Summary
Este protocolo apresenta um procedimento completa e detalhada para aplicar RNA-seq, uma tecnologia de DNA poderoso próxima geração de sequenciação, de transcriptomas de perfil em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares, com ou sem tratamento com trombina. Este protocolo é generalizável a várias células ou tecidos afetados por reagentes ou estados diferentes doenças.
Abstract
A caracterização da expressão do gene em células por meio de medição de níveis de mRNA é uma ferramenta útil na determinação de como a maquinaria transcricional da célula é afectada por sinais externos (por exemplo, tratamento com drogas), ou como células diferem entre um estado saudável e de um estado de doença. Com o advento e aperfeiçoamento contínuo da próxima geração de tecnologias de sequenciação de DNA, RNA-sequenciação (RNA-seq) tornou-se um método cada vez mais popular de análise do transcriptoma para catalogar todas as espécies de transcritos, para determinar a estrutura da transcrição de todos os genes expressos e quantificar os níveis de expressão de mudar o conjunto total de transcritos de 1,2 um tecido, célula ou organismo determinado. RNA-seq está a substituir gradualmente microarranjos de DNA como um método preferido para a análise do transcriptoma porque tem as vantagens de um perfil transcriptoma completa, proporcionando um dado tipo digital (número de cópias de qualquer transcrição) e não se basear em qualquer sequen genómico conhecidoce 3.
Aqui, apresentamos um protocolo completo e detalhado para aplicar RNA-seq para transcriptomas perfil em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares com ou sem tratamento de trombina. Este protocolo é baseado em nosso estudo recente publicado intitulado "RNA-seq revela Transcriptoma Novel de genes e suas isoformas em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares Tratados com trombina," 4 em que realizaram com sucesso a primeira análise completa do transcriptoma humano pulmonares células endoteliais microvasculares tratado com trombina usando RNA-seq. Ele rendeu recursos sem precedentes para a experimentação ainda mais para obter insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes trombina mediada disfunção endotelial na patogênese de doenças inflamatórias, câncer, diabetes e doença cardíaca coronária, e fornece novas pistas para potenciais alvos terapêuticos para essas doenças.
O texto descritivo deste protocoloé dividido em quatro partes. A primeira parte descreve o tratamento de humanos pulmonares células endoteliais microvasculares com trombina e isolamento de ARN, análise de qualidade e de quantificação. A segunda parte descreve a construção da biblioteca e seqüenciamento. A terceira parte descreve a análise de dados. A quarta parte descreve um ensaio de RT-PCR de validação. Os resultados representativos de vários passos-chave são exibidos. Dicas úteis ou precauções para impulsionar o sucesso em passos-chave são fornecidos na seção de Discussão. Embora este protocolo utiliza humanas pulmonares células endoteliais microvasculares tratados com trombina, pode ser generalizado para transcriptomas perfil em ambas as células de mamíferos e não mamíferos e dos tecidos tratados com diferentes estímulos ou inibidores, ou para comparar transcriptomas em células ou tecidos entre um estado saudável e um estado de doença.
Protocol
Um fluxograma descrevendo este protocolo é mostrado na Figura 1.
1. O tratamento de células com trombina, RNA Isolation, Quality Assessment e Quantificação de RNA
- Cultura As células endoteliais microvasculares de pulmão humano (HMVEC-LBL) a 90-100% de confluência em placas de 6 poços em meio EGM-2 com 5% de FBS, factores de crescimento e antibióticos (Lonza, cat # CC-3202).
- Alterar media para os meios de comunicação de fome (0% de FBS) 30 min antes do tratamento com trombina.
- Tratar as células com 0,05 U / ml de trombina ou deixar sem tratamento como um controlo durante 6 horas a 37 ° C e 5% CO 2.
- Isolar o RNA total a partir das células tratadas e de controlo, usando o Ambion mir Vana kit de acordo com as instruções do fabricante.
- Avaliar a qualidade do RNA com uma Eukaryotic StdSense Experion chip de RNA de acordo com o protocolo padrão na Estação Electrophoresis Experion (Automated= "_blank"> Www.bio-rad.com).
- Quantificar o ARN utilizando um método padrão espectrofotométrico.
2. Construção de biblioteca e Sequenciamento
- Use de 1 ug de ARN total de elevada qualidade por exemplo como material de partida.
- Para construir a biblioteca, seguir o procedimento padrão da Illumina (protocolo n º 15008136 Rev. A). Neste protocolo, duas rodadas de poli (A) de ARNm contendo selecções são realizadas para remover rRNA para minimizar a sequenciação de rRNA.
- Avaliar a qualidade das bibliotecas utilizando um chip de ADN Experion 1K de acordo com o protocolo padrão na Estação Electrophoresis Experion automatizada ( www.bio-rad.com ).
- Quantificar a biblioteca utilizando qPCR: Usar uma biblioteca que tenha sido previamente sequenciados como uma curva padrão e iniciadores específicos para os adaptadores ligados. Utilizar uma gama de diluições das bibliotecas desconhecidas (por exemplo, 1:100, 1:500 e 1:1000). Execute o acco qPCRrding com o protocolo MM SyberGreen e calcular a concentração original de estoque de cada biblioteca.
- Diluir os stocks de biblioteca de 10 nM e armazenar a -20 ° C até estar pronto para agrupar uma célula de fluxo.
- Quando estiver pronto para agrupar uma célula de fluxo, descongelar a placa reagente CBOT num banho de água. CBOT é um instrumento utilizado Illumina para agilizar o processo de geração de cluster.
- Lavar o instrumento CBOT.
