Summary
이 프로토콜은 다음과 같은 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 프로필 transcriptomes에 RNA-seq, 강력한 차세대 DNA 시퀀싱 기술을 적용 할 완전하고 자세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 시약 또는 질병 상태에 의해 영향을 다양한 세포 나 조직에 generalizable 수 있습니다.
Abstract
mRNA 수준의 측정을 통해 세포의 유전자 발현의 특성은 세포의 전사 기계가 외부 신호 (예 : 약물 치료), 또는 어떻게 세포가 건강한 상태와 병에 걸린 상태 사이의 차이에 의해 영향을하는 방법을 결정하는 유용한 도구입니다. 차세대 DNA 시퀀싱 기술의 출현과 지속적인 개량을 통해 RNA-시퀀싱 (RNA-seq)는 성적 증명서의 모든 종류를 분류하기위한 모든 표현 유전자의 전사 구조를 파악하고 계량화 할 수 transcriptome 분석의 점점 인기있는 방법이되었다 주어진 셀, 조직 또는 유기체 1,2의 성적 증명서의 총 집합의 변화 표현 수준. RNA-seq은 점차 그 완전한 transcriptome를 프로파일의 장점을 가지고 있기 때문에, transcriptome 분석을위한 선호하는 방법으로 DNA의 microarrays를 대체하는 디지털 형 자료 (모든 증명서의 사본 번호)를 제공하고 알려진 게놈의 sequen에 의존하지 않습니다CE 3.
여기, 우리는 함께 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포에 프로필 transcriptomes에 RNA-seq를 적용 할 수있는 완전하고 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 자격이 최근 출판 연구에 기초가 성공적으로 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 첫 번째 전체 transcriptome 분석을 수행하는 4 "RNA-seq은 트롬빈으로 치료 인간의 폐 Microvascular 내피 세포의 유전자와 Isoforms의 소설 Transcriptome를 보여" 트롬빈은 RNA-seq을 사용하여 치료. 그것은 염증 조건, 암, 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환의 pathogenesis에 트롬빈로 인한 내피 기능 장애의 근간이 분자 메커니즘에 통찰력을 얻기 위해 추가 실험을위한 전례없는 자원을 굴복, 이러한 질병에 대한 치료 타겟에 대한 잠재적 인 새 리드를 제공합니다.
이 프로토콜의 설명 텍스트네 부분으로 나누어 져 있습니다. 첫 번째 부분은 트롬빈과 RNA 분리, 품질 분석 및 정량화와 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 치료에 대해 설명합니다. 두 번째 부분은 도서관 건설 및 시퀀싱에 대해 설명합니다. 세 번째 부분은 데이터 분석에 대해 설명합니다. 네 번째 부분은 RT-PCR 검증 분석을 설명합니다. 몇 가지 주요 단계를 대표 결과가 표시됩니다. 주요 단계에서의 성공을 높일 수 유용한 팁이나주의 사항은 토론 섹션에서 제공됩니다. 이 프로토콜은 트롬빈로 치료 인간의 폐 microvascular 내피 세포를 사용하지만, 그것은 포유류와 비 포유류의 세포 모두에서 서로 다른 자극이나 억제제, 또는 건강 상태 사이의 셀이나 조직에 transcriptomes를 비교로 치료 조직의 프로필 transcriptomes에 일반화 할 수 및 질병 상태.
Protocol
이 프로토콜을 요약 순서도는 그림 1에 표시됩니다.
1. 트롬빈, RNA 분리, RNA의 품질 평가 및 정량화와 세포의 치료
- 5% FBS, 성장 요인 및 항생제와 EGM-2 중간에 6 잘 접시에 90~100%의 합류로 문화 인간 폐 Microvascular 내피 세포 (HMVEC-LBl) (Lonza, 고양이 # CC-3202).
- 기아 미디어 (0 % FBS) 이전 트롬빈 치료를 30 분에 미디어를 변경합니다.
- 0.05 U / ML 트롬빈으로 세포를 치료하거나 ° C 5 % CO 2 37에서 6 시간에 대한 제어로 치료 둡니다.
- 제조업체의 지침에 따라 Ambion 미르 Vana 키트를 사용하여 처리 및 제어 세포로부터 총 RNA를 분리합니다.
- Experion 자동 전기 영동 역 (에서 표준 프로토콜에 따라 Experion StdSense의 진핵 세포 RNA 칩과 RNA의 품질을 평가= "_blank"> www.bio-rad.com).
- 표준 분광 방법을 사용하여 RNA을 수량화.
2. 도서관 건축 장면
- 자료를 시작으로 샘플 당 고품질의 총 RNA의 1 μg을 사용합니다.
- 라이브러리를 구축하려면, Illumina (프로토콜 # 15008136 목사)에서 표준 절차를 수행하십시오. 이 프로토콜에서는 폴리의 두 발 (A)가 포함 된 mRNA의 선택은 rRNA 배열을 최소화하기 위해 rRNA를 제거하는 수행됩니다.
- Experion 자동 전기 영동 역 (에서 표준 프로토콜에 따라 Experion의 DNA 1K 칩을 사용하여 라이브러리의 품질 평가 www.bio-rad.com을 ).
- qPCR을 사용하여 라이브러리를 수량화 : 이전에 표준 곡선과 출혈도 잡았 어댑터에 대한 특정 프리 머으로 순서가 된 라이브러리를 사용합니다. 알 수없는 라이브러리 (예 : 1:100, 1:500 및 1:1,000)의 dilutions의 범위를 사용합니다. qPCR acco를 실행SyberGreen MM 프로토콜에 rding 각 도서관의 원래 주식 농도를 계산합니다.
- 클러스터 흐름 셀을 할 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 10 NM하고 저장할 라이브러리 주식을 희석.
- 경우 클러스터 흐름 셀을 할 준비가 물 목욕에 cBot 시약 판을 해동. cBot은 클러스터 생성 과정을 간소화하는 데 사용 Illumina 악기입니다.
- cBot 악기를 씻으십시오.
