Summary
このプロトコルは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞にトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqの、強力な次世代DNAシーケンシング技術を適用するための完全かつ詳細な手順を示します。このプロトコルは、異なる試薬又は病気の状態によって影響を受ける様々な細胞や組織に一般化できる。
Abstract
mRNAレベルの測定を介して細胞内での遺伝子発現の特性は、細胞の転写機構を外部信号（ 例えば、薬物治療）、またはどのように細胞が健康な状態と病気の状態の間で異なることによりどのような影響を受けるかを決定するのに有用なツールです。次世代DNAシーケンシング技術の出現と連続洗練された、RNAシーケンシング（RNA-seq）は、転写物の全ての種をカタログ化するすべての発現している遺伝子の転写構造を決定するために、定量化するトランスクリプトーム解析のますます普及している方法となっている与えられた細胞、組織または生物1,2における転写産物の全体集合の変化の発現レベル。 RNA-seqは徐々にそれが完全なトランスクリプトームのプロファイリングの利点を持っているので、トランスクリプトーム解析のための好ましい方法として、DNAマイクロアレイを交換するデジタルdatum型（任意の転写物のコピー数）を提供すると、任意の既知のゲノムシーケンシャルに頼っていませんCE 3。
ここでは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞のトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqを適用するための完全かつ詳細なプロトコルを提示。このプロトコルは、と題する我々の最近発表された研究に基づいている我々は正常ヒト肺微小血管内皮細胞の最初の完全なトランスクリプトーム解析を行っている4 "RNA-seqはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞における遺伝子およびそのアイソフォームの新規トランスクリプトームを明らかにする" RNA-seqを使用してトロンビンで処理した。これは、炎症状態、癌、糖尿病、冠状動脈性心臓病の病因におけるトロンビン媒介内皮機能不全の分子機構についての洞察を得るためにさらなる実験のための前例のない資源をもたらし、これらの疾患に対する治療ターゲットの潜在的な新規のリードを提供しています。
このプロトコルの記述テキスト4つの部分に分かれています。最初の部分は、トロンビンおよびRNAの単離、品質分析と定量化したヒト肺微小血管内皮細胞の治療について説明しています。第二部では、ライブラリーの構築およびシーケンシングを説明しています。第三部は、データ分析を説明しています。 4番目の部分は、RT-PCR検証アッセイを記載する。いくつかの重要な手順の代表的な結果が表示されます。重要なステップでの成功を後押しするための有用なヒントや注意事項は、ディスカッション·セクションで提供されています。このプロトコルはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞を使用していますが、それは哺乳類と非哺乳類細胞の両方で、さまざまな刺激または阻害剤で処理した組織内のプロファイル·トランスクリプトームに一般化することができる、または健康状態の間の細胞または組織にトランスクリプトームを比較する疾病状態。
Protocol
このプロトコルを概説するフローチャートを図1に表示されます。
1。トロンビン、RNA単離、RNAの品質評価と定量で細胞を処理する
- 5％のFBS、成長因子および抗生物質によるEGM-2培地で6ウェルプレートで90〜100％コンフルエントまで培養ヒト肺微小血管内皮細胞（HMVEC-LBL）（Lonza社、カタログ番号CC-3202）。
- 飢餓·メディア（0％FBS）を30分トロンビンによる治療に先立って、メディアを変更してください。
- 0.05 U / mlのトロンビンを用いて細胞を治療したり、℃、5％CO 2、37℃で6時間のコントロールとして未処理のままにしておきます。
- メーカーの指示に従ってアンビオンミールヴァナキットを使用して処理した細胞および対照細胞から全RNAを単離する。
- Experionの自動電気泳動Station上の標準プロトコルに従ってExperionのStdSense真核生物RNAチップを搭載したRNAの品質を評価する（= "_blank"> www.bio-rad.com）。
- 標準分光光度法を用いてRNAを定量化する。
2。ライブラリーの構築とシーケン
- 出発原料として、サンプルあたり高品質のtotal RNA 1μgを使用します。
- ライブラリーを構築するために、イルミナ（プロトコル＃15008136 Rev. A翻訳版）からの標準的な手順に従ってください。このプロトコルでは、ポリ2ラウンドの（）を含むmRNAの選択は、rRNAの塩基配列決定を最小限に抑えるためにrRNAを除去するために行われている。
- Experionの自動電気泳動駅（上の標準プロトコルに従ってExperionのDNAを1Kチップを使用してライブラリの品質評価www.bio-rad.comを ）。
- 定量PCRを使用してライブラリを定量化：以前に標準曲線とライゲーションアダプターに特異的なプライマーとして、配列決定されたライブラリを使用してください。未知のライブラリ（ すなわち 1:100、1:500および1:1000）の希釈液の範囲を使用します。 qPCRにアコを実行SyberGreen MMプロトコルにrding、各ライブラリの元の原液濃度を計算します。
- クラスタフローセルへの準備が整うまで、-20℃で10 nMおよびストアにライブラリの株式を希釈します。
- ときに、クラスタフローセルをする準備ができて、水浴中CBOT試薬プレートを解凍します。 CBOTは、クラスタの生成プロセスを合理化するために使用されるイルミナ楽器です。
- CBOT楽器を洗う。
