Summary
Denne protokollen presenterer en komplett og detaljert fremgangsmåte for å søke RNA-seq, en kraftig neste generasjons DNA-sekvensering teknologi, å profilere transcriptomes i menneskelige lunge mikrovaskulære endotelceller med eller uten trombin behandling. Denne protokollen er generalizable til ulike celler eller vev som påvirkes av ulike reagenser eller sykdom stater.
Abstract
Karakterisering av genuttrykk i celler via måling av mRNA er et nyttig verktøy for å bestemme hvordan transcriptional maskineri av cellen blir påvirket av eksterne signaler (f.eks medikamentell behandling), eller hvordan cellene skiller mellom en sunn tilstand og en syk tilstand. Med advent og kontinuerlig forbedring av neste generasjons DNA-sekvensering teknologi, har RNA-sekvensering (RNA-seq) blitt en stadig mer populær metode for transkriptom analyse for å katalogisere alle arter av vitnemål, for å fastslå transcriptional strukturen av alle uttrykte gener og å kvantifisere skiftende uttrykket nivåer av den totale sett av transkripsjoner i en gitt celle, vev eller organisme 1,2. RNA-seq gradvis erstatte DNA mikromatriser som en foretrukket metode for transkriptom analyse fordi den har fordelene ved profilering en komplett transkriptom, gir en digital type datum (kopitall av enhver transkripsjon) og ikke stole på noen kjent genomisk Sekvensce 3.
Her presenterer vi en komplett og detaljert protokoll for å bruke RNA-seq til profilen transcriptomes i menneskelige lunge mikrovaskulære endotelceller med eller uten trombin behandling. Denne protokollen er basert på vår siste publiserte studien med tittelen "RNA-seq avslører Novel transkriptom av gener og deres isoformer i Human Pulmonal mikrovaskulær endotelceller behandlet med trombin," 4 der vi vellykket utført den første komplette transkriptom analyse av menneskelige lunge mikrovaskulære endotelceller behandlet med trombin ved hjelp RNA-seq. Det ga enestående ressurser for videre eksperimentering for å få innsikt i molekylære mekanismene bak trombin-mediert endotelial dysfunksjon i patogenesen av inflammatoriske tilstander, kreft, diabetes, og koronar hjertesykdom, og gir potensielle nye kunder for terapeutiske mål på disse sykdommene.
Den beskrivende teksten av denne protokollener delt i fire deler. Den første delen beskriver behandling av humane pulmonære mikrovaskulære endotelceller med trombin og RNA isolering, kvalitet analyse og kvantifisering. Den andre delen beskriver bibliotek konstruksjon og sekvensering. Den tredje delen beskriver dataanalyse. Den fjerde delen beskriver en RT-PCR validering analysen. Representative resultater av flere viktige trinnene vises. Nyttige tips eller forholdsregler for å øke suksess i viktige skritt er gitt i diskusjonen delen. Selv om denne protokollen bruker humane pulmonære mikrovaskulære endotelceller behandlet med trombin, kan det bli generalisert til profilen transcriptomes i både pattedyr og ikke-pattedyr celler og i vev behandlet med forskjellige stimuli eller inhibitorer eller til sammenligningen transcriptomes i celler eller vev mellom en sunn tilstand og en sykdomstilstand.
Protocol
Et flytdiagram som beskriver denne protokollen vises i figur 1.
1. Behandling av celler med trombin, RNA Isolation, kvalitetsvurdering og Kvantifisering av RNA
- Kultur menneske lunge mikrovaskulær endotelceller (HMVEC-LBL) til 90-100% samløpet i 6-brønners plater i EGM-2 medium med 5% FBS, vekstfaktorer og antibiotika (Lonza, katt # CC-3202).
- Endre medier til sult media (0% FBS) 30 min før behandling med trombin.
- Behandle cellene med 0,05 U / ml trombin eller forlate ubehandlet som en kontroll for 6 timer ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Isolere total RNA fra de behandlede og kontroll celler ved hjelp av Ambion mir Vana kit henhold til produsentens instruksjoner.
- Vurdere kvaliteten av RNA med en Experion StdSense Eukaryot RNA chip i henhold til standard protokoll på Experion Automated Electrophoresis Station (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
- Kvantifisere RNA ved hjelp av en standard spektrofotometrisk metode.
2. Bibliotek Bygg og Sekvensering
- Bruk 1 ug av høykvalitets total RNA per sample som utgangsmateriale.
- Å konstruere biblioteket, følger standard prosedyre fra Illumina (protokoll # 15008136 Rev A). I denne protokollen, to runder av poly (A) som inneholdt mRNA valgene er utført for å fjerne rRNA til minimere rRNA sekvensering.
- Vurdere kvaliteten på bibliotekene ved hjelp av en Experion DNA 1K chip i henhold til standard protokoll på Experion Automated Elektroforese Station ( www.bio-rad.com ).
- Kvantifisere biblioteket ved hjelp qPCR: Bruk et bibliotek som tidligere har blitt sekvensert som en standard kurve og primere spesifikke for de ligatisert adaptere. Bruk en rekke fortynninger av de ukjente bibliotekene (1:100 dvs. 1:500 og 1:1.000). Kjør qPCR according til SyberGreen MM-protokollen og beregne den opprinnelige lager konsentrasjonen av hvert bibliotek.
- Fortynne biblioteket aksjer til 10 nM og oppbevar ved -20 ° C til den er klar til å klynge en flyt celle.