- 라이브러리를 변성 : 튜브의 측면에 13 μl 1X TE 6 μl 10 μM 라이브러리 및을 조합 한 μl 1 N NaOH를 (Illumina에서 제공)를 추가합니다. 소용돌이, 스핀 다운 5 분 동안 실온에서 배양과 얼음의 변성 라이브러리를 배치합니다.
- 라이브러리를 희석 : 12 PM의 최종 농도에 996 μl HT1과 4 μl 변성 라이브러리를 결합하여 사전에 차가운 하이브 리다이 제이션 버퍼로 변성 라이브러리 (HT1, Illumina에서 제공)을 희석. 얼음의 변성과 희석 라이브러리를 배치합니다.
- , cBot 판의 튜브의 각 행을 반전모든 시약이 해동되어 있도록. 판 스핀 다운 / 펑크 호일 씰을 제거하고 cBot에로드합니다.
- 스트립 관의 희석, 변성 도서관 나누어지는 120 μl는, 1-8이라는. 제어 스파이크 -에서와 같이 각 튜브에 1.2 μl 희석, 변성 PhiX 제어 라이브러리를 (Illumina에서) 추가합니다. 소용돌이와 튜브를 스핀 다운하고 올바른 방향으로 cBot (오른쪽 튜브 # 1)을로드합니다.
- cBot로 흐름 셀 및 매니 폴드를로드합니다.
- 흐름이 확인하고 클러스터링 실행을 시작 완료합니다.
- 실행이 완료되면 모든 차선에서 시약 납품을 확인합니다. 모든 이상주의하십시오. 어느 4 ° C.에서 바로 시퀀싱 실행을 시작하거나 제공된 튜브에 흐름 세포를 저장
- 시퀀싱 별 합성 (SBS, Illumina) 시약을 해동.
- 절단 믹스를 만진 후에는 다른 시약을 터치하지 않도록하고, 시약 트레이에 적절한 장소에 시약을로드합니다.
- 더를 사용하여N-시퀀싱 흐름 셀 (즉, 이전에 순서가되었다 하나), 주요 시약 선 두 번.
- 철저하게 70 % EtOH 및 렌즈 종이에 이어 70 % EtOH와 Kimwipes과 시퀀싱 흐름 세포를 청소하십시오. 모든 줄무늬의 흐름 셀을 검사합니다. 그 필요한 경우 다시 청소하십시오.
- 시퀀서에 흐름 셀을로드하고 매니 폴드 및 흐름 세포 사이의 인감 꽉 있는지 확인 확인 흐름을 수행합니다.
- 시퀀싱 실행을 시작합니다.
- 사람들이 실행하는 동안 제공 될 품질 측정 항목을 (클러스터 밀도를 예를 들어, 필터를 통과 클러스터, 질문 30, 강도) 평가합니다.
- 실행에 걸쳐 강도를 모니터링 할 수 있습니다.
- 101 사이클이 완료되고 나면, 두 번째 읽기 완료 처리 화학을 수행 페어 최종 시약 및 두 번째 읽기 설립 버퍼 (ICB, SBS 시약의 구성 요소, Illumina)를 해동 및 시약을로드합니다.
- 제 2는 강도, 질문 30를 참조 평가, 순서 실행을 계속실행 진행 차 기타 품질 통계를 확인할 수 있습니다.
3. 데이터 분석
- 각 샘플에 대해 하나의 fastq 파일의 생성을 보장하기 위해 0으로 fastq-클러스터 수를 설정. fastq 파일에 기본 통화 파일 (. BCL) 파일을 변환 할 수 CASAVA (Illumina, 현재 1.8.2)의 최신 버전을 사용 . 하류 분석을위한 fastq 파일의 압축을 풉니 다.
- RNA-seq은 매우 높은 처리량 짧은 읽기 aligner (Bowtie, 0.12.7) 6 SAMtools을 (0.1 사용 포유류의 크기 genomes을 읽어 정렬 TopHat (1.4.1) 5의 최신 버전을 사용하여 쌍으로 최종 정렬을 수행합니다. 17) 7. SAMtools는 SAM 형식의 후 처리 정렬을위한 다양한 유틸리티를 구현합니다. 참조 인간 transcriptome는 iGenomes (에서 다운로드 할 수 있습니다 www.illumina.com ). TopHat를 실행, 우리는 FR-unstranded (기본값)로 라이브러리 유형 옵션을 포함한 모든 기본 매개 변수 설정을 사용했습니다.
- 우리8 소프트웨어 패키지 프로그램 CuffDiff, 커프스 단추의 일부를 (1.3.0) 들죠, 인간의 참조 transcriptome에 따라 이전에 differentially 표현 유전자 성적 증명서를 화면에 컨트롤 세포에 트롬빈 - 처리 세포를 비교합니다. 이 비교 알려진 성적 차등 표현을 감지합니다. 테이블 형태의 결과를 시각화하기 위해 Microsoft Excel을 사용합니다. 커프스 단추 프로그램을 실행에서, 우리는 모든 기본 매개 변수 설정을 사용했습니다. FPKM <0.05 및 P>있는 사람 유전자 성적은 0.05는 제외됩니다.
- 소설 isoforms을 검색하려면, 참조 transcriptome없이 커프스 단추를 실행합니다. Cuffcompare를 사용하여 참조 게놈에 샘플 스크립트 파일을 비교 한 분석을위한 참조 게놈과 두 번째 분석을위한 참조 게놈으로 통합 제어 스크립트 파일로 결합 된 트롬빈 대본 파일을 사용 Cuffdiff으로 차등 표현을 테스트합니다. 표 형식의 결과를 시각화하기 위해 Microsoft Excel을 사용합니다. 다시 도스FPKM <0.05 및 P>과 전자 유전자 성적은 0.05는 제외됩니다. 이 단계 후, 조사관은 UCSC 게놈 브라우저 웹 사이트 (에 새로보고 된 성적 증명서의 목록을 업로드하도록 선택할 수 있습니다 http://genome.ucsc.edu/ 수동으로 검사하여 유효성을 확인하기 위해).