- ライブラリを変性：13μlの1×TEと6μlの10μMのライブラリを組み合わせると、チューブの側面に、1μlの1NのNaOHを（イルミナ社によって提供される）を追加します。渦は、スピンダウンし、室温で5分間インキュベートし、氷上で変性したライブラリを配置。
- ライブラリを希釈：12 PMの最終濃度996μlのHT1と4μlの変性ライブラリを組み合わせることにより予冷ハイブリダイゼーション緩衝液（HT1、イルミナによって提供される）で変性したライブラリを希釈します。氷上の変性および希薄化ライブラリを配置します。
- 、CBOTプレートの管のそれぞれの行を反転すべての試薬は融解していることを保証します。プレートをスピンダウンし、/パンク箔シールを取り外して、CBOTにロード。
- ストリップチューブに希釈し、変性したライブラリのアリコートを120μlは、1から8までのラベルが付いた。制御スパイクのように各試験管に1.2μlの希釈、変性PHIX制御ライブラリ（イルミナ）を追加します。ボルテックスし、チューブをスピンダウンして、正しい向きでCBOT（右にチューブ＃1）上にロードします。
- CBOTにフローセルとマニホールドをロードします。
- フローチェックを完了し、クラスタリングの実行を開始します。
- 実行が完了したら、すべてのレーンを横切っ試薬送達を確認してください。異常をメモしておきます。どちら4℃で直ちにシーケン実行を開始またはチューブ中でフローセルを保存
- シーケンシング合成による（SBS、イルミナ）の試薬を解凍します。
- 切断ミックスに触れた後、他の試薬に触れないように確認しながら、試薬トレイ上の適切な箇所に試薬をロードします。
- NOを使用N-シークエンスフローセル（ つまり以前に配列決定した1）、プライム試薬ラインを2回押します。
- 70％エタノールとレンズペーパーに続いて70％エタノールとキムワイプとシーケンスフローセルを、徹底的に清掃してください。どんなスジ用フローセルを点検してください。必要に応じて再清掃してください。
- シーケンサーにフローセルをロードして、マニホールドとフローセルの間のシールがタイトであることを保証するためにチェックフローを実行します。
- シーケンスの実行を開始します。
- 彼らは実行時 に利用可能になると品質メトリクス（クラスタの密度を例えば 、フィルタを通過するクラスタ、Q30、強度）を評価する。
- ラン全体で強度を監視します。
- 101サイクルが完了すると、2番目の読み出し完了するターンアラウンド化学を実行します。ペアリングエンド試薬及び第2のリード定款バッファ（ICBは、SBSの試薬の成分、イルミナ）を解凍し、試薬をロードします。
- 第2 回は、強度、Q30読ん評価、シーケン実行を継続ランの進行状況としてND他の品質メトリクス。
3。データ解析
- ベースコール·ファイル（。BCL）ファイルに変換するCASAVAの最新バージョン（イルミナ、現在は1.8.2）を使用します。fastqファイルは、各サンプルのシングルfastqファイルの作成を確実にするために0にfastq-クラスタカウントを設定する。下流解析用fastqファイルを解凍します。
- 超高スループット短い読み取りのアライナ（ボウタイ、0.12.7）6およびSAMtools（0.1を用いて哺乳動物サイズのゲノムを読み取ったRNA-seqを揃えトップハットの最新バージョン（1.4.1）5を使用してペアリング終了アライメントを実行します。 17）7。 SAMtoolsは、SAM形式で後処理アライメントを行なうための各種ユーティリティが実装されています。参照ヒトトランスクリプトームはiGenomes（からダウンロードすることができますwww.illumina.com ）。トップハットを実行している、我々はFR-unstranded（デフォルト）などのライブラリ·タイプ·オプションを含む、すべてのデフォルトのパラメータ設定を使用していました。
- 私達8ソフトウェアパッケージプログラムCuffDiff、カフスの部分（1.3.0）ING、人間の基準に基づいて、トランスクリプトーム、前者で差次的に発現する遺伝子の転写産物を選別するためのコントロール細胞にトロンビン処理した細胞を比較します。この比較は、既知の転写産物の発現差を検出します。表形式で結果を可視化するには、Microsoft Excelを使用します。カフス·プログラムを実行して、我々は、すべてのデフォルトパラメータの設定を使用しました。 FPKMとのそれらの遺伝子転写産物は<0.05、P> 0.05は除外されます。
- 小説アイソフォームを検出するために、基準のトランスクリプトームなしでカフスを実行します。 Cuffcompareを使用して、リファレンスゲノムにサンプルトランスクリプト·ファイルを比較し、1分析用リファレンスゲノムと第二の分析のための基準ゲノムとして合成制御トランスクリプトファイルとして結合されたトロンビントランスクリプト·ファイルを使用してCuffdiffを備えた差動式をテストします。表形式で結果を可視化するには、Microsoft Excelを使用します。再び、thosの電子遺伝子転写FPKMと<0.05およびp> 0.05は除外されます。このステップの後、捜査官は、UCSCゲノムブラウザのホームページ（に新たに報告された成績証明書のリストをアップロードすることを選ぶことができhttp://genome.ucsc.edu/手動検査によりその妥当性を確認するため）。
- 工夫パスウェイ解析（IPAに発現差のある遺伝子のリストを提出www.ingenuity.comトロンビン処理によって影響を受ける遺伝子および経路の特徴づけのために）。このステップでは、捜査官は、カマーバンド（使用することを選ぶかもしれhttp://compbio.mit.edu/cummeRbund/視覚化、管理を支援するために）、カフス、RNA-seqの出力を分析する作業を支援し、簡素化するように設計されているRパッケージを、とCuffdiff分析によって生成されたデータのすべてを統合します。
4。定量的リアルタイムリポによるRNA-seqの結果の検証lymerase連鎖反応（QRT-PCR）
- 制御およびトロンビン処理HMVEC-LBLセル、ステップ1.6から1.4に記載されたRNAの品質評価およびRNA定量からのtotal RNA抽出を行います。