- Når klar å klynge en strømningscelle, tine CBOT reagens plate i et vannbad. CBOT er en Illumina instrument som brukes til å effektivisere klyngen generasjon prosessen.
- Vask CBOT instrument.
- Denature bibliotekene: Kombiner 13 pl 1x TE og 6 pl 10 uM biblioteket og, i den side av røret, tilsett 1 pl 1 N NaOH (leveres av Illumina). Vortex, spinne ned, inkuber ved romtemperatur i 5 min og plassere denaturert bibliotekene på is.
- Fortynn bibliotekene: Fortynn denaturert biblioteker med pre-kjølt hybridiseringsbuffer (HT1, levert av Illumina) ved å kombinere 996 pl HT1 og 4 pl denaturert biblioteket for en endelig konsentrasjon på 12 pm. Plasser denaturerte og fortynnet bibliotekene på is.
- Invertere hver rad med rør CBOT plate,sørge for at alle reagenser er tint. Spinner ned platen, fjerne / punktere folien sel og laste ned på CBOT.
- Delmengde 120 ul av de fortynnede, denaturert bibliotekene til en stripe rør, merket 1-8. Legg 1.2 ul utvannet, denaturert pHix kontroll biblioteket (fra Illumina) i hvert rør som en topp-kontroll. Vortex og spinne ned rør og laste dem på CBOT i riktig retning (tube # 1 til høyre).
- Legg en flyt celle og manifold på CBOT.
- Fullfør flyten kontrollere og begynne clustering løp.
- Etter kjøringen er fullført, sjekk reagens levering over alle baner. Gjøre oppmerksom på noe unormalt. Enten starte sekvensieringen kjøre umiddelbart eller lagre strømningscellen i tilgjengelig røret ved 4 ° C.
- Tine sekvensering-by-syntese (SBS, Illumina) reagenser.
- Laste reagenser til de aktuelle stedene på reagens skuffer, slik at du ikke berører de andre reagenser etter berøring av cleavage mix.
- Ved hjelp av en non-sekvensering strømningscellen (dvs. en som ble sekvensert tidligere), prime de reagens linjene to ganger.
- Rengjør sekvensering strømningscellen med 70% EtOH og Kimwipes, etterfulgt av 70% EtOH og linsepapir. Inspisere strømningscellen for eventuelle streker. Re-rengjør hvis nødvendig.
- Last strømningscellen bort sekvenseren og utføre en flyt sjekk for å sikre at tetningen mellom manifoldene og strømningscellen er stramt.
- Start sekvensering løp.
- Vurdere kvaliteten beregninger (f.eks klyngen tetthet, klynger passerer filteret, Q30, intensitet) som de blir tilgjengelige under kjøringen.
- Overvåke intensiteten i hele oppkjøringen.
- Etter 101 sykluser er fullført, utfører behandlingstid kjemi å fullføre andre les: Tin sammenkoblede end reagenser og andre lese Incorporation Buffer (ICB, en komponent i SBS reagenser, Illumina) og laste reagensene.
- Fortsette sekvensering løp, vurdere to nd lese intensitet, Q30 ennd andre kvalitet beregninger som løp utvikler seg.
3. Dataanalyse
- Bruk den nyeste versjonen av casava (Illumina, for tiden 1.8.2) for å konvertere basen ringe filer (. BCL) filer til. Fastq filer, sette fastq-cluster-count til 0 for å sikre opprettelsen av en enkelt fastq fil for hver prøve . Pakk ut fastq filer for nedstrøms analyse.
- Utfør paret slutten justering med de nyeste versjonene av TopHat (1.4.1) 5, som justerer RNA-seq leser til pattedyr på størrelse genomer ved hjelp av ultra high-throughput kort leste aligner (Bowtie, 0.12.7) 6 og SAMtools (0.1. 17) 7. SAMtools implementerer ulike verktøy for etterbehandling justeringer i SAM-format. Referansen menneskelige transkriptom kan lastes ned fra iGenomes ( www.illumina.com ). I løpende TopHat, vi brukte alle forhåndsinnstillingen av parametrene, inkludert biblioteket typen alternativet som fr-unstranded (standard).
- Ossing programmet CuffDiff, en del av mansjettknapper (1.3.0) 8 programvarepakken, sammenligne trombin-behandlede celler til kontroller cellene til å sile ut de differensielt uttrykt genet transkripsjoner i det tidligere basert på den menneskelige referansen transkriptom. Denne sammenligningen oppdager differensial uttrykk for kjente transkripsjoner. Bruk Microsoft Excel til å visualisere resultatet i tabellform. I går Mansjettknapper programmet brukte vi alle forhåndsinnstillingen av parametrene. Disse genene transkripsjoner med FPKM <0,05 og p> 0,05 filtreres ut.
- For å oppdage nye isoformer, kjører Mansjettknapper uten en referanse transkriptom. Sammenlign prøven karakterutskrift filer til referansen genomet ved hjelp Cuffcompare og teste dette uttrykket med Cuffdiff bruke kombinerte trombin karakterutskrift filer som referanse genom for en analyse og de kombinerte kontroll karakterutskrift filer som referansen genomet for en andre analysen. Bruk Microsoft Excel til å visualisere resultatet i tabellformat. Igjen, Those genet transkripsjoner med FPKM <0,05 og p> 0,05 filtreres ut. Etter dette trinnet, kan etterforskerne velge å laste opp en liste over nylig rapporterte transkripsjoner til UCSC Genome Browser hjemmeside ( http://genome.ucsc.edu/ ) for å bekrefte deres gyldighet av en manuell inspeksjon.