- Desnaturar as bibliotecas: Combinar 13 ul de 1x TE e 6 uM biblioteca ul 10 e, para o lado do tubo, adicionar 1 ml de NaOH 1 N (fornecido pela Illumina). Vortex, girada para baixo, incubar à temperatura ambiente durante 5 min e colocar as bibliotecas desnaturados em gelo.
- Diluir as bibliotecas: Diluir as bibliotecas desnaturados com pré-gelada de tampão de hibridação (HT1, fornecido pela Illumina) através da combinação de 996 ul HT1 e 4 uL biblioteca desnaturado para uma concentração final de 12 pM. Coloque as bibliotecas desnaturados e diluído em gelo.
- Inverter cada fila de tubos da placa CBOT,assegurar que todos os reagentes são descongeladas. Girar a placa, remover / punção os selos tiras e coloque sobre a CBOT.
- Ul alíquota 120 das bibliotecas diluídas, desnaturados para um tubo de tira, rotulado 1-8. Adicionar 1,2 uL diluído, biblioteca de controle PhiX desnaturado (de Illumina) em cada tubo como uma espiga de controle. Vortex e girar os tubos e carregá-los na CBOT na orientação correta (tubo n º 1 para a direita).
- Carregar uma célula de fluxo e colector para a CBOT.
- Completar o fluxo de verificar e começar a corrida de agrupamento.
- Após a corrida é completa, veja a entrega de reagente em todas as pistas. Tome nota de quaisquer anormalidades. Quer iniciar a execução de sequenciação imediatamente ou armazenar a célula de fluxo no tubo desde a 4 ° C.
- Descongele o seqüenciamento por síntese (SBS, Illumina) reagentes.
- Coloque os reagentes para os pontos apropriados nas bandejas de reagentes, tomando cuidado para não tocar os outros reagentes depois de tocar o mix de clivagem.
- Usando um nãon-seqüenciamento célula de fluxo (isto é, que foi sequenciado anteriormente), principais linhas de reagente duas vezes.
- Limpar completamente a célula de fluxo de sequenciação com EtOH a 70% e Kimwipes, seguido de EtOH a 70% e de papel de lente. Inspecione a célula de fluxo para qualquer fiapo. Re-limpá-lo, se necessário.
- Carregar a célula de fluxo para o sequenciador e executar um fluxo de verificação para assegurar que a vedação entre os tubos de distribuição e a célula de fluxo é apertado.
- Iniciar a execução seqüenciamento.
- Avaliar as métricas de qualidade (por exemplo, a densidade de cluster, clusters de passar filtro, Q30, intensidade), como eles se tornam disponíveis durante a corrida.
- Monitorar a intensidade em toda a corrida.
- Após 101 ciclos são concluídos, realizar a química de retorno para completar a segunda leitura: Descongelar os reagentes finais emparelhadas e o buffer de Incorporação segunda leitura (ICB, um componente do SBS reagentes, Illumina) e carregar os reagentes.
- Continuar a corrida seqüenciamento, avaliando 2 ª leitura intensidade, um Q30nd outras métricas de qualidade como os avanços de execução.
3. Análise de Dados
- Use a versão mais recente do casava (Illumina, atualmente 1.8.2) para converter os arquivos de base de chamada (. Bcl) arquivos em arquivos. Fastq, estabelecendo fastq-cluster contagem a 0 para garantir a criação de um arquivo fastq único para cada amostra . Descompactar os arquivos fastq para análise a jusante.
- Realizar o alinhamento final emparelhado utilizando as mais recentes versões do TopHat (1.4.1) 5, que alinha RNA-seq lê para mamíferos de tamanho genomas usando o ultra high-throughput alinhador de leitura curta (Bowtie, 0.12.7) 6 e SAMtools (0,1. 17) 7. SAMtools implementa vários utilitários para pós-processamento de alinhamentos no formato SAM. O transcriptoma de referência humano pode ser baixado do iGenomes ( www.illumina.com ). Na corrida TopHat, usamos todas as configurações padrão de parâmetros, incluindo a opção de tipo de biblioteca como fr-unstranded (padrão).
- Nosção a CuffDiff programa, uma parte dos botões de punho (1.3.0) 8 pacote de software, comparar as células tratadas com trombina para as células de controlo de filtrar os transcritos de genes expressos diferencialmente na antiga com base na referência do transcriptoma humano. Esta comparação detectar a expressão diferencial de transcritos conhecidos. Use o Microsoft Excel para visualizar o resultado em forma de tabela. Na execução do programa Abotoaduras, usamos todos os parâmetros predefinidos. Essas transcrições de genes com FPKM <0,05 e p> 0,05 são filtrados.
- Para detectar novas isoformas, executar Cufflinks sem transcriptoma de referência. Comparar os arquivos de transcritos de amostras de referência, utilizando o genoma Cuffcompare e testar a expressão diferencial com Cuffdiff usando os arquivos de transcrição combinados trombina como o genoma de referência para uma análise e os ficheiros de controlo de transcrição combinados, como no genoma de referência para uma segunda análise. Use o Microsoft Excel para visualizar o resultado em formato tabular. Novamente, thostranscrições de e genes com FPKM <0,05 e p> 0,05 são filtrados. Após esta etapa, os pesquisadores podem optar por carregar uma lista de transcrições de notificação recente para o site UCSC Genome Browser ( http://genome.ucsc.edu/ ) para verificar a sua validade por uma inspeção manual.
