Summary
Este protocolo presenta un procedimiento completo y detallado de aplicar RNA-seq, una potente tecnología de próxima generación de secuenciación de ADN, a transcriptomes perfil en humanos células endoteliales microvasculares pulmonares con o sin tratamiento con trombina. Este protocolo es generalizable a diversas células o tejidos afectados por diferentes reactivos o estados de enfermedad.
Abstract
La caracterización de la expresión génica en las células a través de la medición de los niveles de mRNA es una herramienta útil en la determinación de cómo la maquinaria transcripcional de la célula se ve afectado por señales externas (por ejemplo, tratamiento de drogas), o cómo difieren entre las células un estado saludable y un estado de enfermedad. Con el advenimiento y refinamiento continuo de la tecnología de ADN secuenciación de próxima generación, ARN-secuenciación (RNA-seq) se ha convertido en un método cada vez más popular de análisis del transcriptoma para catalogar todas las especies de transcripciones, para determinar la estructura de la transcripción de todos los genes expresados y cuantificar los cambios en los niveles de expresión de la serie total de transcripciones en un 1,2 dado célula, tejido u organismo. RNA-seq está reemplazando gradualmente microarrays de ADN como un método preferido para el análisis de transcriptoma porque tiene las ventajas de un perfil de un transcriptoma completa, proporcionando un dato de tipo digital (número de copias de cualquier transcripción) y no depender de cualquier secuencial genómico conocidoce 3.
A continuación, presentamos un protocolo completo y detallado para aplicar RNA-seq para transcriptomes perfil pulmonares humanas en células endoteliales microvasculares con o sin tratamiento con trombina. Este protocolo se basa en el estudio recientemente publicado titulado "RNA-seq revela Transcriptome novela de genes y sus isoformas en humanos células endoteliales microvasculares pulmonares tratadas con trombina," 4 en el que realizó con éxito el primer análisis completo de transcriptoma humano pulmonar de células endoteliales microvasculares tratados con trombina utilizando ARN-seq. Cedió recursos sin precedentes para nuevos experimentos para comprender mejor los mecanismos moleculares que subyacen a la trombina mediada por disfunción endotelial en la patogénesis de las enfermedades inflamatorias, cáncer, diabetes y enfermedad cardiaca coronaria, y proporciona nuevas pistas para posibles dianas terapéuticas para estas enfermedades.
El texto descriptivo de este protocolose divide en cuatro partes. La primera parte se describe el tratamiento de humanos pulmonar de células endoteliales microvasculares con trombina y el aislamiento de ARN, análisis de la calidad y la cuantificación. La segunda parte describe la construcción de bibliotecas y la secuenciación. La tercera parte se describe el análisis de datos. La cuarta describe un ensayo de validación de RT-PCR. Los resultados representativos de varios pasos claves se muestran. Consejos útiles y precauciones para impulsar el éxito en los pasos claves se proporcionan en la sección de debate. Aunque este protocolo utiliza humanos pulmonar de células endoteliales microvasculares tratados con trombina, que se pueden generalizar a transcriptomes perfil tanto en células de mamíferos y no mamíferos y en los tejidos tratados con diferentes estímulos o inhibidores, o para comparar transcriptomes en células o tejidos entre un estado saludable y un estado de enfermedad.
Protocol
Un diagrama de flujo delinear este protocolo se muestra en la figura 1.
1. El tratamiento de células con trombina, Aislamiento de ARN, Evaluación de la Calidad y cuantificación de ARN
- Cultivar células endoteliales microvasculares de pulmón (HMVEC-LBL) a 90-100% de confluencia en placas de 6 pocillos en medio EGM-2 con 5% de SFB, factores de crecimiento y antibióticos (Lonza, cat # CC-3202).
- Cambiar el medio a los medios de inanición (0% FBS) 30 min antes del tratamiento con trombina.
- Se tratan las células con 0,05 U / ml de trombina o dejar sin tratar como control durante 6 horas a 37 ° C y 5% CO 2.
- Aislar el ARN total de las células tratadas y de control utilizando el Ambion mir Vana kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Evaluar la calidad del ARN con un chip de Experion Eukaryotic StdSense ARN de acuerdo con el protocolo estándar en la estación de Electroforesis Experion automatizada (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
- Cuantificar el ARN utilizando un método espectrofotométrico estándar.
2. Biblioteca de la construcción y secuenciación
- Usar 1 mg de ARN de alta calidad total por muestra como material de partida.