- メーカーの指示（インビトロジェン社、18080から051）に続いてのSuperScript IIIファーストストランド合成システムRTのキットと、各サンプル1μgの全RNAから相補的DNAを生成します。
- CUGBP、Elav-likefamilymember1（CELF1、Hs00198069_m1）、Fanconianemia、complementationgroupD2（FANDCD2、Hs00276992_m1）、TNFreceptorの検出のためのTaqmanアッセイオンデマンドに設計されたオリゴヌクレオチドを用いて、Applied Biosystemsの第VIIa 7リアルタイムPCRシステムで定量RT-PCR解析を実行関連因子1（TRAF1、Hs01090170_m1）、およびβ-アクチン（ACTB、Hs99999903_m1）。各サンプルは、トータルRNAの5 ngに相当するテンプレートを持っていた。 DDCt法を用いて定量を測定し、β-アクチンに正規化する。各アッセイは複製され、少なくとも3生物を越えて行った。
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Representative Results
ステップ1：28S：18S比は伝統的にRNA分解の指標として用いられる。理想的には、28Sのピークは18歳のバンド（2の比）の約2倍の面積を持つ必要がありますが、この理想的な比率は、しばしば、実際には見られません。さらに、28S：分光光度法から得られた18S比はRNAの分解量を過小評価することができます。より正確に劣化、したがって、RNAサンプルの品質を定量化するために、Experionのシステムは、RNAの品質インジケータ（RQI）数を計算します。 RQIアルゴリズムは、標準化され、分解されたRNAの一連のサンプルからのデータにRNAサンプルの電気泳動図を比較して、自動的に10（インタクトなRNA）と1（分解されたRNA）の範囲の数値を返します。 RNAの品質は8より大きい理想的には少なくとも7のRQIを有するべきであり、 図2は、8.4のRQIで高品質のRNAサンプルを用いたExperionの結果を示しています。
のためにステップ2：ライブラリは約250から300 bpの広いバンドを持っている必要があります図3は、高品質のライブラリのExperionの結果を図4に、標準曲線サンプルと1未知試料（濃い青で示されている）の定量PCRの結果を示しています。シーケンス実行の進捗と品質は常にラン全体に観察されるべきである図5は、第1サイクル撮像工程の間、適切なクラスター密度を示している;これは、実行品質の最初の徴候である。クラスタは、明るく集中するべきである。 図6は、第1サイクル後に初めて発生する基本レポートの完了が表示され。この時点で推定されたクラスタの密度、強度レベル、フォーカスの品質を評価することが重要です。次の品質のチェックポイントは、4サイクル後に、 図7に示します。これは、各レーンの絶対クラスタ密度を示している。クラスタ密度は850 K / mm 2の上にあってはならない。サイクル13の後、図8に示すように、位相整合（ベースはサイクル中に付加されていない場合）と（2塩基がサイクル中に追加されたとき）prephasing統計は、計算されます。一般的な数値は0.1と0.25の間にある。主要な品質評価では、いくつかの品質メトリックが計算されるサイクル24日後に可能です。 図9に示されているQ30上記の読み込みの割合は、ベースコールの信頼性の尺度である。 30のQスコアでリード、ベースコールが間違っていることを1千でチャンスがあることを意味します。 Qのスコアは、実行が進むにつれて減少しますが、95％を超えてから始めるべきであるQ30を満たすか、または超えて読み込みます。 図10に示すように、フィルタ（PF）を通過するクラスタは、実際の配列データが元となるクラスターである。理想的には、これは85％以上でなければなりません。クラスタPFは、フェージングprephasing、強度及びQ30を含む多くの要因に基づいている。それは、実行が進むにつれて変化しません。 ％が整列（ ステップ3：表1は、制御及びトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞の両方で発現している遺伝子とのアイソフォームを提示します。特に、強度のRNA-SEQ-それは未知のRNAは、マイクロアレイ技術3によって検出可能ではありません選択的にスプライシングされた成績証明書と選択的プロモーターの使用状況を識別することができますを示しており、検出された約26000の新規アイソフォームが存在します。 RNA-seqはまた不正確マイクロアレイによって定量化または検出されていないあまり豊富な転写産物を測定することができます。 図12と表2に表示differentiallyはトロンビンシグナル伝達経路の遺伝子を発現した。工夫パスウェイ解析ソフトウェアを使用して、経路トポロジーに基づくアプローチ：これは、第三世代の知識ベースドリブンパスウェイ解析9の例である。それは6時間トロンビン処理が大幅にトロンビン受容パー4をアップレギュレートし、トロンビン受容体PAR 1の発現に変化がない一方、トロンビン受容体のパー3をダウンレギュレートすることを示しています。 NFkB1、NF KB2とSrcの発現も有意にアップレギュレートされています。 Rhoファミリー遺伝子（RhoのA、B、C、FおよびG）の一部がアップレギュレートされている他の人（RhoのJ、Q、T1、UとV）があるがダウンレギュレートしている（ 表4）。 MYL12Bがダウンレギュレートされている間ミオシン軽鎖遺伝子9（MYL9）がアップレギュレートです。他の遺伝子の発現は、いずれかのダウンレギュレーション、または影響を受けません。 手順4：代替的アプローチを用いて、RNA-seqの結果を検証するために、我々は検定3 diffeに定量RT-PCR実験を行った家賃遺伝子（ 図13）。 RNA-seqのデータでは、TRAF1は7.96倍にアップレギュだった; CELF1は1.16倍にダウンレギュレートされた;とFANCD2は1.70倍にダウンレギュレートされた。