- Apresentar listas de genes diferencialmente expressos para Análise Ingenuity Pathway (IPA, www.ingenuity.com ) para a caracterização dos genes e as vias afetadas pelo tratamento trombina. Nesta etapa, os pesquisadores podem optar por usar cummerbund ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), um pacote de R que é projetado para ajudar e simplificar a tarefa de analisar Cufflinks saída de RNA-seq, para ajudar a gerenciar, visualizar e integrar todos os dados produzidos por uma análise Cuffdiff.
4. Validação dos resultados RNA-seq por quantitativa em tempo real-PoReacção lymerase Chain (qRT-PCR)
- Realizar isolamento de RNA total do controle e da trombina tratados HMVEC Lbl células, RNA qualidade de avaliação e quantificação de RNA descrito nos Passos 1,4-1,6.
- Gerar DNA complementar a partir de 1 ug de RNA total de cada amostra com o Superscript First-Strand III Síntese Kits sistema RT, seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen, 18080-051).
- Executar qRT-PCR em uma VIIa Applied Biosystems 7 Real-Time PCR System usando Taqman Assay-on-Demand oligonucleótidos concebidos para a detecção de CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) e β-actina (ACTB, Hs99999903_m1). Cada amostra tinha um modelo equivalente a 5 ng de RNA total. Medir a quantificação utilizando o método DDCT e normalizar a β-actina. Cada ensaio foi realizado através de, pelo menos, três repetições biológica.
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Representative Results
Para o Passo 1: O 28s: 18s razão é tradicionalmente utilizada como um indicador da degradação de ARN. Idealmente, o pico 28s deverá ter aproximadamente duas vezes a área da banda de 18s (uma proporção de 2), no entanto este rácio ideal não é muitas vezes visto na prática. Além disso, 28s: 18s rácios obtidos a partir de métodos espectrofotométricos pode subestimar a quantidade de degradação do RNA. Para quantificar mais precisamente a degradação, e, por conseguinte, a qualidade da amostra de RNA, o sistema calcula uma Experion Qualidade RNA Indicador de número (RQI). O algoritmo de RQI compara o electroferograma de amostras de ARN a partir de dados de uma série de amostras degradadas padronizados, RNA e retorna automaticamente um número entre 10 (RNA intacto) e 1 (RNA degradado). A qualidade do RNA devem ter uma RQI de pelo menos 7, de preferência superior a 8. Figura 2 mostra os resultados utilizando uma Experion de alta qualidade com uma amostra de RNA de RQI 8.4.
ParaPasso 2: As bibliotecas devem ter uma larga banda de cerca de 250-300 bp a Figura 3 mostra os resultados de uma biblioteca Experion de alta qualidade a Figura 4 mostra os resultados de qPCR de amostras da curva padrão e uma amostra desconhecida (mostrado em azul escuro)... A situação ea qualidade da execução de sequenciação devem ser constantemente observados ao longo do ensaio A Figura 5 mostra a densidade de cluster apropriado durante a primeira etapa do ciclo de imagem;. Esta é a primeira indicação da qualidade de execução. Aglomerados deve ser brilhante e focada. Figura 6 mostra o Relatório Primeira base gerada após o primeiro ciclo é completa. É importante para avaliar a densidade de agrupamento estimada, os níveis de intensidade e qualidade foco neste ponto. O ponto de controlo de qualidade seguinte, após o ciclo 4, é mostrada na Figura 7. Isto mostra a densidade de agrupamento absoluto, para cada pista. A densidade de agrupamento não deve ser superior a 850 k / mm 2. Após o ciclo 13,Status de faseamento (quando uma base não é adicionado durante um ciclo) e prephasing (quando duas bases são adicionados durante um ciclo) é calculado, tal como mostrado na Figura 8. Números típicos são entre 0,1 e 0,25. A avaliação da qualidade importante é possível após o ciclo de 24, quando várias métricas de qualidade são calculados. A percentagem de leituras acima Q30, mostrado na Figura 9, é uma medida de confiança no chamado base. Uma leitura com uma pontuação de 30 Q significa que existe uma possibilidade de 1 em 1000 a chamada base é errado. As pontuações Q irá diminuir à medida que progride a execução, mas deve começar com mais do que 95% do lê satisfazer ou exceder Q30. Os aglomerados de passagem do filtro (PF), mostrados na Figura 10, são os aglomerados de que os dados de sequências reais serão tomadas. Idealmente, isso deve estar acima de 85%. A PF cluster é baseada em vários fatores, incluindo a eliminação, prephasing, intensidade e Q30. Não vai mudar com o progresso de execução. A percentagem alinhados ( Para o Passo 3: A Tabela 1 apresenta os genes expressos e isoformas de controle e tratados com trombina humana pulmonares células