- Para construir la biblioteca, siga el procedimiento estándar de Illumina (protocolo # 15008136 Rev. A). En este protocolo, dos rondas de poli (A) que contienen selecciones de ARNm se realiza para eliminar rRNA para minimizar la secuenciación de ARNr.
- Evaluar la calidad de las bibliotecas utilizando un chip de ADN Experion 1K de acuerdo con el protocolo estándar en la estación de Electroforesis Experion automatizada ( www.bio-rad.com ).
- Cuantificar la biblioteca mediante qPCR: utilizar una biblioteca que ha sido previamente secuenciados como una curva estándar y cebadores específicos para los adaptadores ligados. Utilizar una serie de diluciones de las bibliotecas desconocidos (es decir, 1:100, 1:500 y 1:1000). Ejecute el acco qPCRrding con el protocolo SyberGreen MM y calcular la concentración de la población original de cada biblioteca.
- Diluir los fondos de las bibliotecas a 10 nM y se almacena a -20 ° C hasta el momento de clúster de una célula de flujo.
- Cuando esté listo para clúster de una celda de flujo, descongele la placa reactivo CBOT en un baño de agua. CBOT es un instrumento utilizado Illumina para agilizar el proceso de generación de cluster.
- Lave el instrumento CBOT.
- Desnaturalizar las bibliotecas: Combinar 13 l TE 1x y 6 l 10 mM biblioteca y, al lado del tubo, añadir 1 l 1 N NaOH (proporcionado por Illumina). Vortex, girar hacia abajo, se incuba a temperatura ambiente durante 5 min y colocar las librerías desnaturalizadas en hielo.
- Diluir las bibliotecas: Diluir las bibliotecas desnaturalizadas con tampón de hibridación pre-enfriada (HT1, proporcionado por Illumina) mediante la combinación de 996 l HT1 y 4 desnaturalizado biblioteca l para una concentración final de 12 pM. Coloque las bibliotecas desnaturalizados y diluido en hielo.
- Invertir cada fila de tubos de la placa de CBOT,asegurar que todos los reactivos se descongelan. Girar hacia abajo la placa, elimine / perforar los sellos de aluminio y cargar en el CBOT.
- Alícuota de 120 l de las bibliotecas diluidos, desnaturalizadas a un tubo de tira, etiquetados 1-8. Añadir 1,2 l biblioteca diluida, desnaturalizado control de PhiX (de iluminación) en cada tubo como una espiga en los de control. Vortex y centrifugar los tubos y los carga en el CBOT en la orientación correcta (tubo n º 1 a la derecha).
- Cargue una celda de flujo y colector en el CBOT.
- Completar el flujo de comprobar y comenzar el largo agrupación.
- Después de la ejecución haya finalizado, compruebe la entrega de reactivos en todos los carriles. Tome nota de cualquier anomalía. Cualquiera de iniciar la ejecución de la secuencia inmediatamente o almacenar la celda de flujo en el tubo provisto a 4 ° C.
- Descongelar la secuenciación por síntesis (SBS, Illumina) reactivos.
- Cargue los reactivos a los lugares adecuados en las bandejas de reactivos, asegurándose de no tocar los otros reactivos después de tocar la mezcla de escisión.
- El uso de un non-secuenciación de flujo de células (es decir, que fue secuenciado previamente), las líneas principales de reactivos en dos ocasiones.
- Limpiar a fondo la celda de flujo de secuenciación con EtOH al 70% y Kimwipes, seguido por 70% de EtOH y papel para lentes. Inspeccione la celda de flujo para las rayas. Vuelva a limpiar si es necesario.
- Cargar la celda de flujo en el secuenciador y realizar un flujo de comprobar para asegurarse de que el sello entre los colectores y la celda de flujo es ajustado.
- Inicie la carrera de secuenciación.
- Evaluar los indicadores de calidad (por ejemplo, la densidad de cluster, racimos pasan filtro, Q30, intensidad) a medida que estén disponibles durante el funcionamiento.
- Monitorear intensidad a lo largo de la carrera.
- Después de 101 ciclos se han completado, realizar la química de respuesta para completar la segunda lectura: Descongelar los reactivos extremos apareados y el búfer de lectura Incorporación segundo (ICB, un componente de los reactivos de SBS, Illumina) y cargar los reactivos.
- Continúa la carrera de secuenciación, la evaluación 2 ª lectura intensidad, Q30 unand métricas de calidad de otros como los avances de ejecución.
