/相）的相位和数值相B）的相位值曲线图的形式。C）的相位值曲线图的形式。 集团公司 ķ这里查看大图。
图9所示。 Q30分数后第24个周期的不同表示形式。得分为30或更高，表示千分之一的机会，基地的电话是错误的。大约90％的Q分数是30岁以上。A）表格的形式（Q30分数是从整个的运行，通过24个周期）; B）Q30得分周期。每个条形代表读取该特定周期下降在Q30或以上。C）Q30得分通过24个周期分布的分布。通过24个周期的累积分布的Q分数。 Q得分是在x轴方向和以百万计的读取是在y-轴。读与Q30在30以上表示在绿色。oad/4393/4393fig9large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图10。根据多个参数，包括Q30，强度和相/相的不同的表述，通过通过过滤器的过滤器。集群的集群 。至少有85％的集群通过 过滤器在每个泳道A）表格的形式，B）曲线图的形式，蓝色框表示总簇数，绿色方块代表通过过滤器的集群。 点击此处查看大图 。
图11。对齐到的PhiX的基因组中大约有0.5％的簇的簇的百分比对齐到的PhiX的基因组，适用于量的PhiX添加到样品A）表格的形式，B）曲线图的形式。 点击这里查看大图 。
图12。基因差异表达的在凝血酶信号通路中的凝血酶治疗HMVEC-LBL。凝血酶的信号转导通路，构建了别出心裁。在通路中，红色表示上调基因（1.3倍）和绿色下调基因（
图13。三凝血酶处理的HMVEC-LBL RNA-Seq数据的差异表达基因的荧光定量RT-PCR验证。定量RT-PCR在协议中所述进行。折变化确定Ct值的相对TaqMan基因表达测定CUGBP，ELAV类似家庭成员1（CELF1），范可尼贫血，互补组D2（FANCD2）和TNF受体相关因子1（TRAF1）进行比较，以检测RNA-seq的。重复（n = 4时）运行和每个样品的Ct值平均。所有的Ct值进行标准化，以β-肌动蛋白。误差线代表的倍数变化的范围内所确定的数据辅助软件。 P <0.05为差异有统计学意义倍凝血酶治疗组和对照组之间的变化相对RNA-seq和定量RT-PCR检测。由每个检测的mRNA水平在对照组中，任意地设定为一体，未示出。 *，P <0.05; **，P <0.01。再现本图是从图6，在参考文献4。
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Discussion
关键步骤
RNA处理核糖核酸酶会降低，即使是最优质的RNA，因此，护理时必须采取相应的隔离，储存和使用的RNA 10。总是戴手套，以防止污染由核糖核酸酶中发现人的手。手套应经常更换，尤其是接触皮肤后，门把手或其他常见的表面。一组吸液管应专门的RNA工作，所有的技巧和管应无RNA酶。 RNA分离和下游的应用程序，应进行低流量区域，常规的RNase-扎普如与产品去污。也可出现反复冻融循环降解。这可以最大限度地减少下游应用等分RNA后，立即隔离。或者，cDNA可以分离后直接用于下游应用如定量RT-PCR。 RNA应储存在-80℃下，在使用过程中，并保存在冰中。它也是小鬼ortant彻底解冻，涡前和使用过程中的RNA样品。
质量的RNA本协议的成功是必不可少的。低质量的RNA降解或以其他方式使用，可能会导致库准备失败或导致低收益率进行测序，这将是不够的。即使如果有足够多的库可以由退化或低质量的RNA，它不能精确地表示存在于样品中的转录，导致不准确的定量表达。此外，任何未除去的基因组DNA的RNA分离期间可引起的过高估计，在协议中使用的RNA的量，但是，如果在所建议的范围内的中间（0.1-4微克）的量（ 例如 1-2微克）被使用时，实际的RNA量将是足够的协议。此外，任何基因组DNA是不会被拾起的Oligo（dT）引物的图书馆建设标准Illumina公司协议，因此它不会造成下游国际空间站UES的表达mRNA的转录水平。量化的起始RNA使用定期光度法读数应该是足够的，并相对的总数进行归一，就没有必要使用自库将准确定量制备后通过qPCR和基因表达水平的高度准确的定量分析方法，如RiboGreen读取过程中的数据的分析步骤。
图书馆定量分析。准确的量化的库相应的代群是非常重要的。只有DNA分子与成功连接适配器将形成集群。分光读数不会区分DNA与适配器和DNA没有，这将导致在库中的浓度过高估计，并最终导致在流通池集群。的DNA的量没有结扎适配器将从图书馆到库不同，即使相同的RNA作为启动ING材料，所以人们无法准确地假设，一个标准的百分比的分光光度法阅读的DNA与连接的适配器。与适配器的特异性引物，进行定量PCR，将只检测这些DNA分子适配器成功地连接到该分子的两端。这使得一个绝对量化的库和把一个准确的群密度。评估的Experion仪器或生物分析仪的图书馆也很重要。这允许一个可视化的库的大小范围内，这是重要的数据的分析步骤期间，并确保有没有污染，可能会干扰与簇生成。