- 독창성 경로 분석 (IPA에 differentially 표현 유전자의 목록을 제출 www.ingenuity.com 트롬빈 치료에 의해 영향을 유전자 및 경로의 특성을 위해). 이 단계에서, 수사관들이 CummeRbund (사용하도록 선택할 수 있습니다 http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ 시각화, 관리 할 수 있도록), 커프스 단추 RNA-seq 출력을 분석하는 작업을 지원하고 단순화하도록 설계되었습니다 R 패키지를, 그리고 Cuffdiff 분석에 의해 생산의 모든 데이터를 통합 할 수 있습니다.
4. 수량 실시간 - 포에 의한 RNA-seq 결과의 유효성을 검사lymerase의 연쇄 반응 (qRT-PCR)
- 제어 및 트롬빈 - 처리 HMVEC - LBl 세포 RNA 품질 평가 및 1.6 단계 1.4에 설명 된 RNA의 정량화에서 총 RNA 격리를 수행합니다.
- 제조업체의 지침 (Invitrogen, 18080-051)에 따라 윗 첨자 III 1 스트랜드 합성 시스템 RT 키트 각 샘플의 1 μg 총 RNA에서 DNA 보완를 생성 할 수 있습니다.
- CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor의 검출을위한 Taqman 분석 주문형 설계 oligonucleotides를 사용하여 응용 Biosystems ViiA 7 리얼 타임 PCR 시스템에 qRT-PCR 분석을 수행 - 관련 인자 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) 및 β-고를 (ACTB, Hs99999903_m1). 각 샘플은 총 RNA의 5 NG에 해당 템플릿을했습니다. DDCt 방법을 사용 quantitation를 측정하고 β-고를를 정상화. 각 분석은 복제 적어도 세 생물학에 걸쳐 수행되었다.
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Representative Results
1 단계의 경우 : 28s : 18의 비율은 전통적으로 RNA 저하의 지표로 사용됩니다. 이상적으로, 28s 피크는 18 밴드 (2의 비율)의 약 두 배 공간을 갖추고해야하지만이 이상적인 비율은 자주 연습에서 볼 수 없습니다. 또한, 28s : 분광 방법에서 얻은 18 비율은 RNA의 저하의 양을 과소 평가 할 수 있습니다. 보다 정확하게 저하, 따라서 RNA 샘플의 품질을 수량화하기 위해 Experion 시스템은 RNA 품질 표시 (RQI) 번호를 계산합니다. RQI 알고리즘은 표준화 저하 RNA 샘플의 시리즈에서 데이터 RNA 샘플의 electropherogram을 비교하여 자동으로 10 일 (그대로 RNA)과 1 (저하 RNA) 사이의 숫자를 반환합니다. RNA 품질이 8보다 이상적으로 큰 최소 7의 RQI을 가지고 있어야합니다. 그림 2는 8.4의 RQI과 높은 품질의 RNA 샘플을 사용하여 Experion 결과를 보여줍니다.
에2 단계 : 도서관은 약 250-300 BP에서 폭 넓은 밴드가 있어야합니다 그림 3은 고품질의 라이브러리의 Experion 결과를 보여줍니다 그림 4는 qPCR 표준 곡선 샘플의 결과 한 알 수없는 샘플을 (진한 파란색으로 표시)이 표시됩니다... 시퀀싱 실행의 진행과 품질은 지속적으로 실행에 걸쳐 관찰해야 그림 5는 첫 번째 사이클 이미징 단계에서 적절한 클러스터 밀도를 나타낸다;.이 실행 품질의 첫 번째 표시입니다. 클러스터는 밝고 중심이어야합니다. 그림 6은 처음 사이클 이후에 생성 된 첫 번째 자료 보고서가 완료 보여줍니다. 그것은이 시점에서 예상 클러스터 밀도, 강도 수준 및 초점 품질을 평가하는 것이 중요합니다. 사이클 4 다음으로 품질 검사 점은, 그림 7에 표시됩니다. 이 각 레인에 대한 절대 클러스터 밀도를 보여줍니다. 클러스터 밀도 850 K / mm 2 이상이 아니어야합니다. 사이클 13 후,그림 8과 같이 단계적으로 (베이스가 사이클 동안 추가되지 않은 경우) 및 (두 기지는 사이클 동안 추가 된 경우) prephasing 통계가 계산됩니다. 일반 번호는 0.1 및 0.25 사이입니다. 주요 품질 평가는 여러 품질 측정 항목을 계산하는 사이클 24, 후 가능합니다. 그림 9에 표시된 질문 30 위 읽의 비율은, 기본 통화에서 자신감을 측정하기위한 한 방법입니다. 30 Q 점수와 읽기는 기본 호출이 잘못 됐다는 1 천에 기회가 있음을 의미합니다. Q 점수는 실행 진행되면서 감소되지만, 회의 또는 질문 30를 초과 읽의보다 큰 95%으로 시작해야합니다. 그림 10과 같이 필터 (PF)을 통과 클러스터는, 실제 시퀀스 데이터가 이동 될에서 클러스터입니다. 이상적으로,이 85 % 이상이어야합니다. 클러스터 PF는 단계적으로, prephasing, 강도 및 질문 30 등 다양한 요소에 따라 달라집니다. 이 실행 진행 변경되지 않습니다. %는 정렬 ( 3 단계의 경우 : 표 1 표현 유전자와 제어 및 트롬빈 - 대우 인간의 폐 microvascular 내피 세포 모두에서 isoforms를 제공합니다. 특히,의 강도를 보여줍니다 감지에 대한 26000 소설 isoforms가있어, RNA-seq -가 microarray 기술 (3)에 의해 감지되지 알 수없는 RNAs, 대안 spliced 성적 증명서 및 대체 발기인 사용을 식별 할 수 있습니다. RNA-seq은 부정확 microarrays에 의해 정량화 또는 감지되지 않는 적은 풍부한 기록을 측정 할 수 있습니다. 그림 12과 표 2 디스플레이 differentially는 트롬빈 신호 경로의 유전자를 표명했다. 경로 토폴로지 기반의 접근 방법, 독창성 경로 분석 소프트웨어를 사용하여 :이 3 세대 기술 자료 중심 경로 분석 9 예입니다. 이 트롬빈 수용체 파 1의 표현에 변화가없는 동안 여섯 H 트롬빈 치료가 크게 트롬빈 수용체 파 4 대를 - 조절과 트롬빈 수용체 파에게 3를 내려 조절을 보여줍니다. NFkB1의 표현은 NF kB2 및 SRC는 크게 상향 조절합니다. 