3. Análisis de Datos
- Utilice la última versión de yuca (Illumina, actualmente 1.8.2) para convertir los archivos de llamadas bases (. Bcl) archivos para archivos. Fastq, estableciendo fastq-cluster-conteo a 0 para garantizar la creación de un archivo fastq único para cada muestra . Descomprimir los archivos fastq para el análisis de aguas abajo.
- Realice la alineación final emparejado con las últimas versiones de TopHat (1.4.1) 5, que se alinea RNA-seq lee a los mamíferos del tamaño de los genomas utilizando el ultra alto rendimiento a corto alineador de lectura (Bowtie, 0.12.7) 6 y SAMtools (0,1. 17) 7. SAMtools implementa varias utilidades para las alineaciones de post-procesamiento en el formato SAM. El transcriptoma humano de referencia se pueden descargar desde iGenomes ( www.illumina.com ). Al correr TopHat, hemos utilizado todos los parámetros por defecto, incluyendo la opción de tipo de biblioteca como fr-unstranded (por defecto).
- NosotrosCIÓN DEL CuffDiff programa, parte de los gemelos (1.3.0) 8 paquete de software, comparar las células tratadas con trombina en las células controles para detectar a las transcripciones de genes expresados diferencialmente en la antigua base de referencia el transcriptoma humano. Esta comparación detecta la expresión diferencial de las transcripciones conocidas. Utilice Microsoft Excel para visualizar el resultado en forma de tabla. Al correr el programa Gemelos, hemos utilizado todos los parámetros por defecto. Las transcripciones de genes con FPKM <0,05 yp <0,05 se filtran.
- Para detectar isoformas novela, ejecute Gemelos sin transcriptoma de referencia. Comparar los archivos de transcripción de ejemplo en el genoma de referencia utilizando Cuffcompare y probar la expresión diferencial con Cuffdiff utilizando los archivos de trombina combinados de transcripción como el genoma de referencia para un análisis, y los archivos de control combinados de transcripción como el genoma de referencia para un segundo análisis. Utilice Microsoft Excel para visualizar el resultado en formato tabular. Una vez más, thostranscripciones gen E con FPKM <0,05 y p> 0,05 se filtran. Después de este paso, los investigadores pueden optar por subir una lista de las transcripciones recientemente denunciados a la página web del genoma UCSC ( http://genome.ucsc.edu/ ) para verificar su validez mediante una inspección manual.
- Enviar las listas de genes expresados diferencialmente a Ingenuity Pathway Analysis (IPA, www.ingenuity.com ) para la caracterización de los genes y las vías afectadas por el tratamiento de la trombina. En este paso, los investigadores pueden optar por usar faja ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), un paquete de R que está diseñado para ayudar y simplificar la tarea de analizar Gemelos RNA-seq salida, para ayudar a administrar, visualizar e integrar todos los datos producidos por un análisis Cuffdiff.
4. La validación de los resultados de la RNA-seq por cuantitativa en tiempo real de Po-lymerase reacción en cadena (QRT-PCR)
- Realice aislamiento de ARN total de control y tratados con trombina HMVEC-LBL células, el ARN de calidad de evaluación y cuantificación del ARN se describe en los pasos 1.4 a 1.6.
- Generar ADN complementario a partir del ARN 1 microgramos totales de cada muestra con SuperScript III First-Strand Synthesis Kits sistema RT, siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, 18080-051).
- Realizar análisis de QRT-PCR en un Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System usando TaqMan ensayo-on-Demand oligonucleótidos diseñados para la detección de CUGBP, elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -factor asociado 1 (TRAF1, Hs01090170_m1), y β actina-(ACTB, Hs99999903_m1). Cada muestra tenía una plantilla equivalente a 5 ng de ARN total. Medir utilizando el método de cuantificación DDCT y normalizar para β-actina. Cada ensayo se realizó a través de al menos tres repeticiones biológica.
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Representative Results
Para el Paso 1: El 28s: relación de 18 años se utiliza tradicionalmente como un indicador de la degradación del ARN. Idealmente, el pico 28s debería tener aproximadamente dos veces el área de la banda de 18 años (una proporción de 2), sin embargo esta relación ideal no se ve a menudo en la práctica. Además, 28s: 18s coeficientes obtenidos a partir de métodos espectrofotométricos se puede subestimar la cantidad de degradación del ARN. Para cuantificar con mayor precisión la degradación, y por lo tanto la calidad de la muestra de ARN, el sistema calcula una Experion la calidad del ARN Indicador (RQI) número. El algoritmo de RQI compara el electroferograma de muestras de ARN a los datos de una serie de muestras estandarizadas, degradados ARN y vuelve automáticamente un número entre 10 (ARN intacto) y 1 (degradado ARN). La calidad del ARN debe tener un RQI de al menos 7, idealmente mayor que 8. Figura 2 muestra los resultados Experion utilizando una muestra de ARN de alta calidad con un RQI de 8,4.