定量RT-PCRのデータでは、これらの対応する数字は7.25倍-1.15倍、-2.07倍、それぞれです。 RNA-seqおよび定量RT-PCRによりアッセイこれら3つの遺伝子の結果は、RNA-seqの結果を裏付ける良い合意している。 表1。遺伝子/アイソフォーム発現の概要*：このテーブルには、遺伝子、既知のアイソフォームとコントロールとトロンビン処理HMVEC-LBL細胞で発現する新規アイソフォームの一覧を示します。倍率変化はFPKMを制御するためにマップされてトランスクリプトperMillion断片のトロンビンFragmentsPerKilobaseの比（FPKM）です。二つのグループの間に2倍以上の差がこれらの遺伝子は、既知のアイソフォームと新規アイソフォームは、（Benjamini-ホッホバーグ補正後に決定される）統計的に異なる発現レベルを有する。 *この表は参考資料4の表2から再生される。 表2。トロンビンシグナル伝達経路における発現差のある遺伝子とイソ*。*この表はマイナーな修正と参考資料4の表S4から再生される。 **、q値、p値調整偽発見率。 93/4393fig1.jpgの "alt ="図1 "/> 遺伝子 コントロール トロンビン 総遺伝子が発現し 16636 16357 制御のみ 783 のみトロンビン 504 アップレギュレート（2倍以上の差） 152 ダウンレギュレート（2倍またはgreater差） 2190 既知のアイソフォーム コントロール トロンビン 発現された合計既知のアイソフォーム 26807 26300 制御のみ 1492 のみトロンビン 985 アップレギュレート（2倍以上の差） 480 （2倍以上の差）をダウンレギュ 3574 小説アイソフォーム コントロール トロンビン 総新規アイソフォームが発現した 25880 25886 制御のみ 418 のみトロンビン 424 アップレギュレート（2倍以上の差） 1775 （2倍以上の差）をダウンレギュ 12202 ダウンレギュレートされた遺伝子 遺伝子記号 全体の倍率変化 メンバー 個々の倍の変化 q_value ** FPKMコントロール FPKMトロンビン PLC -2.49 PLCB1 -2.97 0 6.75585 2.27611 PLCB2 -1.32 0.00183634 1.80892 1.36957 PLCB4 -10.04 6.28386E-14 0.682668 0.0679837 PLCL1 -2.53 5.26728E-09 0.602879 0.238017 GAQ -1.87 GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996 ガイ -1.56 GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795 GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198 PKC -2.15 PRKCE -1.65 0 9.36364 5.67305 PRKCI -2.14 0 6.63566 3.09818 PRKD3 -2.61 0 16.0215 6.12878 IP3R -2.60 ITPR1 -1.39 0.000018734 1.51592 1.09009 ITPR2 -3.19 0 7.23283 2.26944 CREB -2.36 CREB1 -2.36 0 5.19117 2.2004 GATA -2.33 GATA3 -2.33 0.0228108 0.716773 0.307131 TBP -1.35 TBP -1.35 2.66E-05 8.48689 6.30476 Gタンパク質アルファ -1.64 GNA14 -1.49 0.000122496 2.78076 1.86573 GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795 GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198 GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996 PAR3 -1.87 F2RL2 -1.87 1.02474E-06 1.51286 0.810286 SOS1 SOS1 -2.27 0 8.94353 3.94679 ラス -1.69 KRAS -2.03 0 11.2766 5.5659 NRAS -1.61 0 38.0874 23.6491 AKT -1.77 AKT3 -1.77 0 15.8228 8.94223 MLCP -2.38 PPP1CB -2.10 0 39.585 18.8199 PPP1R12A -3.56 0 15.2274 4.27516 PPP1R12B -2.66 5.28466E-13 1.92123 0.722188 FAK -1.31 PTK2 -1.31 4.3856E-10 39.7935 30.3044 P70 S6K RPS6KB1 -1.99 0 8.46312 ROCK -3.68 ROCK1 -3.54 0 19.5921 5.53112 ROCK2 -3.86 0 16.0054 4.14759 CAMK -1.17 CAMK1 1.30 0.000255587 7.90794 10.296 CAMK2D -1.74 2.22911E-12 11.4497 6.56804 CAMK4 -2.58 0.000619045 0.62714 0.243277 アップレギュレート遺伝子 シンボル 全体の倍率変化 メンバー 個々の倍の変化 q_value ** FPKMコントロール FPKMトロンビン PAR4 1.59 F2RL3 1.59 9.19043E-13 4.99867 7.9253 SRC 1.47 SRC 1.47 0 14.1085 20.675 NF-κBの 1.65 NFKB1 1.66 0 19.5113 32.3457 NFKB2 2.02 0 28.7563 