다른 사람이 (로 (Rho) J, Q, T1, U 및 V) 규제에게 다운 (표 4)에있는 동안로 (Rho) 가족 유전자의 일부 (로 (Rho) B, C, F 및 G)는 최대 - 규제 있습니다. MYL12B가 다운 - 규제되는 동안 마이 오신 경쇄 유전자 9 일 (MYL9)는 최대 - 규제입니다. 다른 유전자의 표현도 다운 규제 나 영향을받지 않습니다. 단계 4 : 대안 접근 방식을 사용하여 RNA-seq 결과를 확인하기 위해, 우리는 검정 세 diffe에 qRT-PCR 실험을 수행임대 유전자 (그림 13). RNA-seq 데이터에 TRAF1은 7.96 배에서 - 규제 올라, CELF1은 1.16 배에서 다운 규제했다, 그리고 FANCD2은 1.70 배에서 다운 규제되었다. qRT-PCR 데이터에서는이 해당 숫자는 7.25 배, -1.15 접어 -2.07 배, 각각 있습니다. RNA-seq 및 qRT-PCR에 의해 assayed이 세 유전자의 결과는 RNA-seq 결과를 보강 해주는 좋은 계약입니다. 표 1. 진 / 이소 형 식 요약 *.이 표는 유전자, 알려진 isoforms 및 제어와 트롬빈 - 처리 HMVEC-LBl 세포로 표현 소설 isoforms을 보여줍니다. 배 변화는 FPKM를 제어 할 수 (FPKM) 매핑 스크립트 perMillion 조각의 트롬빈의 FragmentsPerKilobase의 비율입니다. 두 그룹 사이에 2 배 이상 차이가 이러한 유전자, 알려진 isoforms과 소설 isoforms는 통계적으로 서로 다른 표현 수준을합니다 (Benjamini-Hochberg 보정 후 결정)가 있습니다. *이 테이블을 참조 4 표 2에서 재현된다. 표 2. 트롬빈 신호 경로의 Differentially 표현 유전자와 Isoforms *. *이 표는 사소한 수정을 참조 4 표 S4에서 재현된다. **, Q-값, P-값을 조정 거짓 검색 속도. 93/4393fig1.jpg "ALT ="그림 1 "/> 유전자 제어 트롬빈 총 유전자 표현 16,636 16,357 만 제어 783 만 트롬빈 504 최대 - 규제 (2 배 이상 차이) 152 다운 규제 (2 배 또는 greater 차이) 2190 알려진 Isoforms 제어 트롬빈 총 알려진 Isoforms는 표현 26,807 26,300 만 제어 1492 만 트롬빈 985 최대 - 규제 (2 배 이상 차이) 480 (2 배 이상 차이) 다운 - 규제 3574 소설 Isoforms 제어 트롬빈 총 소설 Isoforms는 표현 25,880 25,886 만 제어 418 만 트롬빈 424 최대 - 규제 (2 배 이상 차이) 1775 (2 배 이상 차이) 다운 - 규제 12,202 아래로 - 공공지나 유전자 기호 전체 접기 변경 회원 개인 접기 변경 **를 q_value FPKM 제어 FPKM 트롬빈 PLC -2.49 PLCB1 -2.97 0 6.75585 2.27611 PLCB2 -1.32 0.00183634 1.80892 1.36957 PLCB4 -10.04 6.28386E-14 0.682668 0.0679837 PLCL1 -2.53 5.26728E-09 0.602879 0.238017 Gaq -1.87 GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996 소녀 -1.56 GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795 GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198 PKC -2.15 PRKCE -1.65 0 9.36364 5.67305 PRKCI -2.14 0 6.63566 3.09818 PRKD3 -2.61 0 16.0215 6.12878 IP3R -2.60 ITPR1 -1.39 0.000018734 1.51592 1.09009 ITPR2 -3.19 0 7.23283 2.26944 CREB -2.36 CREB1 -2.36 0 5.19117 2.2004 GATA -2.33 GATA3 -2.33 0.0228108 0.716773 0.307131 TBP -1.35 TBP -1.35 2.66E-05 8.48689 6.30476 G-단백질 알파 -1.64 GNA14 -1.49 0.000122496 2.78076 1.86573 GNAI1 -1.86 0 9.88417 5.31795 GNAI3 -1.49 0 35.7592 24.0198 GNAQ -1.87 0 24.0907 12.8996 PAR3 -1.87 F2RL2 -1.87 1.02474E-06 1.51286 0.810286 SOS1 SOS1 -2.27 0 8.94353 3.94679 라스 -1.69 KRAS -2.03 0 11.2766 5.5659 NRAS -1.61 0 38.0874 23.6491 AKT -1.77 AKT3 -1.77 0 15.8228 8.94223 MLCP -2.38 PPP1CB -2.10 0 39.585 18.8199 PPP1R12A -3.56 0 15.2274 4.27516 PPP1R12B -2.66 5.28466E-13 1.92123 0.722188 FAK -1.31 PTK2 -1.31 4.3856E-10 39.7935 30.3044 p70 S6K RPS6KB1 -1.99 0 8.46312 ROCK -3.68 ROCK1 -3.54 0 19.5921 5.53112 ROCK2 -3.86 0 16.0054 4.14759 CAMK -1.17 CAMK1 1.30 0.000255587 7.90794 10.296 CAMK2D -1.74 2.22911E-12 11.4497 6.56804 CAMK4 -2.58 0.000619045 0.62714 0.243277 최대 - 공공지나 상징 전체 접기 변경 회원 개인 접기 변경 **를 q_value FPKM 제어 