ParaPaso 2: Las bibliotecas deben tener una banda ancha a aproximadamente 250-300 pb Figura 3 muestra los resultados Experion de una biblioteca de alta calidad Figura 4 muestra los resultados de qPCR de muestras de la curva estándar y una muestra desconocida (en azul oscuro)... El progreso y la calidad de la ejecución de la secuencia debe ser observado constantemente en toda la carrera Figura 5 muestra la densidad de grupo apropiado durante la etapa de ciclo de formación de imágenes primero;. Este es el primer indicio de la calidad de ejecución. Las agrupaciones deben ser brillantes y enfocados. Figura 6 muestra el Informe Primera Base generado después del primer ciclo se ha completado. Es importante para evaluar la densidad estimada de clúster, los niveles de intensidad, y la calidad foco en este punto. El punto de control de calidad siguiente, después de ciclo 4, se muestra en la Figura 7. Esto muestra que la densidad absoluta de clúster para cada carril. La densidad de clúster no debe ser superior a 850 k / mm 2. Después del ciclo 13,estadísticas de fase (cuando una base no se añade durante un ciclo) y prephasing (cuando dos bases se añaden durante un ciclo) se calculan, como se muestra en la Figura 8. Números típicos se encuentran entre 0,1 y 0,25. La evaluación de la calidad principal es posible después del ciclo 24, cuando varias métricas de calidad se calculan. El porcentaje de lecturas por encima de Q30, que se muestra en la Figura 9, es una medida de la confianza en la llamada base. Una lectura con una puntuación Q de 30 significa que hay una probabilidad de 1 en 1.000 llamada base de que es erróneo. Las puntuaciones Q disminuirá a medida que progresa la ejecución, pero debería empezar a cabo con más del 95% de las lecturas que cumplen o superan Q30. Los racimos pasan filtro (PF), que se muestran en la Figura 10, son los grupos de los que los datos de secuencias reales serán tomadas. Idealmente, esto debería estar por encima de 85%. El PF grupo se basa en muchos factores, incluyendo la eliminación gradual, prephasing, intensidad y Q30. No va a cambiar a medida que avanza el plazo. El porcentaje alineados ( Para el Paso 3: La tabla 1 presenta los genes expresados e isoformas, tanto en el control y la trombina humana tratada pulmonar de células endoteliales microvasculares. En particular, hay cerca de 26.000 nuevas isoformas detectadas, lo que ilustra la fuerza de RNA-seq-puede identificar RNAs desconocidos, transcripciones empalmados alternativamente y el uso del promotor alternativo que no sea detectable por 3 técnicas de microarrays. RNA-seq también puede medir las transcripciones menos abundantes que se hallaban correctamente cuantificados o no detectados por microarrays. Figura 12 y la Tabla 2 differentiall pantallay expresaron los genes en la vía de señalización de trombina. Este es un ejemplo del análisis de la generación de conocimientos tercera vía de base orientada 9: enfoques basados en la topología de la vía, utilizando Ingenuity Pathway Analysis software. Esto demuestra que un período de seis h tratamiento con trombina significativamente hasta regula el receptor de trombina Par 4 y regula a la baja el receptor de trombina Par 3, mientras que no hay ningún cambio en la expresión del receptor de trombina Par 1. Expresión de NFKB1, NF KB2 y Src también son significativamente hasta reguladas. Algunos de los genes de la familia Rho (Rho B, C, F y G) están reguladas