endoteliais microvasculares. Notavelmente, existem cerca de 26000 novos isoformas detectadas, o que ilustra a força de RNA-seq-pode-se identificar RNAs desconhecidos, transcrições de splicing alternativo e uso de promotor alternativo que não são detectáveis por meio de técnicas de microarray 3. RNA-seq também pode medir as transcrições menos abundantes que são erroneamente quantificados ou não detectado por microarrays. Figura 12 e Tabela differentiall display 2y expressa genes na via de sinalização de trombina. Este é um exemplo da geração de análise conhecimento terceira via de base orientada 9: abordagens baseadas na topologia da via, utilizando software Ingenuity Pathway Analysis. Isto mostra que um período de seis horas de tratamento de forma significativa a trombina regula-se o receptor de trombina Par 4 e regula para o receptor de trombina Par 3, enquanto não há nenhuma mudança na expressão do receptor da trombina um Par. Expressão de NFkB1, NF KB2 e Src também são significativamente-regulada. Alguns dos genes da família Rho (Rho B, C, F e G) são sobre-regulada, enquanto outros (Rho J, Q, T1, U e V) são regulada para baixo (Tabela 4). Gene da cadeia leve da miosina 9 (MYL9) é sobre-regulada durante MYL12B é regulada negativamente. A expressão de outros genes ou é regulada para baixo ou não afectada. Para o Passo 4: Para validar os resultados RNA-seq usando uma abordagem alternativa, foi realizado um experimento de qRT-PCR para dife ensaio trêsgenes rendas (Figura 13). No RNA-seq dados, TRAF1 foi-regulada por 7,96 vezes; CELF1 era regulada por 1,16 vezes, e FANCD2 foi regulada por 1,70 vezes. Em qRT-PCR de dados, estes números correspondentes são 7,25 vezes, -1,15 e -2,07 dobra vezes, respectivamente. Os resultados destes três genes testados pela RNA-seq qRT-PCR e estão em boa concordância, corroborando os resultados de RNA-seq. Tabela 1. Gene / Isoforma * Resumo Expressão. Esta tabela lista os genes, isoformas conhecidas e isoformas novas expressas no controle e trombina tratados HMVEC Lbl células. A mudança de dobragem é a razão entre a trombina FragmentsPerKilobase de fragmentos transcritos perMillion mapeados (FPKM) para controlar FPKM. Esses genes, isoformas conhecidas e isoformas novas com diferença de 2 vezes ou mais entre os dois grupos têm níveis de expressão estatisticamente diferentes (tal como determinado após Benjamini-Hochberg correcção). * Esta tabela é reproduzida a partir da Tabela 2 na Referência 4. Tabela 2. Genes diferencialmente expressos e isoformas em trombina via de sinalização *. *, Esta tabela é reproduzida a partir de S4 Tabela de Referência 4 com uma pequena modificação. **, Q-valor, uma taxa de detecção de falsos ajustada valor-p. 93/4393fig1.jpg "alt =" Figura 1 "/> Genes Controlar Trombina Genes total, expressa 16.636 16.357 Controle apenas 783 Apenas trombina 504 Up-regulado (diferença de 2 vezes ou mais) 152 Regulada (duas vezes ou gdiferença reater) 2190 Isoformas conhecidas Controlar Trombina Total de isoformas conhecidas Expresso 26.807 26.300 Controle apenas 1492 Apenas trombina 985 Up-regulado (diferença de 2 vezes ou mais) 480 Regulada (diferença de 2 vezes ou mais) 3574 Isoformas novela Controlar Trombina Isoformas Novel total, expressa 25.880 25.886 Controle apenas 418 Apenas trombina 424 Up-regulado (diferença de 2 vezes ou mais) 1775 Regulada (diferença de 2 vezes ou mais) 12.202 Abaixo genes regulados Símbolo gene Mudança Fold geral Membros Mudança Fold Individual q_value ** FPKM Controle FPKM trombina PLC -2,49 PLCB1 -2,97 0 6,75585 2,27611 PLCB2 -1,32 0.00183634 1,80892 1,36957 PLCB4 -10,04 6.28386E-14 0.682668 0,0679837 PLCL1 -2,53 5.26728E-09 0.602879 0.238017 GAQ -1,87 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 Gai -1,56 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 PKC -2,15 PRKCE -1,65 0 9,36364 5,67305 PRKCI -2,14 0 6,63566 3,09818 PRKD3 -2,61 0 16,0215 6,12878 IP3R -2,60 ITPR1 -1,39 0,000018734 1,51592 1,09009 ITPR2 -3,19 0 7,23283 2,26944 CREB -2,36 CREB1 -2,36 0 5,19117 2,2004 GATA -2,33 GATA3 -2,33 0.0228108 0.716773 0.307131 TBP -1,35 TBP -1,35 2.66E-05 8,48689 6,30476 G-proteína alfa -1,64 GNA14 -1,49 0,000122496 2,78076 1,86573 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 PAR3 -1,87 F2RL2 -1,87 1.02474E-06 1,51286 0.810286 SOS1 SOS1 -2,27 0 8,94353 3,94679 Ras -1,69 KRAS -2,03 0 11,2766 5,5659 NRAS -1,61 0 38,0874 23,6491 AKT -1,77 Akt3 -1,77 0 15,8228 8,94223 MLCP -2,38 PPP1CB -2,10 0 39,585 18,8199 PPP1R12A -3,56 0 15,2274 4,27516 PPP1R12B -2,66 5.28466E-13 1,92123 0.722188 FAK -1,31 PTK2 -1,31 4.3856E-10 39,7935 30,3044 p70 S6K RPS6KB1 -1,99 0 8,46312 ROCHA -3,68 Rock1 -3,54 0 