FPKM 트롬빈 PAR4 1.59 F2RL3 1.59 9.19043E-13 4.99867 7.9253 SRC 1.47 SRC 1.47 0 14.1085 20.675 NF-KB 1.65 NFKB1 1.66 0 19.5113 32.3457 NFKB2 2.02 0 28.7563 58.1293 침착 하 1.45 0 55.3482 80.28 부분 Up-/Partial 다운 - 공공지나 상징 전체 접기 변경 회원 개인 접기 변경 **를 q_value FPKM 제어 FPKM 트롬빈 G-단백질 할머니엄마 1.22 GNG10 -1.34 2.17216E-08 27.192 20.2206 GNG11 1.31 5.66209E-05 770.922 1011.05 GNG12 -1.44 5.11591E-13 112.397 78.3023 GNG2 2.43 6.38453E-09 0.465705 1.13132 G-단백질 베타 1.27 GNB2 1.36 1.91268E-10 137.786 187.43 GNB3 -2.69 4.71259E-11 2.58703 0.962504 GNB4 -1.61 0 15.8275 9.85484 로 (Rho) GEF -1.16 ARHGEF12 -1.67 0 30.6424 18.3015 ARHGEF2 1.33 5.80478E-08 27.6288 36.758 ARHGEF3 -1.48 0 20.3279 13.7813 ARHGEF6 -2.08 0 2.67944 1.28635 ARHGEF9 -1.54 0.00469498 1.56367 1.0159 PI3K -1.80 ATM -6.84 0 4.98972 0.729483 PIK3C2A -5.09 0 17.7894 3.49234 PIK3C3 -1.49 4.66294E-15 12.6504 8.50852 PIK3CA -3.14 0 16.8398 5.36228 PIK3CB -1.36 8.4357E-09 9.68516 7.12129 PIK3CD 1.86 0 5.6579 10.5507 PIK3CG -1.76 2.32945E-10 1.86962 1.06419 PIK3R1 -1.79 0 5.48118 3.06256 PIK3R3 -1.59 1.50915E-05 5.24549 3.30763 PIK3R4 -1.40 7.18425E-12 8.34176 5.97942 로 (Rho) 1.19 RHOB 1.31 9.48429E-06 232.232 304.587 RHOC 1.38 458.267 630.235 RHOF 1.65 0 8.29676 13.7268 RHOG 1.40 1.02141E-14 58.6003 82.0172 RHOJ -1.57 0 127.446 80.9317 RHOQ -1.52 0 16.4802 10.8122 RHOT1 -1.96 3.00071E-12 8.48834 4.33755 RHOU -1.54 0.00184367 0.900141 0.586092 RHOV -3.32 0.0056467 1 0.413912 0.124591 RND3 -1.95 0 58.0564 29.7075 MLC -1.06 MYL12B -1.43 4.87832E-11 872.075 608.472 MYL9 1.48 0 202.636 299.559
1 그림. 인간의 폐 microvascular 내피 세포에서 트롬빈로 인한 transcriptome의 RNA-seq 프로파일에 대한 프로토콜의 흐름도는. 첫째, 세포를 치료하고 분리와 RNA을 수량화. 고품질의 RNA에서 라이브러리를 준비하고 자신의 농도 (qPCR을 통해)과 품질 (bioanalyzer를 통해), 흐름 세포의 클러스터를 신고 할 수 있습니다. 시퀀싱 실행을 시작하고 실행의 질을 걸쳐 분석 할 수 있습니다. 주요 품질 체크 포인트주기 1, 4, 13, 24입니다. CASAVA을 사용하여 BCL 파일 fastq 파일로 변환 한 후 TopHat있는 게놈에 사람들을 맞 춥니 다. 커프스 단추를 사용하여 알려진 알려지지 않은 isoforms을 감지하고 CuffDiff로 차등 식을 지정합니다. Excel에서 출력 파일을보기보다 0.05 FPKM 표현 수준 또는 0.05보다 큰 P-값이 유전자를 필터링합니다. 유전자 기능에 대한 자세한 내용은 독창성 경로 분석에 남아있는 유전자를 제출하고 경로트롬빈 치료에 의해 ffected. 보통 differentially 표현 유전자 세트를 선택 등 qRT-PCR로 다른 방법에 의해 확인됩니다. 
그림 2. 로 Experion 자동 전기 영동 역으로 분석 8.4의 RQI있는 대표적인 RNA 샘플 A) 고품질의 RNA의 개인 추적 -.. x 축 시간을 묘사하고 y 축은 형광 신호를 묘사 B) 가상 젤 사진 높은 품질의 RNA 샘플의. 28S 피크의 강도는 18S 피크보다 더 큰이며, 오염이 볼 수 없습니다. 두 밴드는 샤프하고 정의합니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. RNA의 준비 고품질의 라이브러리는 Experion 자동 전기 영동 역으로 분석 250 300 BP 사이의 폭 넓은 피크가 감지되고 더 높은 분자량의 DNA가 (DNA를 오염) 관찰되지 않습니다)은 고품질의 라이브러리의 개별 추적.. - X 축은 시간을 묘사하고 y 축은 형광 신호를 고품질의 라이브러리 B) 가상 젤 그림을 도시한다. 250 300 BP 사이의 폭 넓은 피크가 감지되고 더 높은 분자량의 DNA는 (DNA를 오염) 관찰되지 않습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
<STRONG> 그림 4. SyberGreen와 프리 머 Illumina 출혈도 잡았 어댑터에 특정한를 사용하여 qPCR 결과는. 이전에 클러스터 라이브러리는 새로 준비 라이브러리에 대한 최적의 클러스터링 농도를 결정하기 위해 표준 곡선으로 사용됩니다. 알 수없는 라이브러리의 희석은 표준 곡선 농도 내에서 떨어진다. 표준 곡선 샘플은 화살표로 기소하고 미지의 샘플은 화살표의 파란색과도 표시 어두운합니다.