mientras que otros (Rho J, Q, T1, U y V) son las reguladas (Tabla 4). Gen de la miosina de cadena ligera 9 (MYL9) está regulado mientras MYL12B es el regulado. La expresión de otros genes es o bien hacia abajo-regulada o afectada no. Para el Paso 4: Para validar los resultados de RNA-seq utilizando un enfoque alternativo, se realizó un experimento QRT-PCR de ensayo de tres difealquiler genes (Figura 13). En el RNA-seq datos, TRAF1 fue hasta reguladas por 7,96 veces; CELF1 se había reducido regulado en 1,16 veces, y FANCD2 se había reducido regulado por 1,70 veces. En QRT-PCR de datos, estos números correspondientes son 7,25 veces, -1,15 y -2,07 veces veces, respectivamente. Los resultados de estos tres genes ensayados por RNA-seq y QRT-PCR están en buena concordancia, lo que corrobora los resultados de RNA-Seq. Tabla 1. Gene / Isoforma * Resumen Expresión. Esta tabla muestra los genes, isoformas conocidas y nuevas isoformas expresadas en control y células tratadas con trombina HMVEC-LBL. El factor de cambio es la relación de FragmentsPerKilobase trombina de fragmentos perMillion transcripción cartografiadas (FPKM) para controlar FPKM. Esos genes, las isoformas conocidas e isoformas novedosos con diferencia de 2 veces o más entre los dos grupos tienen niveles de expresión estadísticamente diferentes (tal como se determina después de Benjamini-Hochberg corrección). * Esta tabla se reproduce a partir de la Tabla 2 en la Referencia 4. Tabla 2. Los genes expresados diferencialmente y isoformas en trombina vía de señalización *. * Esta tabla es una traducción automática S4 Tabla de Referencia 4 con una pequeña modificación. **, Q-valor, un falso descubrimiento tasa ajustada p-valor. 93/4393fig1.jpg "alt =" Figura 1 "/> Genes Controle La trombina Genes Expresados totales 16.636 16.357 Control sólo 783 Trombina sólo 504 Hasta reguladas (diferencia de 2 veces o más) 152 Down-regulación (2 veces o greater diferencia) 2.190 Isoformas conocidas Controle La trombina Total de las isoformas conocidas Expresado 26.807 26.300 Control sólo 1.492 Trombina sólo 985 Hasta reguladas (diferencia de 2 veces o más) 480 Abajo reguladas (diferencia de 2 veces o más) 3.574 Las isoformas Novel Controle La trombina Las isoformas totales Novel Expresado 25.880 25.886 Control sólo 418 Trombina sólo 424 Hasta reguladas (diferencia de 2 veces o más) 1.775 Abajo reguladas (diferencia de 2 veces o más) 12.202 Los genes regulados Gene Symbol Doble cambio global Miembros Doble cambio individual q_value ** FPKM control FPKM trombina PLC -2,49 PLCB1 -2,97 0 6,75585 2,27611 PLCB2 -1,32 0.00183634 1,80892 1,36957 PLCB4 -10,04 6.28386E-14 0.682668 0,0679837 PLCL1 -2,53 5.26728E-09 0.602879 0.238017 GAQ -1,87 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 Gai -1,56 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 PKC -2,15 PRKCE -1,65 0 9,36364 5,67305 PRKCI -2,14 0 6,63566 3,09818 PRKD3 -2,61 0 16,0215 6,12878 IP3R -2,60 ITPR1 -1,39 0,000018734 1,51592 1,09009 ITPR2 -3,19 0 7,23283 2,26944 CREB -2,36 CREB1 -2,36 0 5,19117 2,2004 GATA -2,33 GATA3 -2,33 0.0228108 0.716773 0.307131 TBP -1,35 TBP -1,35 2.66E-05 8,48689 6,30476 G-proteína alfa -1,64 GNA14 -1,49 0,000122496 2,78076 1,86573 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 PAR3 -1,87 F2RL2 -1,87 1.02474E-06 1,51286 0.810286 SOS1 SOS1 -2,27 0 8,94353 3,94679 Ras -1,69 KRAS -2,03 0 11,2766 5,5659 NRAS -1,61 0 38,0874 23,6491 AKT -1,77 Akt3 -1,77 0 