19,5921 5,53112 Rock2 -3,86 0 16,0054 4,14759 CaMK -1,17 CAMK1 1,30 0,000255587 7,90794 10,296 CAMK2D -1,74 2.22911E-12 11,4497 6,56804 CAMK4 -2,58 0,000619045 0,62714 0.243277 Até genes regulados Símbolo Mudança Fold geral Membros Mudança Fold Individual q_value ** FPKM Controle FPKM trombina PAR4 1,59 F2RL3 1,59 9.19043E-13 4,99867 7,9253 Src 1,47 Src 1,47 0 14,1085 20,675 NF-kB 1,65 NFKB1 1,66 0 19,5113 32,3457 NFKB2 2,02 0 28,7563 58,1293 RELA 1,45 0 55,3482 80,28 Up-/Partial parciais de Down genes regulados Símbolo Mudança Fold geral Membros Mudança Fold Individual q_value ** FPKM Controle FPKM trombina G-proteína gammamãe 1,22 GNG10 -1,34 2.17216E-08 27,192 20,2206 GNG11 1,31 5.66209E-05 770,922 1.011,05 GNG12 -1,44 5.11591E-13 112,397 78,3023 GNG2 2,43 6.38453E-09 0.465705 1,13132 G protein-beta 1,27 GNB2 1,36 1.91268E-10 137,786 187,43 GNB3 -2,69 4.71259E-11 2,58703 0.962504 GNB4 -1,61 0 15,8275 9,85484 Rho GEF -1,16 ARHGEF12 -1,67 0 30,6424 18,3015 ARHGEF2 1,33 5.80478E-08 27,6288 36,758 ARHGEF3 -1,48 0 20,3279 13,7813 ARHGEF6 -2,08 0 2,67944 1,28635 ARHGEF9 -1,54 0.00469498 1,56367 1,0159 PI3K -1,80 Caixa eletrônico -6,84 0 4,98972 0.729483 PIK3C2A -5,09 0 17,7894 3,49234 PIK3C3 -1,49 4.66294E-15 12,6504 8,50852 PIK3CA -3,14 0 16,8398 5,36228 PIK3CB -1,36 8.4357E-09 9,68516 7,12129 PIK3CD 1,86 0 5,6579 10,5507 PIK3CG -1,76 2.32945E-10 1,86962 1,06419 PIK3R1 -1,79 0 5,48118 3,06256 PIK3R3 -1,59 1.50915E-05 5,24549 3,30763 PIK3R4 -1,40 7.18425E-12 8,34176 5,97942 Rho 1,19 RHOB 1,31 9.48429E-06 232,232 304,587 RHOC 1,38 458,267 630,235 RHOF 1,65 0 8,29676 13,7268 RHOG 1,40 1.02141E-14 58,6003 82,0172 RHOJ -1,57 0 127,446 80,9317 RHOQ -1,52 0 16,4802 10,8122 RHOT1 -1,96 3.00071E-12 8,48834 4,33755 RHOU -1,54 0.00184367 0.900141 0.586092 RHOV -3,32 0.0056467 1 0.413912 0.124591 RND3 -1,95 0 58,0564 29,7075 MLC -1,06 MYL12B -1,43 4.87832E-11 872,075 608,472 MYL9 1,48 0 202,636 299,559
Figura 1. Fluxograma de protocolo de RNA-seq perfilamento do transcriptoma mediada pela trombina em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares. Em primeiro lugar, tratar as células e isolar e quantificar RNA. Preparar bibliotecas a partir do ARN de alta qualidade e avaliar a sua concentração (por qPCR) e qualidade (por meio de um Bioanalyzer), depois de cluster em uma célula de fluxo. Iniciar a execução de seqüenciamento e análise da qualidade da corrida toda. Os postos de controle de qualidade são grandes ciclos 1, 4, 13 e 24. Usando casava, converter os arquivos para arquivos bcl fastq e alinhe os ao genoma com TopHat. Detectar isoformas conhecidas e desconhecidas usando abotoaduras e determinar a expressão diferencial com CuffDiff. Ver os ficheiros de saída em Excel e filtrar genes que têm um nível de expressão inferiores a 0,05 FPKM ou um valor de p maior do que 0,05. Enviar os genes restantes para Análise Caminho Ingenuity para obter mais informações sobre as funções dos genes e vias deffected pelo tratamento de trombina. Normalmente, conjunto selecionado de genes expressos diferencialmente são validadas por uma abordagem alternativa, tal como qRT-PCR. 
Figura 2. Uma amostra de RNA com um representante RQI de 8,4, tal como analisada por electroforese da Estação Automatizada Experion A) O rastreio individual de alta qualidade RNA -.. Eixo x representa o tempo e o eixo y representa o sinal fluorescente B) A imagem virtual de gel de uma amostra de RNA de alta qualidade. A intensidade do pico 28S é maior do que o pico 18S e sem contaminação é visto. Ambas as bandas são nítidas e definidas. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Biblioteca de alta qualidade a partir de ARN preparado como analisado por electroforese da Estação Automatizada Experion Um pico largo entre 250 e 300 pb e não é detectado ADN de elevado peso molecular (ADN contaminante) é observado A) O rastreio de uma biblioteca individual de alta qualidade.. - o eixo dos x representa o tempo e o eixo y representa o sinal fluorescente B) A imagem virtual de gel de uma biblioteca de alta qualidade. Um pico largo entre 250 e 300 pb e não é detectado ADN de elevado peso molecular (ADN contaminante) é observada. para ver figura maior .
<strong> Figura 4. resultados utilizando qPCR SyberGreen e iniciadores específicos para adaptadores ligados. Illumina Uma biblioteca previamente agrupados é utilizado para a curva padrão para determinar a concentração óptima de agrupamento para a biblioteca recém preparado. A diluição da biblioteca desconhecido cai dentro das concentrações da curva padrão. As amostras da curva padrão são indiciados pelas setas e a amostra desconhecida é azul escuro e também indicada por uma seta.