58.1293 RELA 1.45 0 55.3482 80.28 部分的Up-/Partialダウンレギュレートする遺伝子 シンボル 全体の倍率変化 メンバー 個々の倍の変化 q_value ** FPKMコントロール FPKMトロンビン Gタンパク質GAMマ 1.22 GNG10 -1.34 2.17216E-08 27.192 20.2206 GNG11 1.31 5.66209E-05 770.922 1011.05 GNG12 -1.44 5.11591E-13 112.397 78.3023 GNG2 2.43 6.38453E-09 0.465705 1.13132 Gタンパク質β 1.27 GNB2 1.36 1.91268E-10 137.786 187.43 GNB3 -2.69 4.71259E-11 2.58703 0.962504 GNB4 -1.61 0 15.8275 9.85484 のRho GEF -1.16 ARHGEF12 -1.67 0 30.6424 18.3015 ARHGEF2 1.33 5.80478E-08 27.6288 36.758 ARHGEF3 -1.48 0 20.3279 13.7813 ARHGEF6 -2.08 0 2.67944 1.28635 ARHGEF9 -1.54 0.00469498 1.56367 1.0159 PI3K -1.80 ATMの -6.84 0 4.98972 0.729483 PIK3C2A -5.09 0 17.7894 3.49234 PIK3C3 -1.49 4.66294E-15 12.6504 8.50852 PIK3CA -3.14 0 16.8398 5.36228 PIK3CB -1.36 8.4357E-09 9.68516 7.12129 PIK3CD 1.86 0 5.6579 10.5507 PIK3CG -1.76 2.32945E-10 1.86962 1.06419 PIK3R1 -1.79 0 5.48118 3.06256 PIK3R3 -1.59 1.50915E-05 5.24549 3.30763 PIK3R4 -1.40 7.18425E-12 8.34176 5.97942 ρ 1.19 RHOB 1.31 9.48429E-06 232.232 304.587 RHOC 1.38 458.267 630.235 RHOF 1.65 0 8.29676 13.7268 RHOG 1.40 1.02141E-14 58.6003 82.0172 RHOJ -1.57 0 127.446 80.9317 RHOQ -1.52 0 16.4802 10.8122 RHOT1 -1.96 3.00071E-12 8.48834 4.33755 RHOU -1.54 0.00184367 0.900141 0.586092 RHOV -3.32 0.0056467 1 0.413912 0.124591 RND3 -1.95 0 58.0564 29.7075 MLC -1.06 MYL12B -1.43 4.87832E-11 872.075 608.472 MYL9 1.48 0 202.636 299.559
図1。ヒト肺微小血管内皮細胞におけるトロンビン媒介トランスクリプトームのRNA-seqのプロファイリングのためのプロトコルのフローチャートは、まず、細胞を治療し、RNAを分離し、定量化する。高品質のRNAからライブラリーを調製し、それらの濃度（定量PCRを介して）と品質（バイオアナライザーを介して）、フローセル上でクラスタを評価する。シーケンスは全体の質を実行し、分析を開始します。主要な品質のチェックポイントは、サイクル1、4、13および24です。 CASAVAを使用して、BCLファイルfastqファイルに変換してから、トップハットとのゲノムへのそれらの位置を合わせます。カフスボタンを使用して、既知および未知のアイソフォームを検出しCuffDiffで差次的発現を決定する。 Excelで出力ファイルを表示し、0.05未満FPKM発現レベルまたは0.05より大きいp値を持っている遺伝子を除外。遺伝子の機能および経路の詳細については工夫パスウェイ解析に残りの遺伝子を提出トロンビン処理によってffected。通常、発現差のある遺伝子に選択されたセットなどの定量RT-PCRなどの代替的なアプローチによって検証されます。 
図2。としてExperionの自動電気泳動によって分析ステーション8.4のRQIを持つ代表的なRNAサンプル）が高品質の RNAの個々のトレース- 。x軸は時間を表し、y軸は蛍光シグナルを示していますb）仮想ゲル画像高品質なRNAサンプルの。 28Sピークの強度は18Sのピークを超えており、汚染は見られません。両方のバンドがシャープで定義されています。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
図3。 RNAから調製した高品質のライブラリは、Experionの自動電気泳動·ステーションによって分析 250および300bpの間にブロードなピークが検出されず、高分子量DNAが（DNAを混入）が観察されていません）高品質のライブラリーの個々のトレース。 - x軸は時間を表し、y軸は蛍光シグナルの高品質ライブラリのB）は、仮想ゲル絵を描いている。 250および300bpの間にブロードなピークが検出されず、高分子量DNA（DNAの混入）が観察されない。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
<強い>図4。イルミナライゲーションアダプタに固有SyberGreenとプライマーを用いた定量PCR結果。以前にクラスタ化されたライブラリが新たに用意ライブラリに最適なクラスタリングの濃度を決定するための標準曲線として使用されます。未知のライブラリの希釈が標準曲線の濃度範囲内である。標準曲線サンプルは矢印で起訴さと未知サンプルの矢印でダークブルーとも示されています。
図5。適切なクラスタの最初のサイクルイメージング·ステップの間に密度のクラスタが、明確な焦点を絞って明るい）ベースA;。B）のベースC、C）がベース、G、D）ベースT.