15,8228 8,94223 PCML -2,38 PPP1CB -2,10 0 39,585 18,8199 PPP1R12A -3,56 0 15,2274 4,27516 PPP1R12B -2,66 5.28466E-13 1,92123 0.722188 FAK -1,31 PTK2 -1,31 4.3856E-10 39,7935 30,3044 p70 S6K RPS6KB1 -1,99 0 8,46312 ROCA -3,68 ROCK1 -3,54 0 19,5921 5,53112 ROCK2 -3,86 0 16,0054 4,14759 CAMK -1,17 CAMK1 1,30 0,000255587 7,90794 10,296 CAMK2D -1,74 2.22911E-12 11,4497 6,56804 CAMK4 -2,58 0,000619045 0,62714 0.243277 Hasta los genes regulados Símbolo Doble cambio global Miembros Doble cambio individual q_value ** FPKM control FPKM trombina PAR4 1,59 F2RL3 1,59 9.19043E-13 4,99867 7,9253 Src 1,47 Src 1,47 0 14,1085 20,675 NF-kB 1,65 NFKB1 1,66 0 19,5113 32,3457 NFKB2 2,02 0 28,7563 58,1293 RELA 1,45 0 55,3482 80,28 Parciales Up-/Partial los genes regulados Símbolo Doble cambio global Miembros Doble cambio individual q_value ** FPKM control FPKM trombina G-proteína gammamá 1,22 GNG10 -1,34 2.17216E-08 27,192 20,2206 GNG11 1,31 5.66209E-05 770,922 1011.05 GNG12 -1,44 5.11591E-13 112,397 78,3023 GNG2 2,43 6.38453E-09 0.465705 1,13132 G-proteína beta 1,27 GNB2 1,36 1.91268E-10 137,786 187,43 GNB3 -2,69 4.71259E-11 2,58703 0.962504 GNB4 -1,61 0 15,8275 9,85484 Rho GEF -1,16 ARHGEF12 -1,67 0 30,6424 18,3015 ARHGEF2 1,33 5.80478E-08 27,6288 36,758 ARHGEF3 -1,48 0 20,3279 13,7813 ARHGEF6 -2,08 0 2,67944 1,28635 ARHGEF9 -1,54 0.00469498 1,56367 1,0159 PI3K -1,80 Cajero automático -6,84 0 4,98972 0.729483 PIK3C2A -5,09 0 17,7894 3,49234 PIK3C3 -1,49 4.66294E-15 12,6504 8,50852 PIK3CA -3,14 0 16,8398 5,36228 PIK3CB -1,36 8.4357E-09 9,68516 7,12129 PIK3CD 1,86 0 5,6579 10,5507 PIK3CG -1,76 2.32945E-10 1,86962 1,06419 PIK3R1 -1,79 0 5,48118 3,06256 PIK3R3 -1,59 1.50915E-05 5,24549 3,30763 PIK3R4 -1,40 7.18425E-12 8,34176 5,97942 Rho 1,19 RHOB 1,31 9.48429E-06 232,232 304,587 RHOC 1,38 458,267 630,235 RHOF 1,65 0 8,29676 13,7268 RhoG 1,40 1.02141E-14 58,6003 82,0172 RHOJ -1,57 0 127,446 80,9317 RHOQ -1,52 0 16,4802 10,8122 RHOT1 -1,96 3.00071E-12 8,48834 4,33755 Rhou -1,54 0.00184367 0.900141 0.586092 RHOV -3,32 0.0056467 1 0.413912 0.124591 Rnd3 -1,95 0 58,0564 29,7075 MLC -1,06 MYL12B -1,43 4.87832E-11 872,075 608,472 MYL9 1,48 0 202,636 299,559
Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo para la RNA-seq perfil del transcriptoma mediada por trombina humanos en células endoteliales pulmonares microvasculares. Primero, el tratamiento de las células y aislar y cuantificar el ARN. Preparar bibliotecas a partir del ARN de alta calidad y evaluar su concentración (a través de qPCR) y la calidad (a través de un bioanalizador), luego de clúster en una célula de flujo. Iniciar la ejecución de la secuencia y analizar la calidad de la carrera a lo largo de. Los puntos de control de calidad más importantes son los ciclos 1, 4, 13 y 24. Con yuca, convertir los archivos en archivos bcl fastq y luego alinear las del genoma con TopHat. Detectar las isoformas conocidas y desconocidas utilizando mancuernas y determinar la expresión diferencial con CuffDiff. Ver los archivos de salida en Excel y filtrar los genes que tienen un nivel de expresión menor que 0,05 FPKM o un valor de p mayor que 0,05. Presentar los genes restantes para Ingenuity Pathway Analysis para obtener más información acerca de las funciones de los genes y las vías de unffected por el tratamiento con trombina. Por lo general, conjunto seleccionado de genes expresados diferencialmente se validan mediante un enfoque alternativo, como QRT-PCR. 