Figura 5. . Densidade de cluster correspondente durante a primeira etapa do ciclo de imagem Os clusters são claras, focada e brilhante Uma Base) A;. B) Base C; C) Base G, D) Base T.
| Métrico | Pista 1 | | Pista 3 | Pista 4 | Pista 5 | Pista 6 | Pista 7 | Pista 8 | |
| Densidade de cluster (k / mm 2) | 420,94 | 412,95 | 410,81 | 408,54 | 416,71 | 416,56 | 410,02 | 411,84 |
| A Intensidade | 25870,5 | 23886 | 23.891,38 | 23.735,83 | 23.949,38 | 24.933,08 | 24.305,79 | 23.950,29 |
| Intensidade C | 21.559,62 | 19.822,33 | 19.759,33 | 19472 | 19.954,21 | 20.611,75 | <td> 1989219.438,29 | |
| Intensidade G | 13.619,46 | 11.756,67 | 11.486,44 | 10.498,38 | 12.186,62 | 12195,5 | 11.826,88 | 11010,5 |
| Intensidade T | 19.402,67 | 17.663,79 | 17.854,42 | 17.353,75 | 17.545,54 | 18.060,67 | 18.457,92 | 17.397,12 |
| A Pontuação Foco | 68,2 | 67,46 | 67,67 | 67,75 | 67,41 | 67,43 | 67,63 | 67,05 |
| C Pontuação Foco | 67,93 | 67,33 | 67,56 | 67,66 | 67,33 | 67,39 | 67,46 | 66,9 |
| G Pontuação Foco | 65,4 | 64,14 | 63,98 | 63,92 | 63,29 | 63,41 | 63,47 | 63,74 |
| T Pontuação Foco | 66,45 | 65,57 | 65,5 | 65,49 | 65,03 | 65,23 | 65,57 | 65,59 |
Figura 6. O Relatório Primeira base gerada após o primeiro ciclo é completa. A densidade de agrupamento (apesar de subestimado nesta fase) é apropriado. As intensidades de boa aparência (10,000-26,000, com o G com o menor intensidade). As pontuações de foco também são adequadas, caindo em torno de 65-70, mas com valores maiores também são adequadas.
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Figura 7. A densidade de agrupamento calculado após ciclo de 4 A densidade do cluster é menor do que 850 k / mm 2 e até mesmo em todas as faixas de um formulário) Tabular;... B) forma de gráfico Clique aqui para ver maior figura .
Figura 8. Faseamento (não adição de uma base, durante um ciclo) e pré-eliminação (adicionando duas bases durante um ciclo). Ambos os valores são a 0,25 ou inferior, indicando apropriadas faseamento / pré-faseamento níveis. A) os valores de faseamento e pré-faseamento numéricos . B) Os valores de faseamento em forma de gráfico. C) O pré-eliminação valores em forma de gráfico. Clic k aqui para ver maior figura.
Figura 9. As diferentes representações da Q30 pontuação após o ciclo 24. Uma pontuação de 30 ou mais indica uma chance de 1 em 1000 que a chamada base é errado. Cerca de 90% das contagens de Q são acima de 30 Uma forma) tabular (Q30 pontuações aqui são a partir da totalidade do percurso, por meio do ciclo 24),. B) Q30 contagens por ciclo. Cada barra representa a distribuição das leituras caindo a Q30 ou superior para que o ciclo particular. C) Q30 distribuições pontuação através de ciclo 24. A distribuição dos escores Q numa base acumulada ao longo do ciclo 24. Pontuação Q está no eixo dos x, e milhões de leituras é sobre o eixo y. Lê com um Q30 acima de 30 são representadas em verde.oad/4393/4393fig9large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.
Figura 10. As diferentes representações de grupos que passam Clusters de filtro. Passando filtro é baseado em vários parâmetros, incluindo Q30, intensidade e eliminação / pré-eliminação. Pelo menos 85% dos clusters estão passando filtro em cada pista um formulário) Tabular;. B) forma de gráfico, caixas azuis representam o número total de clusters, caixas verdes representam os grupos que passam filtros. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 11. . Por cento dos agrupamentos alinhados ao genoma PhiX Aproximadamente 0,5% dos clusters alinhar ao genoma PhiX, apropriado para a quantidade de PhiX cravado nas amostras A forma) Tabular;.. B) forma de gráfico Clique aqui para ver maior figura .
Figura 12. Genes diferencialmente expressos pelo tratamento de trombina HMVEC-LBL na via de sinalização. Trombina A trombina via de sinalização foi construído por ingenuidade. Na via, a cor vermelha indica-se genes regulados (3 1,3 vezes) e verdes para baixo genes regulados (
Figura 13. qRT-PCR validação de três genes expressos diferencialmente a partir de trombina tratados HMVEC-LBL RNA-seq dados. qRT-PCR foi realizada como descrito no protocolo. alterações Dobra determinados a partir dos valores relativos de Ct do ensaio TaqMan Gene Expression para CUGBP, Elav-como um membro da família 1 (CELF1), anemia de Fanconi, D2 grupo de complementação (FANCD2) e TNF receptor-associated factor 1 (TRAF1)foram comparados com os detectados pela RNA-seq. Repetições (n = 4) de cada amostra foram realizados e os valores de Ct em média. Todos os valores Ct foram normalizados para β-actina. As barras de erro representam o alcance da mudança de dobra, tal como determinado pelos dados de software Assist. p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo em relação as mudanças de dobragem entre a trombina trata-grupo e do grupo de controlo, tanto o RNA-seq e os ensaios de qRT-PCR. O nível de mRNA nos grupos de controlo por cada ensaio foi arbitrariamente definida como uma que não são mostrados. *, P <0,05; **, p <0,01. Esta figura é reproduzida a partir da Figura 6 na Referência 4.