그림 5. . 첫 번째 사이클 이미징 단계에서 적절한 클러스터 밀도 클러스터는 명확 초점을 맞춘 밝고 A)베이스 A;. B)베이스 C, C)베이스 G, D)베이스 T.
| 측정 항목 | 차선 하나 | | 차선 세 | 레인 4 | 레인 5 | 레인 6 | 레인 7 | 레인 8 | |
| 클러스터 밀도 (K / mm 2) | 420.94 | 412.95 | 410.81 | 408.54 | 416.71 | 416.56 | 410.02 | 411.84 |
| 강도 | 25870.5 | 23,886 | 23891.38 | 23735.83 | 23949.38 | 24933.08 | 24305.79 | 23950.29 |
| C 강도 | 21559.62 | 19822.33 | 19759.33 | 19,472 | 19954.21 | 20611.75 | <TD> 19,89219438.29 | |
| G 강도 | 13619.46 | 11756.67 | 11486.44 | 10498.38 | 12186.62 | 12195.5 | 11826.88 | 11010.5 |
| T 강도 | 19402.67 | 17663.79 | 17854.42 | 17353.75 | 17545.54 | 18060.67 | 18457.92 | 17397.12 |
| 초점 점수 | 68.2 | 67.46 | 67.67 | 67.75 | 67.41 | 67.43 | 67.63 | 67.05 |
| C 초점 점수 | 67.93 | 67.33 | 67.56 | 67.66 | 67.33 | 67.39 | 67.46 | 66.9 |
| G 포커스 점수 | 65.4 | 64.14 | 63.98 | 63.92 | 63.29 | 63.41 | 63.47 | 63.74 |
| T 초점 점수 | 66.45 | 65.57 | 65.5 | 65.49 | 65.03 | 65.23 | 65.57 | 65.59 |
6 그림. 첫 번째 사이클 이후에 생성 된 첫 번째 자료 보고서가 완료되었습니다. 클러스터 밀도 (이 단계에서 과소 평가하지만) 적합합니다. 농도는 (10,000-26,000, G는 가장 낮은 강도를 갖는 포함) 좋아 보여요. 높은 값은 또한 적절한 있지만 초점 점수는 65-70 주위에 떨어지지도 적합합니다.
g7.jpg "ALT ="그림 7 "/>
그림 7. 클러스터 밀도는주기 4 이후에 계산 클러스터 밀도는 850 K / mm 2보다 낮은, 심지어 모든 차선에 걸쳐 있습니다 A) 표 양식,... B) 그래프 형태로 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 8. 중단 (사이클 동안베이스를 추가하지) 및 (사이클 동안 두 기지를 추가) 사전 중단. 모두 값이 아래에서 0.25하거나 적절한 사전에 중단 / 중단 수준을 나타냅니다. A) 중단 및 사전 단계적으로 수치 . B) 그래프 형태로 단계적으로 값이. C) 사전 단계적으로 그래프 형태로 값을. Clic 큰 그림을 보려면 여기를 K.
9 그림. 사이클 24 후 질문 30 점수의 다른 표현이 있습니다. 30 이상의 점수는 기본 호출이 잘못 됐다는 1 천에서 기회를 나타냅니다. Q 점수의 90 % 정도는 30 위 아르 A) 표 양식 (여기서 질문 30 점수는 사이클 24을 통해 실행의 전체 출신). 사이클에 의해 B) 질문 30 점수. 각 막대는주기 24를 통해 특정주기에 위의 질문 30하거나 떨어지는 읽습니다. C) 질문 30 점수 분포의 분포를 나타냅니다. 사이클 24를 통해 누적 기준으로 Q 점수의 분포. Q 점수는 x-축과 읽기의 수백만 y 축에에 있습니다. 30 위의 질문 30 녹색으로 표시됩니다으로 읽습니다.oad/4393/4393fig9large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
10 그림. 필터를 통과 필터입니다. 클러스터를 통과 클러스터의 다른 표현은 질문 30, 강도 및 사전 중단 / 중단 등 여러 매개 변수를 기준으로합니다. 클러스터의 최소 85 %는 각 차선 필터를 전달하는 A) 표 양식,. B) 그래프 양식, 파란색 상자는 클러스터의 총 수를 나타내는, 녹색 상자는 필터를 통과 클러스터를 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
11 그림. . PhiX의 게놈으로 정렬 클러스터의 약 0.5 % 클러스터의 비율은 샘플까지 치솟았 PhiX의 양에 적합한, PhiX의 게놈에 정렬 A) 표 양식을,.. B) 그래프 형태는 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 12. differentially 트롬빈 신호 경로에서 HMVEC-LBl의 트롬빈 치료에 의해 표현 유전자가. 트롬빈 신호 경로는 독창성에 의해 건설되었습니다. 경로에서 붉은 색은 유전자 (3 1.3 배), 녹색 다운 조절 유전자 (-규제를 나타냅니다
13 그림. 트롬빈 - 처리 HMVEC-LBl RNA-seq 데이터에서 세 differentially 표현 유전자의 qRT-PCR 확인. 프로토콜에 설명 된대로 qRT-PCR이 수행되었다. CUGBP의 TaqMan의 유전자 발현 분석의 상대적 CT 값에서 결정 접기 변경 사항을, 가족 1 (CELF1), Fanconi 빈혈, complementation 그룹 D2 (FANCD2)와 TNF Elav 같은 수용체 - 관련 인자 1 (TRAF1)RNA-seq에 의해 감지 사람들에게 비교했다. 복제 (N = 4) 각 샘플의 대부분은 실행 CT 값은 평균했습니다. 모든 CT 값은 β-고를으로 표준화되었다. 오차 막대는 데이터가 소프트웨어를 지원 결정에 따라 배 변화의 범위를 나타냅니다. P는 <0.05는 RNA-seq 및 qRT-PCR assays 모두에 의해 트롬빈 - 대우 그룹과 통제 집단 사이의 상대적 배 변화에 통계적으로 의미있는 것으로 간주되었다. 각 분석에 의한 제어 그룹에서 mRNA 수준은 임의로 표시되지 않습니다 하나로 설정되었습니다. * P <0.05, ** P <0.01. 이 수치는 참조 4 그림 6에서 재현된다.