Figura 2. Un representante de la muestra de ARN con un RQI de 8,4 tal como se analizó por la estación de Electroforesis Experion Automated A) La traza individual de alta calidad ARN -.. El eje x representa el tiempo y el eje Y representa la señal fluorescente B) La imagen virtual de gel de una muestra de ARN de alta calidad. La intensidad del pico 28S es mayor que pico 18S y no hay contaminación se ve. Ambas bandas son nítidas y definidas. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Biblioteca de alta calidad preparado a partir de ARN tal como se analizó por la estación de Electroforesis Experion Automated un pico ancho entre 250 y 300 pb se detecta y no de ADN de alto peso molecular (ADN contaminante) observada es a) el rastreo individual de una biblioteca de alta calidad.. - el eje x representa el tiempo y el eje Y representa la señal fluorescente B) La imagen del gel virtual de una biblioteca de alta calidad. Un pico ancho entre 250 y 300 pb se detecta y no ADN de alto peso molecular (ADN contaminante) se observa. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
<strong> Figura 4. resultados qPCR utilizando SyberGreen y cebadores específicos para Illumina adaptadores ligados. Una biblioteca previamente agrupado se utiliza como curva estándar para determinar la concentración de agrupamiento óptima para la biblioteca recién preparado. La dilución de la biblioteca desconocido cae dentro de las concentraciones de la curva estándar. Las muestras de la curva estándar se procesó por las flechas y la muestra desconocida es azul oscuro y se indica también mediante una flecha.
Figura 5. . Densidad grupo apropiado durante la etapa de ciclo de imágenes primero Los racimos son claro, enfocado y brillante A Base) A;. B) Base C; C) Base G, D) Base T.
| Métrico | Carril 1 | | Carril 3 | Carril 4 | Carril 5 | Carril 6 | Carril 7 | Carril 8 | |
| Cluster Densidad (k / mm 2) | 420,94 | 412,95 | 410,81 | 408,54 | 416,71 | 416,56 | 410,02 | 411,84 |
| A Intensidad | 25870,5 | 23886 | 23.891,38 | 23.735,83 | 23.949,38 | 24.933,08 | 24.305,79 | 23.950,29 |
| C Intensidad | 21.559,62 | 19.822,33 | 19.759,33 | 19472 | 19.954,21 | 20.611,75 | <td> 1989219.438,29 | |
| G Intensidad | 13.619,46 | 11.756,67 | 11.486,44 | 10.498,38 | 12.186,62 | 12195,5 | 11.826,88 | 11010,5 |
| T Intensidad | 19.402,67 | 17.663,79 | 17.854,42 | 17.353,75 | 17.545,54 | 18.060,67 | 18.457,92 | 17.397,12 |
| Un focus score | 68,2 | 67,46 | 67,67 | 67,75 | 67,41 | 67,43 | 67,63 | 67,05 |
| Puntuación Focus C | 67,93 | 67,33 | 67,56 | 67,66 | 67,33 | 67,39 | 67,46 | 66,9 |
| G Score Focus | 65,4 | 64,14 | 63,98 | 63,92 | 63,29 | 63,41 | 63,47 | 63,74 |
| T Score Focus | 66,45 | 65,57 | 65,5 | 65,49 | 65,03 | 65,23 | 65,57 | 65,59 |
Figura 6. El Informe Primera Base generado después del primer ciclo se ha completado. La densidad de cluster (aunque subestimada en esta etapa) es apropiada. Las intensidades se ven bien (10,000-26,000, con G tiene la menor intensidad). Las puntuaciones de enfoque también son apropiadas, cayendo alrededor de 65-70, aunque los valores más altos son también apropiadas.
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Figura 7. La densidad de grupo calculado después de ciclo de 4 La densidad de cluster es inferior a 850 k / mm 2 e incluso a través de todas las vías a) Forma Tabular;... B) Forma Gráfica Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 8. Fases (no añadir una base durante un ciclo) y Pre-fase (añadiendo dos bases durante un ciclo). Ambos valores están en o por debajo de 0,25, lo que indica apropiadas phasing / pre-eliminación niveles. A) La eliminación gradual y progresiva pre-valores numéricos . B) Los valores de eliminación gradual en forma de gráfico. C) La pre-eliminación valores en forma de gráfico. Clic k aquí para ampliar la figura.
La Figura 9. Las diferentes representaciones de Q30 resultados después del ciclo 24. Una puntuación de 30 o más indica una probabilidad de 1 en 1.000 la llamada base es erróneo. Alrededor del 90% de las puntuaciones están por encima de Q 30 A formulario) tabular (Q30 resultados aquí son de la totalidad de la carrera, a través del ciclo 24);. B) Q30 puntuaciones por ciclo. Cada barra representa la distribución de las lecturas cayendo a Q30 o más para ese ciclo en particular. C) Q30 puntuación de las distribuciones a través de ciclo 24. La distribución de los puntajes Q de forma acumulativa a través del ciclo 24. Puntuación Q está en el eje x y millones de Lecturas está en el eje y. Lee con una Q30 arriba 30 se representan en verde.oad/4393/4393fig9large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ampliar la figura.