- Send inn lister over differensielt uttrykte gener til Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com ) for karakterisering av gener og trasé berørt av trombin behandling. I dette trinnet kan etterforskerne velge å bruke cummerbund ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), R pakke som er laget for å hjelpe og forenkle oppgaven med å analysere Mansjettknapper RNA-seq utgang, for å administrere, visualisere og integrere alle data produsert av en Cuffdiff analyse.
4. Validering av RNA-seq Resultater av kvantitativ real-time-Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR)
- Utfør total RNA isolert fra kontroll og trombin-behandlede HMVEC-LBL celler, RNA kvalitetsvurdering og RNA kvantifisering beskrevet i trinn 1.4 til 1.6.
- Generer komplementær DNA fra 1 mikrogram total RNA for hver prøve med hevet III Første Strand Synthesis System RT Kits, etter produsentens instruksjoner (Invitrogen, 18080-051).
- Utfør QRT-PCR-analyse på en Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System ved hjelp TaqMan analysen-on-Demand designet oligonukleotider for påvisning av CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -assosiert faktor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1), og β-actin (ACTB, Hs99999903_m1). Hver prøve hadde en mal tilsvarende 5 ng av total RNA. Mål kvantifisering ved hjelp av DDCt metode og normalisering β-actin. Hver analyse ble utført over minst tre biologiske replikater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For Steg 1: 28s: 18s forholdet er tradisjonelt brukt som en indikator på RNA degradering. Ideelt sett bør 28s toppen har omtrent dobbelt område av 18s bandet (et forhold av 2), er imidlertid denne ideelle forholdet ofte ikke sett i praksis. Videre 28S: kan 18s Nøkkeltall framkommet spektrofotometriske metoder undervurderer mengden degradering av RNA. Å mer nøyaktig kvantifisere degradering, og dermed kvaliteten av RNA prøven, beregner Experion systemets en RNA kvalitetsindikator (RQI) nummer. Den RQI algoritmen sammenligner electropherogram av RNA prøver til data fra en rekke standardiserte, degradert RNA prøver og automatisk returnerer et tall mellom 10 (intakt RNA) og 1 (degradert RNA). RNA kvalitet bør ha en RQI på minst 7, ideelt større enn 8. Figur 2 viser Experion resultatene ved hjelp av en høy kvalitet RNA prøve med en RQI på 8,4.
ForTrinn 2: Bibliotekene bør ha et bredt bånd ved ca 250-300 bp Figur 3 viser resultater av en Experion høykvalitets bibliotek Figur 4 viser resultatene av qPCR standardkurve prøver og en ukjent prøve (vist i mørkeblå)... Fremdriften og kvaliteten av sekvenseringen kjøring skal være konstant observert gjennom kjøringen Figur 5 viser passende klyngen tetthet i den første syklusen bildebehandling trinn;. Dette er den første indikasjon på kjøringen kvalitet. Klynger bør være lyse og fokusert. Figur 6 viser den første base Reporter generert etter den første syklusen er fullført. Det er viktig å vurdere den estimerte klyngen tetthet, intensitetsnivåer, og fokus kvalitet på dette punktet. Den neste kvalitet kontrollpunkt, etter syklus 4, er vist i Figur 7. Dette viser den absolutte klyngen tetthet for hvert kjørefelt. Klyngen tetthet bør ikke være over 850 K / mm 2. Etter syklus 13,innfasing (når en base ikke er lagt under en syklus) og prephasing (når to baser tilsettes under en syklus) statistikken er beregnet, som vist i Figur 8. Typiske tall er mellom 0,1 og 0,25. Den store kvalitetsvurdering er mulig etter 24 syklus, når flere kvalitet beregninger beregnes. Prosenten av leser ifølge Q30, vist i figur 9, er et mål på tillit i basen kall. En leser med en Q score på 30 betyr at det er en 1 i 1000 sjanse for at basen samtalen er galt. Q scorene vil minske ettersom kjøre skrider, men skal starte med større enn 95% av den leser møte eller overgå Q30. Klyngene passerer filteret (PF), vist i figur 10, er de klynger hvorfra de faktiske sekvensdata tas. Ideelt sett bør dette være over 85%. Klyngen PF er basert på mange faktorer, blant annet utfasing, prephasing, intensitet og Q30. Det vil ikke endre seg run utvikler seg. Den prosent justert ( For Trinn 3: Tabell 1 presenterer uttrykte gener og isoformer i både kontroll og trombin-behandlede humane lunge mikrovaskulære endotelceller. Spesielt er det om lag 26.000 nye isoformer oppdaget, noe som illustrerer