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Discussion
As principais etapas
Manipulação de RNA: RNases irá degradar ainda os mais elevada qualidade de ARN, por isso deve ser tomado cuidado durante o isolamento, o armazenamento e utilização de RNA 10. Luvas são sempre usadas para evitar a contaminação por RNases encontrados em mãos humanas. As luvas devem ser mudados frequentemente, especialmente depois de tocar a pele, maçanetas ou outras superfícies comuns. Um conjunto de pipetas deve ser dedicado exclusivamente para o RNA de trabalho e todas as dicas e os tubos devem ser RNase. Isolamento de ARN e a jusante de aplicação deve ser realizado em áreas de tráfego de baixo que são rotineiramente descontaminados com um produto, tais como a RNase-Zap. A degradação pode ocorrer também com repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Estes podem ser minimizados por alíquotas de RNA para aplicações a jusante imediatamente após o isolamento. Alternativamente, o cDNA pode ser feita por aplicação a jusante, tais como qRT-PCR directamente após o isolamento. ARN deve ser armazenado a -80 ° C e mantido em gelo durante o uso. Também é important para descongelar completamente e amostras de RNA vórtice antes e durante a utilização.
A qualidade do RNA de partida é essencial para o sucesso deste protocolo. A utilização de outro modo degradados ou de baixa qualidade do RNA pode causar a preparação da biblioteca de falhar ou resultar em baixo rendimento, que será suficiente para a sequenciação. Mesmo se o suficiente biblioteca pode ser feita a partir de RNA degradado ou de baixa qualidade, não irá representar com precisão os transcritos presentes na amostra, o que resulta na quantificação imprecisa de expressão. Além disso, qualquer DNA genómico não removido durante o isolamento de RNA podem causar um sobre-estimativa da quantidade de RNA utilizados no protocolo, mas se um montante (por exemplo, 1-2 mg), no meio da faixa sugerida (0,1-4 ug) é utilizado, a quantidade real de RNA será suficiente para o protocolo. Além disso, qualquer DNA genómico não é susceptível de ser apanhada por oligo (dt) construção da biblioteca de iniciador com base no protocolo de Illumina normal e, portanto, não vai provocar a jusante issues com níveis de transcritos de mRNA expressos. A quantificação do ARN de partida utilizando regulares leituras espectrofotométricas deve ser suficiente e não há necessidade de usar altamente precisas, tais como métodos quantitativos RiboGreen vez que as bibliotecas serão precisamente quantificadas após preparação por qPCR e os níveis de expressão de genes são normalizados em relação ao número total de lê durante os passos de análise de dados.
Quantificação da biblioteca. Quantificação exacta das bibliotecas é vital para a geração adequada de clusters. As moléculas de DNA com adaptadores únicos ligados com sucesso irão formar aglomerados. Leituras espectrofotométricas não diferenciar entre DNA e DNA com adaptadores sem, o que irá resultar num sobre-estimativa da concentração da biblioteca e, em última análise resultar na aglomeração da célula de fluxo. A quantidade de DNA sem adaptadores ligadura irá variar de biblioteca para biblioteca, mesmo se o mesmo RNA foi usada como iniciarmaterial de posição, de modo que não pode exatamente assumir que uma porcentagem padrão da leitura espectrofotométrica é o DNA com adaptadores ligados. Executando qPCR com iniciadores específicos para os adaptadores detecta apenas as moléculas de DNA com adaptadores ligados com sucesso para ambas as extremidades da molécula. Isto permite uma quantificação absoluta das bibliotecas e por sua vez uma densidade de agrupamento precisas. Avaliação das bibliotecas com um instrumento Experion ou um Bioanalyzer também é importante. Isto permite uma visualização da gama de tamanho da biblioteca, que é importante durante os passos de análise de dados, e assegura que não há contaminação que possa interferir com a geração de cluster.
Análise de Dados. Neste protocolo, aplicamos TopHat para alinhar RNA-seq lê a referência transcriptoma humano e abotoaduras para montar transcrições, estimar sua abundância, e teste para expressão diferencial em trombina tratados HMVEC Lbl células. TopHat e abotoaduras são two ferramentas populares, e eles são livres, software open-source 11. Um estudo recente mostrou que Cufflinks teve uma alta sensibilidade e especificidade na detecção de íntrons previamente anotados 12. No entanto, TopHat e abotoaduras não abordam todas as aplicações de RNA-seq nem são os únicos instrumentos para análise de RNA-seq 11. TopHat e abotoaduras exigir um transcriptoma referência seqüenciado ou genoma. Eles são particularmente adequados para a análise de RNA-seq dados gerados a partir de qualquer Illumina ou sólido máquinas de sequenciamento, mas não 454 ou a electroforese capilar clássico sequenciação plataforma. Os usuários que trabalham sem um genoma seqüenciado de referência pode considerar a realização de novo montagem transcriptoma usando uma das várias ferramentas, tais como Trindade ( http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), Trans-Abyss ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) ou Oásis ( http://www.ebi.ac.uk/ ~ Zerbino / oásis / ). Muitos programas alternativos de análise do transcriptoma já existem. Para uma pesquisa de programas diferentes, os leitores podem desejar ler o estudo de Garber et al. 13 e da revisão por Martin e Wang 14, que descrevem as vantagens e desvantagens comparativas e as considerações teóricas de programas mais atualmente e usados. A escolha de estratégias de análise do transcriptoma (referência com base em estratégia, estratégia de novo, e de estratégia combinada) e programas depende de muitos fatores, incluindo a existência ou integridade de um genoma de referência, a disponibilidade de seqüenciamento e recursos de computação, o tipo de conjunto de dados gerado e, mais importante, o objetivo principal do projeto de seqüenciamento 14.