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Discussion
주요 단계
RNA 처리 : RNases는, 가장 높은 품질의 RNA를 저하됩니다 따라서 치료는 RNA (10)의 분리, 저장, 사용하는 동안주의해야합니다. 장갑은 항상 인간의 손에있는 RNases하여 오염을 방지하기 위해 착용하고 있습니다. 장갑은 특히 터치 피부, 문 손잡이 또는 기타 일반적인 표면 후, 자주 변경해야합니다. 피펫의 세트 작업을 RNA에 전적으로 헌신해야하고 모든 팁과 튜브는 RNase 무료이어야합니다. RNA 격리 및 응용 프로그램 하류는 정기적으로 이러한 RNase-해치와 같은 제품과 함께 소독 아르 트래픽이 낮은 지역에서 수행해야합니다. 저하는 반복 냉동 해동 사이클 발생할 수 있습니다. 이러한 고립 즉시 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 RNA를 aliquoting하여 최소화 할 수 있습니다. 또는 cDNA 직접 고립 된 이후로 qRT-PCR과 같은 다운 스트림 응용 프로그램에 만들 수 있습니다. RNA는 -80 ° C에서 저장하고 사용하는 동안 얼음에 보관해야합니다. 또한 노출이철저하게 해동 할 ortant과 소용돌이 RNA 샘플 전 및 사용 중.
RNA의 시작 품질이 프로토콜의 성공에 필수적입니다. 성능이 저하되거나 품질이 낮은 RNA를 사용 시퀀싱에 대한 불충분 한 수 낮은 수율에 실패하거나 결과로 도서관 준비가 발생할 수 있습니다. 충분한 라이브러리가 저하 또는 낮은 품질의 RNA로 만들어 수 있지만, 정확하게 표현의 부정확 한 정량화의 결과로, 샘플에 존재 성적표를 대표하지 않습니다. 또한, RNA 격리하는 동안 unremoved 게놈의 DNA는 프로토콜에 사용되는 RNA의 양의 오버 견적을 일으킬 수 있지만 경우 제안 된 범위의 중간에 금액 (예 : 1-2 μg) (0.1-4 μg) 사용되며, RNA의 실제 크기는 프로토콜에 대한 충분한 것입니다. 또한, 모든 게놈 DNA는 표준 Illumina 프로토콜의 oligo (DT) 프라이머 기반의 라이브러리 구축에 의해 픽업 될 가능성이 아니며, 결국은 다운 스트림 ISS가 발생하지 않습니다표현 mRNA 대본 수준 ues. 일반 분광 판독를 사용하여 시작 RNA의 정량화가 충분해야하며 라이브러리가 정확하게 qPCR와 유전자 발현 수준으로 준비 후에 정량화되기 때문 등 RiboGreen과 같은 고도의 정확한 정량 방법을 사용 할 필요가의 총 수를 기준으로 표준화 아르가 없습니다 데이터 분석 단계에서 읽습니다.
도서관 정량화. 도서관 정확한 정량화는 클러스터의 적절한 생성에 매우 중요합니다. 성공적으로 출혈도 잡았 어댑터 만 DNA 분자는 클러스터를 형성합니다. 분광 분석으로는 도서관의 농도의 과잉 평가를 얻을 수있는없이 어댑터 및 DNA와 DNA를 구별하고 궁극적으로 흐름 세포의 미만 클러스터링 될 수 없습니다. 출혈도 잡았 어댑터없이 DNA의 양은 같은 RNA가 시작할 때 사용 된 경우에도 도서관에서 도서관에 다를 수 있습니다ING 자료, 그래서 하나는 정확하게 분광 읽기의 표준 비율 출혈도 잡았 어댑터와 DNA이라고 가정 할 수 없습니다. 어댑터에 고유 프리 머와 함께 qPCR을 수행하면 성공적으로 분자의 양쪽에 출혈도 잡았 어댑터를 장착 해 만의 DNA 분자를 감지합니다. 이 라이브러리의 절대 정량화 수와의 정확한 클러스터 밀도를 설정합니다. Experion 기기 또는 bioanalyzer있는 도서관 평가도 중요합니다. 이 데이터 분석 단계에서 중요 라이브러리의 크기 범위의 시각화를 허용하고, 클러스터 생성에 방해가 될 수 오염이 없다는 것을 보장합니다.
데이터 분석.이 프로토콜에서는, 우리는 RNA-seq는 기록을 조립의 abundances를 추정하고, 트롬빈 - 처리 HMVEC - LBl 셀에 차등 표현을위한 테스트하기 위해 인간의 기준 transcriptome와 커프스 단추를 읽고 정렬 할 수 TopHat 적용. TopHat와 커프스 단추는 t 아르앨리스 인기 도구, 그들은 무료 오픈 소스 소프트웨어 11아르. 최근 연구 커프스 단추는 이전에 다음 ID로 주석 introns 12을 검출에서 높은 감도와 특이성이 있다고했다. 그러나, TopHat와 커프스 단추는 RNA-seq의 모든 응용 프로그램을 해결하지 않고 그들은 RNA-seq 분석 11 만 도구입니다. TopHat와 커프스 단추는 순 참조 transcriptome 또는 게놈이 필요합니다. 그들은 Illumina 또는 고체 시퀀싱 기계가 아닌 454 또는 플랫폼을 시퀀싱 고전 모세관 전기 영동 하나에서 생성 된 RNA-seq 데이터의 분석을 위해 특히 적합합니다. 순 참조 게놈없이 작동하는 사용자는 삼위 일체 (같은 몇 가지 도구 중 하나를 사용 드 노보 transcriptome 조립을 수행하는 것도 고려해 볼 수 있습니다 http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), 트랜스 심연 ( http://ww을w.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) 또는 Oases ( / http://www.ebi.ac.uk/ ~ 비노 / oases ). 많은 다른 transcriptome 분석 프로그램은 이제 존재합니다. 다른 프로그램의 설문 조사를 들어, 독자는 가버 외하여 연구를 읽어 할 수 있습니다. 13 비교 장점과 단점 및 대부분의 현재와 일반적으로 사용되는 프로그램의 이론적 고려 사항을 설명 마틴과 왕 14으로 검토. transcriptome 분석 전략 (참조 기반 전략, 드 노보 전략 및 통합 전략) 및 프로그램의 선택 기준 게놈의 존재 나 완전성, 자원을 순서 및 계산의 가용성, 설정 데이터의 유형 등 다양한 요소에 따라 달라집니다 생성하고, 가장 중요한 시퀀싱 프로젝트 14 가지 목표.