styrken i RNA-seq-det kan identifisere ukjente RNA, alternativt skjøtes transkripsjoner og alternativ promoter bruk som ikke oppdages ved microarray teknikker tre. RNA-seq kan også måle mindre rikelig transkripsjoner som er unøyaktig tallfestet eller ikke oppdaget av mikromatriser. Figur 12 og Tabell 2 skjerm differentially uttrykte gener i trombin signalveien. Dette er et eksempel på tredje generasjon kunnskapsbase-drevet vei analyse 9: pathway topologi tilnærminger, ved hjelp av Ingenuity Pathway Analysis programvare. Det viser at en seks h trombin behandling signifikant opp-regulerer trombin reseptor Par 4 og ned-regulerer trombin reseptor Par 3 mens det er ingen endring i ekspresjonen av trombin reseptor Par 1. Uttrykk for NFkB1, NF kB2 og Src er også betydelig opp-regulert. Noen av Rho familien gener (Rho B, C, F og G) er oppregulert mens andre (Rho J, Q, T1, U og V) er ned-regulert (tabell 4). Myosinlettkjedefosfatase genet 9 (MYL9) er oppregulert mens MYL12B er nedregulert. Uttrykk av andre gener er enten nedregulert eller ikke berørt. For Trinn 4: Å validere RNA-seq resultater ved hjelp av en alternativ tilnærming, utførte vi en QRT-PCR eksperiment for å analysen tre forskjellerleie gener (fig. 13). I RNA-seq data, var TRAF1 oppregulert av 7,96 ganger; CELF1 var nedregulert av 1,16 ganger, og FANCD2 ble nedregulert av 1,70 ganger. I QRT-PCR data, disse tilsvarende tall er 7,25 ganger, -1,15 fold og -2,07 ganger, henholdsvis. Resultatene av disse tre genene analysert ved RNA-seq og QRT-PCR er i god overensstemmelse, som bekrefter de RNA-seq resultater. Tabell 1. Gene / isoform Expression Oppsummering *. Denne tabellen viser gener, kjente isoformer og nye isoformer uttrykt i kontroll og trombin-behandlet HMVEC-LBL celler. Fold endringen er forholdet mellom trombin FragmentsPerKilobase av karakterutskrift perMillion fragmenter kartlagt (FPKM) til å kontrollere FPKM. De genene, kjente isoformer og nye isoformer med to-fold eller større forskjell mellom to grupper har statistisk forskjellige uttrykk nivåer (som bestemmes etter Benjamini-Hochberg korreksjon). * Denne tabellen er gjengitt i tabell 2 i Referanse 4. Tabell 2. Differensielt uttrykte gener og isoformer i Thrombin signalveien *. *, Denne tabellen er gjengitt i tabell S4 i Reference 4 med en mindre endring. **, Q-verdi, en falsk funnrate justert p-verdi. 93/4393fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/> Gener Kontroll Trombin Totalt gener som skal uttrykkes 16636 16357 Styre bare 783 Trombin Kun 504 Oppregulert (2 ganger eller større forskjell) 152 Nedregulert (2-fold eller greater forskjell) 2190 Kjente isoformer Kontroll Trombin Totalt Kjente isoformer Uttrykt 26807 26300 Styre bare 1492 Trombin Kun 985 Oppregulert (2 ganger eller større forskjell) 480 Nedregulert (2 ganger eller større forskjell) 3574 Novel isoformer Kontroll Trombin Totalt Novel isoformer Uttrykt 25880 25886 Styre bare 418 Trombin Kun 424 Oppregulert (2 ganger eller større forskjell) 1775 Nedregulert (2 ganger eller større forskjell) 12202 Nedregulert Genes Gene Symbol Samlet Fold Endre Medlemmer Individuell Fold Endre q_value ** FPKM kontroll FPKM Thrombin PLC -2,49 PLCB1 -2,97 0 6,75585 2,27611 PLCB2 -1,32 0.00183634 1,80892 1,36957 PLCB4 -10,04 6.28386E-14 0.682668 0.0679837 PLCL1 -2,53 5.26728E-09 0.602879 0.238017 Gaq -1,87 GNAQ -1,87 0 24.0907 12.8996 Gai -1,56 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35.7592 24.0198 PKC -2,15 PRKCE -1,65 0 9,36364 5,67305 PRKCI -2,14 0 6,63566 3,09818 PRKD3 -2,61 0 16.0215 6,12878 IP3R -2,60 ITPR1 -1,39 0,000018734 1,51592 1,09009 ITPR2 -3,19 0 7,23283 2,26944 CREB -2,36 CREB1 -2,36 0 5,19117 2,2004 Gata -2,33 GATA3 -2,33 0.0228108 0.716773 0.307131 TBP -1,35 TBP -1,35 2.66E-05 8,48689 6,30476 G-protein Alpha -1,64 GNA14 -1,49 0,000122496 2,78076 1,86573 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35.7592 24.0198 GNAQ -1,87 0 24.0907 12.8996 PAR3 -1,87 F2RL2 -1,87 1.02474E-06 1,51286 0.810286 SOS1 SOS1 -2,27 0 8,94353 3,94679 Ras -1,69 KRAS -2,03 0 11.2766 5,5659 NRAS -1,61 0 38.0874 23.6491 AKT -1,77 AKT3 -1,77 0 15.8228 8,94223 MLCP -2,38 PPP1CB -2,10 0 39.585 18.8199 PPP1R12A -3,56 0 15.2274 4,27516 PPP1R12B -2,66 5.28466E-13 1,92123 0.722188 FAK -1,31 PTK2 -1,31 4.3856E-10 39.7935 30.3044 p70 S6K RPS6KB1 -1,99 0 8,46312 ROCK -3,68 ROCK1 -3,54 0 19.5921 