| メトリック | レーン1 | | レーン3 | レーン4 | レーン5 | レーン6 | レーン7 | レーン8 | |
| クラスタ密度（K / mm 2）を | 420.94 | 412.95 | 410.81 | 408.54 | 416.71 | 416.56 | 410.02 | 411.84 |
| 強度 | 25870.5 | 23886 | 23891.38 | 23735.83 | 23949.38 | 24933.08 | 24305.79 | 23950.29 |
| Cの強度 | 21559.62 | 19822.33 | 19759.33 | 19472 | 19954.21 | 20611.75 | <TD> 1989219438.29 | |
| G輝度 | 13619.46 | 11756.67 | 11486.44 | 10498.38 | 12186.62 | 12195.5 | 11826.88 | 11010.5 |
| Tの強度 | 19402.67 | 17663.79 | 17854.42 | 17353.75 | 17545.54 | 18060.67 | 18457.92 | 17397.12 |
| フォーカススコア | 68.2 | 67.46 | 67.67 | 67.75 | 67.41 | 67.43 | 67.63 | 67.05 |
| Cのフォーカススコア | 67.93 | 67.33 | 67.56 | 67.66 | 67.33 | 67.39 | 67.46 | 66.9 |
| Gフォーカススコア | 65.4 | 64.14 | 63.98 | 63.92 | 63.29 | 63.41 | 63.47 | 63.74 |
| Tフォーカススコア | 66.45 | 65.57 | 65.5 | 65.49 | 65.03 | 65.23 | 65.57 | 65.59 |
図6。最初のサイクル後に初めて発生する基本レポートは完了です。クラスタ密度は（この段階では過小評価されたが）が適切です。強度は、（10,000-26,000、Gが最も低い強度を有すると）良く見える。フォーカススコアは高い値も適切ですが、65から70の周りに立ち、また適切である。
g7.jpgの "alt ="図7 "/>
図7。クラスタ密度が4サイクル後に計算クラスタ密度が850 K / mm 2でより低く、さらには全てのレーンの向こう側にある）表形式のフォーム;。B）のグラフフォーム拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図8。フェイジング（サイクル中に塩基を加えていない）とPre-フェージング（サイクル中に2つの塩基を加える）。両方の値が適切な/プリフェージングフェージングレベルを示す、以下0.25以下である。）を数値的に廃止し、事前的に廃止。B）のグラフ形式でフェージングの値は、グラフ形式でC）がプリフェージング値。 clicクリック拡大図を表示するには、ここではk。
図9。 24サイクル後のQ30のスコアの異なる表現30以上のスコアは、ベースコールが間違っていることを1千でチャンスを示しています。 Qのスコアの約90％が30を超えている）表形式（ここでQ30スコアはサイクル24を通って、実行の全体からのもの）;サイクルによるB）Q30得点。各バーは、サイクル24を介して、その特定のサイクルのために上記Q30またはで落下読み込みます。C）Q30スコア分布の分布を表します。サイクル24を介して、累積ベースでのQスコアの分布。 Qのスコアは、x軸と読み取りの数百万にあるy軸上にある。 30上記Q30の緑で表されていると読みます。oad/4393/4393fig9large.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
図10。フィルターを通過するフィルタ。Clustersを通過クラスターの別の表現は Q30、強度および/ プリフェージングフェージングを含むいくつかのパラメータに基づいています。クラスターの少なくとも85％が各レーンにフィルタを渡している）表形式フォーム; B）のグラフの形、青箱はクラスタの総数を表し、緑のボックスは、フィルターを通過するクラスタを表しています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図11。 PHIXゲノムにアラインクラスタのクラスタパーセントの約0.5％がサンプルにスパイクPHIXの量に適した、PHIXゲノムにアライン）表形式のフォーム;。B）のグラフの形は大きく姿を見るにはここをクリック 。
図12。差動トロンビンシグナル伝達経路におけるHMVEC-LBLのトロンビン処理により発現された遺伝子は。トロンビンシグナル伝達経路は、創意工夫することにより構築した。経路では、赤い色がアップレギュレートされた遺伝子（3 1.3倍）と、緑のダウンレギュレートする遺伝子を示しています（
図13。トロンビン処理HMVEC-LBLのRNA-seqのデータから3発現差のある遺伝子の定量RT-PCRの検証。プロトコルで説明したように定量RT-PCRを行った。CUGBPためのTaqMan遺伝子発現アッセイの相対Ct値から決定倍の変化を、家族の一員1（CELF1）、ファンコニ貧血相補群ジンD2（FANCD2）およびTNF Elavライク受容体関連因子1（TRAF1）RNA-seqで検出されたものと比較した。 （n = 4）の各サンプルの実行とCt値が平均化された複製します。すべてのCt値はβ-アクチンに対して標準化した。エラーバーは、データアシストソフトウェアによって決定される倍率変化の範囲を表す。 P <0.05は、RNA-seqおよび定量RT-PCRアッセイの両方によるトロンビン治療群と対照群との間の相対的な倍率変化に統計的に有意であると考えられた。各アッセイによる対照群のmRNAレベルは、任意に示されていない1つとして設定されていました。 *はp <0.05、** P <0.01。この数字は、参考文献4、 図6から再生される。
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Discussion