또 다른 점은 이루어져야합니다 : 공동transcriptome 분석을위한 mputer 프로그램은 모든 스크립트보고 100 %의 정확도를 얻을 수 없습니다. 오류를 시퀀싱하는 것은 또 다른 문제입니다. 이 RNA-seq에 의해 식별 된 differentially 표현 증명서가 실시간 PCR에 의해 확인하는 것이 항상 바람직하다. TaqMan 프로브 기반 화학은 실시간 PCR을위한 황금 표준으로 간주됩니다. 또한, 새로 확인 된 성적은 더 이상의 실험하기 전에 DNA 배열의 Sanger 방법에 의해 검증되어야합니다.
문제 해결
도서관 준비 : 도서관 준비 단계에 의해 발생 될 수 높은 분자량의 게놈의 DNA의 비방 후 연행을 통해 도서관 준비 중에 마지막 구슬 정화 단계에서. 전체 5 분 동안 자기 스탠드에 라이브러리를 반환하면 문제가 해결 될 수 있습니다. 그렇지 않으면 문제는 도서관 준비의 첫 번째 단계에서 RNA의 불완전한 조각에서 비롯 될 수 있습니다. 이러한 문제가 발생할 수 있습니다 경우 낮은품질 RNA가 사용됩니다 또는 프로토콜은 정확히 따라하지 않는 경우. 예를 들어, 잘못된 순서로 시약을 추가하거나 단편화와 cDNA의 첫 번째 가닥의 합성 사이에 일시 중지, 배양 시간이나 온도를 변경. 자기 스탠드에 라이브러리를 반환하면 높은 MW의 DNA를 제거하지 않는 경우 신선한 RNA 샘플과 라이브러리 준비를 반복 좋습니다.
낮은 강도 : 첫 번째 사이클 강도는 예상보다 낮다면, 프리 머 클러스터 생성 또는 흐름 세포의 마지막 단계에서 적절히 클러스터에 잡종을 만들다하지 않았기 때문일 수 있습니다는 클러스터링 및 시퀀싱의 시작 사이에 너무 오래 저장된 실행합니다. 이 경우, 프라이머 rehybridization은 Illumina에서 프라이머 rehyb 키트를 사용하여 수행해야합니다. 대부분이 rehyb는 강도 문제를 해결하고 운영하는 어떤 문제없이 이상 시작할 수 있습니다. rehyb 후 농도가 여전히 낮은이며, 경우, 문제가 될 수 있습니다합성 (SBS) 시약 및 Illumina 기술 서비스로 도서관이나 시퀀스를 추가 문제 해결 연락을해야합니다. 첫 번째 읽기의 농도, 좋은거야하지만 농도 주위를 회전 한 후 낮은 경우 두 번째 읽기 입문서의 프라이머 rehyb이 필요할 수 있습니다. 이것은 시퀀싱 장비 및 Illumina 기술 서비스 절차에 대한 연락을해야 수행됩니다.
중단 / prephasing 높음 : 중단 또는 prephasing 정상보다 높이 관찰되는 경우, 가능한 원인은 절단 버퍼와 다른 SBS의 시약의 오염입니다. SBS 준비 단계 동안, 그것은 절단 버퍼가 마지막으로 처리하고 절단 버퍼의 취급 및 기타 시약 사이의 장갑을 변경할 필수적입니다. 절단 버퍼 오염이 의심되는 경우, 유동 세포의 프라이머 rehyb을 수행 할 수 있어야하며 새로운 SBS의 시약이 준비되어야한다. 또는 inst의 줄에 오염이있을 수 rument. 이것이 의심되는 경우, 악기 유지 보수 세척 (물이 최종 물 세척 한 다음, NaOH 세탁 다음 씻어) 받아야한다 프라이머 rehyb는 유동 세포에서 수행해야하고 새로운 SBS의 시약이 준비되어야한다. 중단 / prephasing 값이 (~ 0.5) 적당히 높은 경우 필터를 통과 질문 30 점수 및 클러스터 계산 될 때까지 실행이 계속 될 수 있습니다. 이 수준은 아직까지 높은 단계적 및 / 또는 prephasing과 허용 한계에있을 수 있습니다.
이 프로토콜의 Generalizability
이 Illumina HiScanSQ에 고유 있지만,이 프로토콜은 HiSeq의 가족이나 Illumina 계기의 게놈 분석기 II (중 적용됩니다 www.illumina.com 클러스터 생성 단계와 순서 시약의 별다른 변경). 이러한 고체 시리즈와 다른 차세대 DNA 시퀀싱의 플랫폼 ("_blank"> www.lifetechnologies.com), GS 시스템 ( www.454.com )뿐만 아니라 몇 가지 새로운 최신 시스템은 또한 RNA-seq (11)의 목적을 위해 고용하고 있습니다. 자신의 도서관 건설 및 시퀀싱 절차가 약간 다를 수 있습니다 만, RNA 처리 팁, RT-PCR에 의한 데이터 분석 부분 (CASAVA 단계의 하류) 및 검증는 RNA-seq 응용 프로그램에 참조 가치가있을 수 있습니다이 프로토콜에서 제공 .
그것은 또한이 프로토콜은 트롬빈 - 처리 HMVEC-LBl 셀 중 하나 시점에서 RNA-seq에 따라 달라집니다 지적해야하지만, 쉽게 여러 시간 지점 연구 또는 다른 셀의 연구에 적용 할 수 조직은과 치료 다른 자극이나 억제제, 또는 건강 상태와 질병 상태 사이의 세포 또는 조직의 transcriptomes의 비교.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 우리의 데이터 분석을 위해 자신의 컴퓨팅 클러스터의 사용에 대한 어린이의 자비 병원 및 클리닉에서 박사 스티븐 Kingsmore 및 소아 게놈 의학 센터에 진심으로 감사드립니다, Illumina의 현장 서비스 팀 (엘리자베스 Boyer, 스콧 쿡과 마크 쿡) 및 기술 자신의 빠른 응답 및 차세대 DNA 시퀀싱 장비, HiScanSQ, 데이터 품질 분석의 실행에 대한 유용한 제안에 대한 컨설턴트 팀. 이 작품은 건강 기금 HL080042 (SQY까지) 국립 연구소에 의해 일부 지원과 어린이의 자비 병원과 클리닉의 시동 기금과 기금, 캔사스 시티의 미주리 대학 (SQY까지).되었습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine - Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. | |||
References
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