5,53112 ROCK2 -3,86 0 16.0054 4,14759 CAMK -1,17 CAMK1 1,30 0,000255587 7,90794 10.296 CAMK2D -1,74 2.22911E-12 11.4497 6,56804 CAMK4 -2,58 0,000619045 0,62714 0.243277 Up-gener Symbol Samlet Fold Endre Medlemmer Individuell Fold Endre q_value ** FPKM kontroll FPKM Thrombin PAR4 1,59 F2RL3 1,59 9.19043E-13 4,99867 7,9253 Src 1,47 Src 1,47 0 14.1085 20,675 NF-kB 1,65 NFKB1 1,66 0 19.5113 32.3457 NFKB2 2,02 0 28.7563 58.1293 Rela 1,45 0 55.3482 80.28 Partielle Up-/Partial nedregulert Genes Symbol Samlet Fold Endre Medlemmer Individuell Fold Endre q_value ** FPKM kontroll FPKM Thrombin G-protein gamma 1,22 GNG10 -1,34 2.17216E-08 27.192 20.2206 GNG11 1,31 5.66209E-05 770.922 1011,05 GNG12 -1,44 5.11591E-13 112.397 78.3023 GNG2 2,43 6.38453E-09 0.465705 1,13132 G-protein beta 1,27 GNB2 1,36 1.91268E-10 137.786 187,43 GNB3 -2,69 4.71259E-11 2,58703 0.962504 GNB4 -1,61 0 15.8275 9,85484 Rho GEF -1,16 ARHGEF12 -1,67 0 30.6424 18.3015 ARHGEF2 1,33 5.80478E-08 27.6288 36.758 ARHGEF3 -1,48 0 20.3279 13.7813 ARHGEF6 -2,08 0 2,67944 1,28635 ARHGEF9 -1,54 0.00469498 1,56367 1,0159 PI3K -1,80 Minibank -6,84 0 4,98972 0.729483 PIK3C2A -5,09 0 17.7894 3,49234 PIK3C3 -1,49 4.66294E-15 12.6504 8,50852 PIK3CA -3,14 0 16.8398 5,36228 PIK3CB -1,36 8.4357E-09 9,68516 7,12129 PIK3CD 1.86 0 5,6579 10.5507 PIK3CG -1,76 2.32945E-10 1,86962 1,06419 PIK3R1 -1,79 0 5,48118 3,06256 PIK3R3 -1,59 1.50915E-05 5,24549 3,30763 PIK3R4 -1,40 7.18425E-12 8,34176 5,97942 Rho 1,19 RHOB 1,31 9.48429E-06 232.232 304.587 RHOC 1,38 458.267 630.235 RHOF 1,65 0 8,29676 13.7268 RHOG 1,40 1.02141E-14 58.6003 82.0172 RHOJ -1,57 0 127.446 80.9317 RHOQ -1,52 0 16.4802 10.8122 RHOT1 -1,96 3.00071E-12 8,48834 4,33755 RHOU -1,54 0.00184367 0.900141 0.586092 RHOV -3,32 0.0056467 1 0.413912 0.124591 RND3 -1,95 0 58.0564 29.7075 MLC -1,06 MYL12B -1,43 4.87832E-11 872.075 608.472 MYL9 1,48 0 202.636 299.559
Figur 1. Flytdiagram av protokollen for RNA-seq profilering av trombin-mediert transkriptom i menneskelige lunge mikrovaskulære endotelceller. Først behandle celler og isolere og kvantifisere RNA. Forbered biblioteker fra høy kvalitet RNA og vurdere deres konsentrasjon (via qPCR) og kvalitet (via en Bioanalyzer), deretter klynge på en flyt celle. Start sekvensering kjøre og analysere kvaliteten av run i hele. De store kvalitet sjekkpunkter er sykluser 1, 4, 13 og 24. Bruke casava, konvertere BCL filer til fastq filer og deretter justere dem til genomet med TopHat. Oppdage kjente og ukjente isoformene med mansjettknapper og bestemme differensial uttrykk med CuffDiff. Vis utdatafiler i Excel og filtrere ut gener som har et uttrykk nivå mindre enn 0,05 FPKM eller en p-verdi større enn 0,05. Send inn de resterende gener til Ingenuity Pathway Analysis for ytterligere informasjon om genfunksjoner og pathways enffected av trombin behandling. Vanligvis valgt sett av forskjellig uttrykt gener er validert av en alternativ tilnærming som Qrt-PCR. 
Figur 2. Et representativt RNA prøve med en RQI av 8,4 som analysert ved Experion Automated Elektroforese Station A) Den enkelte spor av høykvalitets RNA -.. X-aksen viser tid, og y-aksen viser fluorescerende signal B) Det virtuelle gel bilde av en høy kvalitet RNA prøven. Intensiteten av 28S topp er større enn 18S peak og ingen kontaminering er sett. Begge bandene er skarpe og definerte. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Høykvalitative biblioteket fremstilt fra RNA som analysert av Experion Automated Elektroforese Station En bred topp mellom 250 og 300 bp detekteres og ingen høy molekylvekt DNA (forurensende DNA) er observert A) Den enkelte spor av en høy kvalitet bibliotek.. - x-aksen viser tid, og y-aksen viser fluorescerende signal B) Det virtuelle gel bilde av en høykvalitets bibliotek. En bred topp mellom 250 og 300 bp er oppdaget og ingen høy molekylvekt DNA (forurensende DNA) er observert. Klikk her for å se større figur .
<strong> Figur 4. qPCR resultatene med SyberGreen og primere spesifikke for Illumina ligert adaptere. En tidligere gruppert biblioteket brukes som standard kurve for å bestemme den optimale clustering konsentrasjon for den nylig utarbeidet biblioteket. Fortynningen av ukjente biblioteket faller innenfor standardkurven konsentrasjoner. Standardkurven Prøvene tiltalt av pilene og den ukjente prøven er mørk blå og også indikert med en pil.