主な手順
RNAの取り扱い：RNaseがあっても、最も高品質のRNAを低下させます従ってケアはRNAを10の分離、貯蔵及び使用時に注意が必要です。手袋は常に人間の手で発見のRNaseの混入を防ぐために着用されています。手袋は、特に皮膚、ドアノブや他の共通の表面に触れた後、頻繁に変更する必要があります。ピペットのセットは、単に仕事をRNAに専念すべきであり、すべてのヒントやチューブは、RNaseフリーであるべきである。 RNAの単離と下流のアプリケーションは、日常などのRNase-ZAPとして製品に除染されている低トラフィック地域で行われるべきである。劣化はまた、凍結融解の繰り返しで発生する可能性があります。これらは分離直後にダウンストリームアプリケーション用のRNAを分取することで最小限に抑えることができます。あるいは、cDNAを直接分離後に、そのような定量RT-PCRなどのダウンストリーム·アプリケーションのために行うことができます。 RNAは-80℃で保存し、使用中に氷の上で保たれるべきである。また、IMPで完全に解凍し、ボルテックスortant RNAサンプル前と使用中。
RNAの開始品質は、このプロトコルの成功に不可欠です。劣化した、あるいは低品質のRNAを使用するには、シークエンシングには不十分であろう低収率で失敗したり、結果には、ライブラリの準備を引き起こす可能性があります。十分なライブラリが劣化したり、低品質のRNAから作製することができる場合でも、それは正確に表現の正確な定量結果として、試料中に存在する転写産物を表すものではありません。また、RNA単離中に除去されていないゲノムDNAは、プロトコルで使用されるRNAの量の過大評価を引き起こすことができますが、もし推奨する範囲の中央にある量（ 例えば 1から2μg）を（0.1-4μg）を使用され、RNAの実際の量は、プロトコルには十分であろう。また、任意のゲノムDNAは、標準イルミナプロトコルにおけるオリゴ（dT）プライマーベースのライブラリー構築によってピックアップされる可能性がないので、それが下流にISSを引き起こすことはありません表明mRNA転写レベルでのUE。定期的な分光光度計の測定値を使用して開始RNAの定量化が十分でなければならないとライブラリが正確に定量することによって調製した後定量化され、遺伝子発現レベルは総数に対する正規化されているので、このようなRiboGreenとして精度の高い定量的な方法を使用する必要はありませんデータ分析ステップの間に読み込まれます。
ライブラリの定量化。ライブラリの正確な定量化は、クラスタの適切な世代に不可欠です。首尾よくライゲーションアダプタでのみDNA分子がクラスターを形成することになる。分光光度計による測定値は、ライブラリーの濃度の過大評価になり、これを行わずにアダプタとDNAとのDNAとを区別し、最終的に、フローセルの下のクラスタリングにはなりません。ライゲーションアダプタなしでDNAの量は同じRNAをスタートとして使用された場合でも、ライブラリからライブラリに異なりまする材料は、ので、人は正確に分光光度読書の標準割合がライゲーションされたアダプタを搭載したDNAであると仮定することはできません。アダプターに特異的なプライマーを用いた定量PCRを実行すると、正常に分子の両末端に連結アダプタでのみそれらのDNA分子を検出します。これは、ライブラリと正確なクラスター密度を回す中での絶対的定量を可能にします。 Experionの楽器やバイオアナライザを使用してライブラリの評価も重要である。これは、データ分析の手順の間に重要であるライブラリのサイズ範囲の可視化を可能にし、クラスタ生成を妨げる可能性があり、汚染がないことを保証します。
データ分析。このプロトコルでは、我々は、RNA-seqが転写産物を組み立てるために、人間基準のトランスクリプトームとカフスに読み込み配置するトップハット適用された彼らの存在量を推定し、トロンビン処理HMVEC-LBL細胞で差次的発現のためのテスト。トップハットとカフスはTWO人気のあるツールを、そして、彼らはフリー、オープンソースソフトウェア11アール。最近の研究では、カフスボタンは、以前に注釈付きのイントロン12の検出に高い感度と特異性を有することを示した。しかし、トップハットとカフスは、RNA-seqのすべてのアプリケーションに対応していないまた彼らは、RNA-seqの解析11のための唯一のツールです。トップハットとカフスは、シーケンス参照トランスクリプトームやゲノムを必要とします。彼らは、イルミナまたは固体シングマシンではなく、454またはプラットフォームをシーケン古典キャピラリー電気泳動のいずれかから生成されたRNA-seqのデータの分析に特に適しています。シーケンスされたリファレンスゲノムせずに作業しているユーザーは、このような三位一体（のようないくつかのツールのいずれかを使用してトランスクリプトームのde novoアセンブリを実行することを検討してもよいhttp://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ）、トランス·アビス（ http://wwをw.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2）やオアシス（ http://www.ebi.ac.uk/〜zerbino /オアシス/ ）。多くの代替的なトランスクリプトーム解析プログラムは現在、存在しています。異なるプログラムの調査のために、読者はガーバーらによる研究を読むとよいでしょう。13と比較長所と短所、そして最も現在、一般的に使用されるプログラムの理論的考察を記述マーティンと王14による審査。トランスクリプトーム解析戦略（参照ベースの戦略、de novoの戦略、そして合わせた戦略）とプログラムの選択は、リファレンスゲノムの存在や完全性、リソースをシーケンシングおよびコンピューティングの可用性、データセットの種類を含む多くの要因に依存します生成され、最も重要なのは、シークエンシングプロジェクト14の包括的な目標。