数据分析。在该协议中，我们采用顶帽，使RNA-seq的人参考转录组和袖扣阅读组装成绩单，估计它们的丰度，并测试在的凝血酶治疗HMVEC-LBL细胞的差异表达。顶帽，袖扣是t禾流行的工具，他们是自由的，开放源码软件11。最近的研究表明，的袖扣有 较高的敏感性和特异性检测先前注明的内含子12。不过，顶帽，袖扣不解决RNA-seq的所有应用程序，也不是他们唯一的工具，RNA-seq的分析11。顶帽和的袖扣要求序列参考转录组和基因组。它们特别适合用于分析RNA-seq的产生的数据从任Illumina的或的SOLiD测序仪但不是454或经典的毛细管电泳测序平台。没有序列参照基因组工作的用户可以考虑进行从头转录装配的使用几个工具，如三位一体（ http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ），跨深渊（ http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2）或绿洲“（ http://www.ebi.ac.uk/〜zerbino /绿洲/ ）的。现在存在许多替代转录组分析。对于不同的程序的调查，读者不妨一读加伯等人的研究中。13和审查马丁和王14，它描述的比较优势和劣势，而目前最常用的程序的理论思考。转录组分析策略（参考为基础的战略，从头策略，并结合战略）和方案的选择取决于许多因素，包括的存在或完整的参考基因组测序和计算资源的可用性，数据的类型设置产生，最重要的是，总体目标的测序计划14。
还有一点需要：合作柴红斌的转录组分析的计划可能不会产生所有的谈话内容报告了100％的准确率。测序错误，是另一个问题。它始终是最好确定任何差异表达的成绩单，通过RNA-seq的实时PCR进行验证。基于TaqMan探针实时PCR化学被认为是黄金标准。此外，新发现的成绩单应该桑格DNA测序方法之前任何进一步的实验来验证。
故障排除
文库制备：一抹黑高分子量的基因组DNA后的文库制备步骤可能是由于进位以上在库准备从最终的磁珠纯化步骤。返回库的磁整整五分钟的立场可能会解决此问题。如果没有，问题可能来自不完整的RNA碎片的文库制备过程中的第一个步骤。这可能发生，如果低使用高质量的RNA，或如果没有完全按照该协议。例如，改变的孵育时间或温度，加入试剂的顺序不正确，或暂停之间的分割和合成的cDNA的第一链。如果返回库的磁立场不删除高MW DNA，最好是重复的文库制备与新鲜的RNA样品。
低强度：如果第一周期强度低于预期值，它是可能的，引物没有杂交的集群簇生成的最后一步或流动池期间正常存放时间过长聚类和测序的开始之间的运行。在这种情况下，应该使用的引物rehyb从Illumina公司的试剂盒的引物的重杂化。最经常的是，此rehyb解决了强度问题，并没有任何问题，可以开始运行。如果一个rehyb后，强度仍然较低，该问题可能是库或序列合成（SBS）试剂和Illumina技术服务，应联系作进一步的故障排除。如果第一次读的强度都不错，但强度低后掉头，一个的底漆rehyb的第二次读取引物可能是必要的。这是进行测序仪和Illumina技术服务的过程中，应联系。
高相/ prephasing：如果高于正常淘汰或prephasing的观察，一个可能的原因是SBS裂解缓冲液试剂与其他的污染。 SBS制备步骤期间，它是必不可少的最后处理的裂解缓冲液和更改的裂解缓冲液的处理和任何其它试剂之间的手套。如果裂解缓冲液污染之嫌，一个的底漆rehyb的流动池的进行，并应准备新的SBS试剂。或者，有可能是污染的INST行 rument。如果对此有怀疑，仪器应进行维护清洗（水洗的NaOH洗，其次是一个最终水洗），底漆rehyb应进行流动池，并应准备新的SBS试剂。如果的相位/ prephasing值的适度高（〜0.5），可以继续运行直到Q30分数和集群通过过滤器来计算。这些水平可能仍然在可接受的范围内，即使在高淘汰及/或prephasing的。
本协议的概
虽然这是特定的的Illumina公司HiScanSQ的，该协议是适用于任何的的HiSeq家庭或基因组分析器II的Illumina的文书（ www.illumina.com ）稍作修改集群生成步骤和测序试剂。其他下一代DNA测序平台，如固系列（“_blank”> www.lifetechnologies.com），GS系统（ www.454.com ）以及一些新兴的较新的系统也采用RNA-seq的11的目的。虽然他们的图书馆建设和测序方法可能略有不同，的RNA处理技巧，数据分析的部分（下游的CASAVA步骤）和RT-PCR验证在本协议中的参考价值RNA-seq的应用程序。
还应当指出，这个协议是特定的RNA-seq的凝血酶处理HMVEC-LBL细胞在一个时间点，但它可以很容易地适合于多时间点研究或在其他细胞的研究，组织用不同的刺激或抑制，或转录在细胞或组织的健康状态和疾病状态之间的比较。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者会喜欢到感谢博士斯蒂芬金斯莫尔和的儿科基因组医学中心儿童慈悲医院和诊所为他们的计算集群为我们的数据分析的，Illumina公司的现场服务团队（伊丽莎白·博耶，斯科特·库克和马克库克）和技术顾问团队，为他们的快速反应和下一代DNA测序仪，HiScanSQ，和数据质量分析的运行有用的建议。这项工作是支持的，部分由美国国立卫生格兰特HL080042（SQY）启动基金和养老的儿童慈善医院和诊所在堪萨斯城，密苏里大学（SQY）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine - Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. | |||
References
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