Figur 5. . Riktig klynge tetthet i første syklus bildebehandling trinn De klyngene er klar, fokusert og lyse A) Base A;. B) Base C, C) Base G, D) Base T.
| Metric | Lane 1 | | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Lane 7 | Lane åtte | |
| Cluster Tetthet (k / mm 2) | 420,94 | 412,95 | 410,81 | 408,54 | 416,71 | 416,56 | 410,02 | 411,84 |
| En Intensitet | 25870,5 | 23886 | 23891,38 | 23735,83 | 23949,38 | 24933,08 | 24305,79 | 23950,29 |
| C Intensitet | 21559,62 | 19822,33 | 19759,33 | 19472 | 19954,21 | 20611,75 | <td> 1989219438,29 | |
| G Intensity | 13619,46 | 11756,67 | 11486,44 | 10498,38 | 12186,62 | 12195,5 | 11826,88 | 11010,5 |
| T Intensity | 19402,67 | 17663,79 | 17854,42 | 17353,75 | 17545,54 | 18060,67 | 18457,92 | 17397,12 |
| En Focus Resultat | 68,2 | 67.46 | 67.67 | 67.75 | 67.41 | 67.43 | 67.63 | 67.05 |
| C Focus Resultat | 67.93 | 67.33 | 67.56 | 67.66 | 67.33 | 67.39 | 67.46 | 66,9 |
| G Focus Resultat | 65,4 | 64.14 | 63.98 | 63.92 | 63.29 | 63.41 | 63.47 | 63.74 |
| T Focus Resultat | 66.45 | 65.57 | 65,5 | 65.49 | 65.03 | 65.23 | 65.57 | 65.59 |
Figur 6. Den første base Reporter generert etter den første syklusen er fullført. Klyngen tettheten (selv undervurdert på dette stadiet) er hensiktsmessig. Intensiteten ser bra (10,000-26,000, med G har den laveste intensitet). Fokuset score er også hensiktsmessig, faller rundt 65-70, men høyere verdier er også aktuelt.
g7.jpg "alt =" Figur 7 "/>
Figur 7. Klyngen tetthet beregnet etter syklus 4 Klyngen tetthet er lavere enn 850 k / mm 2, og selv på tvers av alle baner A) Tabellvisning form;... B) Graph skjema Klikk her for å se større figur .
Figur 8. Innfasing (ikke legge en base under en syklus) og Pre-utfasing (legge to baser i løpet av en syklus). Begge verdier er på 0,25 eller lavere, noe som indikerer egnede innfasing / pre-utfasing nivåer. A) innfasing og pre-utfasing tallverdier . B) innfasing verdier i form av kurver. C) før innfasing verdier i form av kurver. Clic k her for å se større figur.
Figur 9. De ulike representasjoner av Q30 score etter syklus 24. En score på 30 eller høyere indikerer en 1 i 1000 sjanse for at basen samtalen er galt. Rundt 90% av Q score er over 30 A) tabellform (Q30 score her er fra helheten av kjøringen, gjennom syklusen 24);. B) Q30 score etter syklus. Hver stolpe representerer fordelingen av leser falle på Q30 eller over for den aktuelle syklus. C) Q30 poengsum distribusjoner gjennom syklusen 24. Fordelingen av Q score på en kumulativ basis gjennom syklus 24. Q score er på x-aksen, og millioner av lesninger er på y-aksen. Leser med en Q30 over 30 er representert i grønt.oad/4393/4393fig9large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 10. De ulike representasjoner av klynger passerer filteret. Clusters passerer filteret er basert på flere parametere, inkludert Q30, intensitet og innfasing / pre-utfasing. Er minst 85% av klyngene passerer filteret i hvert kjørefelt A) Tabellvisning form;. B) Graph form, blå boksene representerer det totale antall klynger, grønne boksene representerer klyngene passerer filtre. Klikk her for å se større figur .
Figur 11. . Prosenten av klyngene justert til pHix genomet Omtrent 0,5% av klyngene justere til pHix genomet, passende for mengden pHix tilsatt i prøvene A) Tabellvisning form;.. B) Graph skjema Klikk her for å se større figur .
Figur 12. Gener differensielt uttrykt ved trombin behandling av HMVEC-LBL i Thrombin signalveien. Den Thrombin signalveien ble bygget av oppfinnsomhet. I veien, indikerer rød farge opp-gener (3 1,3 ganger) og grønne nedregulert gener (
Figur 13. QRT-PCR validering av tre forskjellig uttrykt gener fra trombin-behandlet HMVEC-LBL RNA-seq data. QRT-PCR ble utført som beskrevet i protokollen. Fold endringer bestemt fra de relative Ct verdier av TaqMan Gene Expression assay for CUGBP, Elav-lignende familiemedlem 1 (CELF1), Fanconi anemi, komplementering gruppe D2 (FANCD2) og TNF reseptor-assosiert faktor 1 (TRAF1)ble sammenlignet med de som påvises av RNA-seq. Replikater (n = 4) av hver prøve ble kjørt og Ct-verdier gjennomsnitt. Alle Ct-verdier ble normalisert til β-actin. Feilfeltene representerer utvalg av fold endring som bestemmes av Data Assist programvare. p <0,05 ble ansett som statistisk signifikant i relative fold endringer mellom trombin-spandere og en kontrollgruppe av både RNA-seq og QRT-PCR-analyser. MRNA nivået i kontrollgruppene etter hver analyse ble vilkårlig satt til en, som ikke er vist. *, P <0,05; **, p <0,01. Dette tallet er reprodusert fra figur 6 i Referanse 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viktige skritt
RNA Håndtering: RNases vil forringe selv de mest høy kvalitet RNA, og derfor må tas i løpet av isolasjon, lagring og bruk av RNA 10. Hansker er alltid slitt for å hindre forurensning av RNases funnet på menneskehender. Hansker bør skiftes ofte, spesielt etter å berøre huden, doorknobs eller andre vanlige overflater. Et sett av pipetter skal være dedikert utelukkende til RNA arbeid og alle tips og rør bør være RNase-frie. RNA isolering og nedstrøms søknaden bør utføres i lav trafikk områder som rutinemessig dekontamineres med et produkt som RNase-Zap. Degradering kan også oppstå med gjentatte fryse-tine sykluser. Disse kan minimeres ved aliquoting RNA for nedstrøms applikasjoner umiddelbart etter isolasjon. Alternativt kan cDNA bli gjort for nedstrøms applikasjon som QRT-PCR direkte etter isolering. RNA bør oppbevares ved -80 ° C og holdt på is under bruk. Det er også important å grundig tine og virvle RNA prøver før og under bruk.