もう一つのポイントは、なされるべきである：COトランスクリプトーム解析のためのmputerプログラムは、すべての転写産物の報告の100％の精度を得られないことがあります。シーケンス·エラーは、別の問題である。それは、RNA-seqで識別される任意の差次的に発現転写産物をリアルタイムPCRにより検証することを常にお勧めします。 TaqManプローブベースの化学は、リアルタイムPCRのためのゴールドスタンダードと考えられている。また、新たに同定された転写物は、任意のさらなる実験の前にDNAシーケンシングのサンガー法によって検証されるべきである。
トラブルシューティング
ライブラリ調製：ライブラリの準備手順が原因である可能性があり、高分子量のゲノムDNAのスメア後のキャリーオーバーライブラリの準備中に最終のビーズ精製工程から。フル5分間磁気スタンドにライブラリを戻すと、問題が解決する場合があります。しない場合、問題は、ライブラリの準備の第一段階時のRNAの不完全な断片に由来する可能性があります。低場合に発生することがあり品質のRNAが使用されているか、またはプロトコルが正確に従わない場合には。たとえば、間違った順序で試薬を添加するか、または断片化し、cDNAの第一鎖の合成の間、一時停止、インキュベーション時間や温度を変える。磁気スタンドにライブラリを返すことは、高MW DNAを除去しない場合、それは新鮮なRNAサンプルとライブラリの準備を繰り返すことをお勧めします。
低強度：最初のサイクルの強度が予想よりも低い場合、それはプライマーはクラスタ生成またはフローセルの最後のステップの間に適切にクラスタにハイブリダイズしていない可能性がありますは、クラスタリングとシーケンシングの開始までの間に、あまりにも長い間保存されていた実行します。この場合、プライマーrehybridizationはイルミナからプライマーrehybキットを使用して行われるべきである。ほとんどの場合、このrehybは、強度の問題を解決し、ランは何の問題もなく、やり直すことができます。 rehyb後に、強度がまだ低い、場合、問題かもしれません合成（SBS）の試薬とイルミナの技術サービスでライブラリまたは配列で、より詳細なトラブルシューティングのために連絡する必要があります。最初のリードの強度は良いですが、強度が好転した後に少なくなっている場合、2回目の読み出しプライマーのプライマーrehybが必要になることがあります。これは、シークエンシング楽器上で実行され、イルミナの技術サービスは、手続きのために連絡する必要があります。
フェージング/ prephasing高：フェージングまたはprephasing通常よりも高いが認められた場合、考えられる原因は切断バッファを持つ他のSBS試薬の汚染である。 SBSの準備手順の間に、それは最後の切断バッファを処理し、切断·バッファの取り扱いおよび他の試薬間の手袋を交換することが不可欠である。切断バッファ汚染が疑われる場合には、フローセルのプライマーrehybを行うべきであるとSBS新しい試薬を準備する必要があります。あるいは、INSTの行に汚染があるかもしれません rument。これが疑われる場合には、測定器はメンテナンス洗浄（最終水洗浄し、続いてNaOHでの洗浄に続いて水洗浄）を受ける必要があり、プライマーrehybは、フローセル上で実行されるべきであり、SBS新しい試薬を準備する必要があります。フェージング/ prephasing値（〜0.5）適度に高い場合は、フィルターを通過Q30スコアとクラスタが計算されるまで、実行が継続されてもよい。これらのレベルは依然として高いが、フェージングおよび/またはprephasingでも、許容限度であってもよい。
このプロトコルの一般化
それはイルミナHiScanSQに固有のものですが、このプロトコルはHiSeqファミリーやイルミナ楽器のゲノムアナライザⅡ（のいずれにも適用することがwww.illumina.comクラスタ生成手順とシーケンシング試薬のマイナーな変更がある）。このような固体シリーズのような他の次世代DNAシーケンシングプラットフォーム（"_blank"> www.lifetechnologies.com）、GSシステム（ www.454.com ）だけでなく、いくつかの新興新しいシステムは、RNA-seqの11の目的のために採用されています。それらのライブラリー構築とシーケンシングの手順は若干異なるかもしれませんが、RNAの取り扱いのヒント、データ解析部（CASAVAステップの下流）と、このプロトコルで提示されたRT-PCR法による検証では、それらのRNA-seqのアプリケーションへの基準値にすることができます。
また、トロンビン処理HMVEC-LBLセルのいずれかの時点で、このプロトコルは、RNA-seqのに特異的であることが指摘されるべきであるが、それは簡単に他のセルのマルチポイントインタイムスタディや研究に適合させることができました、で処理された組織異なる刺激または阻害剤、または健康状態や病気の状態との間の細胞または組織におけるトランスクリプトームの比較。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、我々のデータ解析のためのそれらのコンピューティング·クラスタの使用のために子供のマーシー病院や診療所で博士スティーブンKingsmoreと小児ゲノム医学センターに感謝したいと思い、イルミナのフィールドサービスチーム（エリザベス·ボワイエ、スコット·クック、マーク·クック）と技術彼らの迅速な対応と次世代DNAシーケンシング楽器、HiScanSQ、およびデータ品質分析の実行に関する有用な提案のためのコンサルタントチーム。この作品は、子供のマーシー病院や診療所の健康グラントHL080042（SQY）とスタートアップ資金や寄付金の国立研究所、カンザスシティ、ミズーリ大学（SQYへ）によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine - Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. | |||
References
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