Outro ponto deve ser feita: computer programas para a análise do transcriptoma pode não produzir uma precisão de 100% de todos os relatórios transcrição. Seqüenciamento de erro é outra preocupação. É sempre aconselhável que qualquer transcrição diferencialmente expressos identificados por RNA-seq ser validado por PCR em tempo real. Química sonda TaqMan baseado é considerada o padrão-ouro para o PCR em tempo real. Além disso, transcrições recentemente identificados devem ser validados pelo método de Sanger de sequenciamento de DNA antes de qualquer experimentação ainda mais.
Solução de problemas
Preparação da biblioteca: uma mancha de ADN genómico de elevado peso molecular, após as etapas de preparação da biblioteca pode ser causado por um transporte do passo de purificação final, durante a preparação do grânulo de biblioteca. Voltando as bibliotecas para o suporte magnético para um total de cinco minutos pode resolver o problema. Se não, o problema pode resultar de fragmentação incompleta do RNA durante os primeiros passos da preparação da biblioteca. Isto poderia ocorrer se baixaqualidade RNA é usado ou se o protocolo não for seguido exatamente. Por exemplo, alterando o tempo de incubação ou a temperatura, a adição de reagentes na ordem incorrecta ou pausas entre a fragmentação e a síntese da primeira cadeia do ADNc. Se devolver as bibliotecas para o suporte magnético não remove o DNA MW elevado, é aconselhável repetir a preparação da biblioteca com amostras frescas de RNA.
Baixa intensidade: Se a intensidade do primeiro ciclo é menor do que o esperado, é possível que os primers não hibridam com os aglomerados adequadamente durante a última etapa de geração de aglomerado ou na célula de fluxo foi armazenada por muito tempo entre aglomeração e o início da sequência executado. Neste caso, um rehybridization primário deve ser realizada utilizando um kit de iniciadores rehyb Illumina. Na maioria das vezes, este rehyb resolve os problemas de intensidade ea corrida pode ser iniciado de novo sem qualquer problema. Se, após um rehyb, as intensidades ainda são baixos, o problema pode sercom as bibliotecas ou a seqüência de síntese (SBS) reagentes e serviços técnicos Illumina deve ser contatado para solucionar o problema. Se intensidades A primeira leitura são boas, mas a intensidade é baixa depois volta ao redor, um rehyb cartilha do primer segunda leitura pode ser necessária. Isto é executado no instrumento de sequenciação e serviço técnico Illumina deve ser contactado para o procedimento.
Alta faseamento / prephasing: Se maior do que o normal ou faseamento prephasing é observada, uma possível causa é a contaminação de outros reagentes de SBS com tampão de clivagem. Durante as etapas de preparação do SBS, que é essencial para lidar com o tampão de clivagem anterior e mudar de luvas entre o tratamento do tampão de clivagem e de quaisquer outros reagentes. Se a contaminação tampão de clivagem é suspeita, um rehyb cartilha da célula de fluxo devem ser realizados e novos reagentes SBS deve ser preparado. Alternativamente, pode haver contaminação nas linhas do inst rument. Se este é suspeita, o instrumento deve ser submetido a uma lavagem de manutenção (a água de lavagem seguido por uma lavagem de NaOH, seguido de uma lavagem final em água), uma rehyb primário deve ser realizada na célula de fluxo e de novos reagentes devem ser preparados de SBS. Se os valores de faseamento / prephasing são moderadamente elevada (~ 0,5), o funcionamento pode ser continuado até que as pontuações Q30 e aglomerados de passagem do filtro são calculadas. Estes níveis podem ainda estar em limites aceitáveis, mesmo com supressão de altura e / ou prephasing.
Generalização deste protocolo
Embora seja específico para o HiScanSQ Illumina, este protocolo é aplicável a qualquer membro da família ou HiSeq o Genoma Analyzer II do Illumina instrumentos ( www.illumina.com ) com pequenas modificações nos passos de fragmentação de geração e de reagentes de sequenciação. Outros próxima geração de plataformas de sequenciamento de DNA, como a série sólido ("_blank"> Www.lifetechnologies.com), o sistema GS ( www.454.com ), bem como alguns sistemas emergentes mais recentes são também utilizados para fins de RNA-seq 11. Embora a sua construção da biblioteca e os procedimentos de sequenciação pode ser ligeiramente diferente, as pontas de manuseamento de RNA, as porções de análise de dados (a jusante dos passos casava) ea validação por RT-PCR apresentada neste protocolo pode ser de valor de referência para as suas aplicações de RNA-seq .
Também deve ser salientado que este protocolo é específico de RNA-seq em um ponto do tempo de trombina tratados HMVEC-LBL células, mas pode ser facilmente adaptado a um estudo multi-ponto de tempo ou em estudos de outras células, os tecidos tratados com diferentes estímulos ou inibidores, ou comparações de transcriptomas em células ou tecidos entre um estado saudável e um estado de doença.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Stephen Kingsmore e do Centro de Medicina Pediátrica Genoma em hospitais pediátricos Mercy e clínicas para o uso de clusters de computação para a nossa análise de dados, a equipe de Illumina serviço de campo (Elizabeth Boyer, Scott Cook e Mark Cook) e técnico equipa de consultores para as suas respostas rápidas e sugestões úteis sobre o funcionamento do instrumento de próxima geração de sequenciamento de DNA, HiScanSQ e análise de dados de qualidade. Este trabalho foi financiado em parte pelo National Institutes of Health Grant HL080042 (para SQY) e start-up fundo e dotação de hospitais infantis de Misericórdia e Clínicas, da Universidade de Missouri, em Kansas City (para SQY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine - Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. | |||
References
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