Den starter kvaliteten på RNA er avgjørende for å lykkes i denne protokollen. Bruk av degradert eller ellers lav kvalitet RNA kan føre til at biblioteket forberedelse mislykkes eller resultere i lavt utbytte som vil være utilstrekkelig for sekvensering. Selv hvis nok biblioteket kan være laget av degradert eller lav kvalitet RNA, vil den ikke nøyaktig representerer transkripsjonene tilstede i prøven, noe som resulterer i unøyaktige kvantifisering av uttrykk. Dessuten kan en hvilken som helst genomisk DNA unremoved under RNA isolering føre til en over-estimering av mengden av RNA som brukes i protokollen, men hvis et beløp (f.eks 1-2 mikrogram) i midten av den foreslåtte spekter (0,1 til 4 ug) brukes, vil den faktiske mengden RNA være tilstrekkelig for protokollen. I tillegg er noen genomisk DNA ikke sannsynlig å bli plukket opp av oligo (dt) primer basert bibliotek bygging i standard Illumina-protokollen, og dermed vil det ikke føre til nedstrøms issverdiene med uttrykt mRNA transkript nivåer. Kvantifiseringen av utgangsforbindelsene RNA ved hjelp av vanlige spektrofotometriske avlesninger bør være tilstrekkelig, og det er ikke nødvendig å bruke meget nøyaktige kvantitative metoder som RiboGreen siden bibliotek vil bli nøyaktig kvantifisert etter forberedelse av qPCR og genuttrykk nivåer blir normalisert i forhold til det totale antall leser under dataanalyse trinnene.
Bibliotek Kvantifisering. Nøyaktig kvantifisering av bibliotekene er avgjørende for riktig generasjon av klynger. Kun DNA-molekyler med vellykket ligeres adaptere vil danne klynger. Spektrofotometriske avlesninger vil ikke skille mellom DNA med adaptere og DNA uten, noe som vil resultere i en over-estimering av konsentrasjonen av biblioteket og til slutt resultere i under-gruppering av strømningscellen. Mengden av DNA uten ligert adaptere vil være forskjellig fra biblioteket til biblioteket, selv om de samme RNA ble brukt som starting materiale, slik at en ikke kan nøyaktig anta at en standard prosentandel av spektrofotometrisk lesing er DNA med ligatisert adaptere. Utføre qPCR med primere spesifikke for adaptere vil oppdage bare de DNA-molekyler med adaptere hell ligert til begge ender av molekylet. Dette gir en absolutt kvantifisering av bibliotekene og i sin tur en nøyaktig klynge tetthet. Vurdering av bibliotekene med et Experion instrument eller en Bioanalyzer er også viktig. Dette tillater en visualisering av størrelsesområdet av biblioteket, som er viktig i de dataanalyse trinnene, og sikrer at det ikke er noen forurensning som kan forstyrre klynge generasjon.
Dataanalyse. I denne protokollen, søkte vi TopHat å justere RNA-seq leser til menneskelig referanse transkriptom og mansjettknapper å montere transkripsjoner, anslå sine abundances, og test for dette uttrykket i trombin-behandlede HMVEC-LBL celler. TopHat og Mansjettknapper er two populære verktøy, og de er gratis, open-source programvare 11. En fersk studie viste at Mansjettknapper hadde en høy sensitivitet og spesifisitet for å påvise tidligere kommenterte introner 12. Men ikke TopHat og mansjettknapper ikke ta alle anvendelser av RNA-seq de er heller ikke de eneste verktøyene for RNA-seq analyse 11. TopHat og Mansjettknapper krever en sekvensert referanse transkriptom eller genom. De er spesielt egnet for analyse av RNA-seq data generert fra enten Illumina eller solid sekvensering maskiner men ikke 454 eller den klassiske kapillær elektroforese sekvenseringsplattformen. Brukere som arbeider uten en sekvensert referanse genom kan vurdere å utføre de novo transkriptom montering ved hjelp av en av flere verktøy som Trinity ( http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), Trans-Abyss ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) eller Oaser ( http://www.ebi.ac.uk/ ~ zerbino / oaser / ). Mange alternative transkriptom analyse programmer nå eksisterer. For en oversikt over ulike programmer, kan leserne ønsker å lese studien ved Garber et al. 13 og gjennomgangen av Martin og Wang 14, som beskriver komparative fordeler og ulemper og teoretiske betraktninger til de fleste i dag, og ofte brukte programmer. Valget av transkriptom analyse strategier (referanse-basert strategi, de novo strategi, og kombinert strategi) og programmer avhenger av mange faktorer, blant annet eksistensen eller fullstendigheten av en referanse genom, tilgjengeligheten av sekvensering og databehandlingsressurser, type datasett generert og, aller viktigst, den overordnede målet med sekvensering prosjektet 14.
Et annet punkt bør gjøres: computer programmer for transkriptom analyse kan ikke gi en 100% nøyaktighet av all karakterutskrift rapportering. Sekvensering feil er en annen bekymring. Det er alltid tilrådelig at noen differensielt uttrykt transkripsjon identifisert av RNA-seq godkjennes av real-time PCR. TaqMan probe-basert kjemi regnes som gullstandarden for sanntids PCR. I tillegg bør nylig identifiserte transkripsjoner skal godkjennes av Sanger-metoden av DNA-sekvensering før ytterligere eksperimentering.
Feilsøking
Bibliotek Forberedelse: En smøre med høy molekylvekt genomisk DNA etter bibliotekets forberedelse trinn kan være forårsaket av en bære-over fra den endelige bead rensingen under biblioteket forberedelse. Returnere bibliotekene til den magnetiske stå for en full fem minutter kan løse problemet. Hvis ikke, kan problemet stammer fra ufullstendig fragmentering av RNA de første trinnene i biblioteket forberedelse. Dette kan skje hvis lav-kvalitet RNA brukes eller om protokollen ikke fulgt nøyaktig. For eksempel, å endre inkubasjonstidene eller temperatur, legge reagenser i feil rekkefølge eller pause mellom fragmentering og syntese av den første kjede av cDNA. Hvis tilbake bibliotekene på det magnetiske stativet ikke fjerner den høye MW DNA, er det tilrådelig å gjenta biblioteket forberedelse med ferske RNA prøver.
Lav intensitet: Hvis den første syklusen intensiteten er lavere enn forventet, er det mulig at primerne ikke hybridisere til klyngene riktig under det siste trinnet av klyngen generasjon eller strømningscellen ble lagret for lenge mellom clustering og starten av sekvenseringen kjøre. I dette tilfellet bør en primer rehybridization utføres ved hjelp av en primer rehyb kit fra Illumina. Oftest, løser dette rehyb intensiteten problemer og kjøre kan startes over uten problem. Dersom det etter en rehyb, intensiteten er fortsatt lave, kan problemet væremed bibliotekene eller sekvensen ved syntese (SBS) reagenser og Illumina teknisk service bør kontaktes for ytterligere feilsøking. Hvis den første Read intensiteter er god, men intensitetene er lav etter snu, kan en primer rehyb av andre lese primeren være nødvendig. Dette er utført på sekvensering instrument og Illumina teknisk service bør kontaktes for prosedyren.
Høy innfasing / prephasing: Hvis høyere enn normalt innfasing eller prephasing er observert, er en mulig årsak til forurensning av de andre SBS reagenser med cleavage buffer. Under SBS forberedelse trinn, er det viktig å behandle cleavage buffer sist og endre hansker mellom håndtering av spalting buffer og eventuelle andre reagenser. Hvis cleavage buffer forurensning mistenkes, bør en primer rehyb av strømningscellen utføres og nye SBS reagenser bør være forberedt. Alternativt kan det være forurensning i linjene i inst rument. Hvis dette mistenkes, bør instrumentet gjennomgå en vedlikeholdsvask (en vannvask etterfulgt av en NaOH vask, etterfulgt av en avsluttende vannvask), bør en primer rehyb utføres på strømningscellen og nye SBS reagenser skal utarbeides. Hvis innfasing / prephasing verdier er moderat høy (~ 0,5), kan kjøre videreføres inntil de Q30 score og klynger passerer filteret beregnes. Disse nivåene kan fortsatt være i akseptable grenser selv med høy innfasing og / eller prephasing.
Allmenngyldighet denne protokollen
Mens det er spesifikt for Illumina HiScanSQ, er denne protokollen gjelder for noen av HiSeq familien eller Genome Analyzer II av Illumina instrumenter ( www.illumina.com ) med mindre modifikasjoner av klyngen generasjon trinn og sekvensering reagenser. Andre neste generasjons DNA sekvensering plattformer som Solid-serien ("_blank"> Www.lifetechnologies.com), GS-systemer ( www.454.com er) samt noen fremvoksende nyere systemer også anvendes med det formål å RNA-seq 11. Selv om deres bibliotek konstruksjon og sekvensering prosedyrer kan være litt forskjellig, RNA håndtering tips, dataanalyse deler (nedstrøms av casava trinn) og validering av RT-PCR presentert i denne protokollen kan være av referanseverdi til sine RNA-seq applikasjoner .
Det bør også påpekes at denne protokollen er spesifikk for RNA-seq på ett tidspunkt av trombin-behandlede HMVEC-LBL celler, men det kan lett tilpasses til en multi-tidspunkt studier eller undersøkelser i andre celler, vev behandlet med ulike stimuli eller hemmere, eller sammenligninger av transcriptomes i celler eller vev mellom en sunn tilstand og en sykdomstilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke dr. Stephen Kingsmore og Pediatric Genome Medicine Center på Barnas Mercy Sykehus og klinikker for bruk av deres databehandling klynger for våre data analyse, Illumina er felt service team (Elizabeth Boyer, Scott Cook og Mark Cook) og teknisk konsulent team for sine raske svar og nyttige forslag om driften av neste generasjon DNA-sekvensering instrument, HiScanSQ, og datakvalitet analyse. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health Grant HL080042 (til SQY) og oppstart fond og legat av barns Mercy Sykehus og klinikker, University of Missouri i Kansas City (til SQY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine - Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. | |||
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
- Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
- Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
- Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).