Figura 10. Las diferentes representaciones de las agrupaciones que pasan Clusters filtro. Pasan filtro se basa en varios parámetros, incluyendo Q30, la intensidad y la eliminación gradual / pre-fase. Al menos el 85% de los racimos pasan el filtro en cada carril de un formulario) Tabular;. B) Forma de gráficos, cuadros azules representan el número total de grupos, cajas verdes representan los grupos que pasan los filtros. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 11. . El porcentaje de los grupos alineados al genoma PhiX Aproximadamente el 0,5% de los racimos se alinean con el genoma PhiX, apropiado para la cantidad de PhiX se disparó en las muestras de un formulario) Tabular;.. B) Forma Gráfica Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 12. Los genes expresados diferencialmente en el tratamiento de la trombina HMVEC-LBL en la vía de señalización de trombina. La vía de señalización de trombina fue construido por el ingenio. En el camino, el color rojo indica hasta de genes regulados (3 1.3 veces) y verde abajo-genes regulados (
Figura 13. QRT-PCR validación de tres genes expresados diferencialmente de trombina tratados HMVEC LLB-RNA-seq datos. QRT-PCR se llevó a cabo como se describe en el protocolo. Doble cambios determinados a partir de los valores relativos de Ct del ensayo TaqMan Gene Expresión de CUGBP, elav-como miembro de la familia 1 (CELF1), anemia de Fanconi, grupo complementario D2 (FANCD2) y TNF asociada al receptor, factor 1 (TRAF1)fueron comparados con los detectados por RNA-seq. Repeticiones (n = 4) de cada muestra se realizaron y se promediaron los valores de Ct. Todos los valores de Ct se normalizaron a β-actina. Las barras de error representan la gama de las veces el cambio según lo determinado por los datos Assist software. p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo en los cambios relativos de plegado entre grupo trombina-tratamiento y el grupo control tanto por la RNA-seq y los ensayos de QRT-PCR. El nivel de ARNm en los grupos de control por cada ensayo se fijó arbitrariamente como una sola, que no se muestran. *, P <0,05; **, p <0,01. Esta figura se reproduce a partir de la Figura 6 en la Referencia 4.
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Discussion
Los pasos clave
Manejo de ARN: RNasas se degradará hasta la más alta calidad del ARN, por lo tanto se debe tener cuidado durante el aislamiento, el almacenamiento y el uso de RNA 10. Los guantes se usan siempre para prevenir la contaminación por RNasas se encuentran en manos humanas. Los guantes deben ser cambiados con frecuencia, especialmente después de tocar la piel, pomos de las puertas u otras superficies comunes. Un conjunto de las pipetas deben estar dedicados exclusivamente al ARN trabajo y todos los consejos y los tubos debe ser libre de RNasa. Aislamiento de ARN y aguas abajo aplicación debe realizarse en zonas de bajo tráfico que son rutinariamente descontaminados con un producto, tales como RNasa-Zap. La degradación también puede ocurrir con repetidos ciclos de congelación-descongelación. Estos pueden ser minimizados por división en alícuotas de ARN para aplicaciones posteriores inmediatamente después del aislamiento. Alternativamente, el ADNc se puede hacer por aplicación aguas abajo, tales como QRT-PCR directamente después del aislamiento. ARN deben ser almacenados a -80 ° C y se mantuvo en hielo durante su uso. También es importante para descongelar completamente y vórtice ARN muestras antes y durante el uso.
La calidad inicial del ARN es esencial para el éxito de este protocolo. Uso de degradados o de otro modo de baja calidad ARN puede causar la preparación de biblioteca a fallar o de bajo rendimiento que será insuficiente para la secuenciación. Incluso si biblioteca suficiente se puede hacer de ARN degradado o de baja calidad, no representará exactamente las transcripciones presentes en la muestra, resultando en la cuantificación inexacta de expresión. También, cualquier ADN genómico no removida durante el aislamiento de ARN puede causar una sobre estimación de la cantidad de ARN usadas en el protocolo, pero si una cantidad (por ejemplo, 1-2 g) en el medio del rango indicado (0.1-4 mg) se utiliza, la cantidad real de ARN será suficiente para el protocolo. Además, cualquier ADN genómico no es probable que sea recogido por oligo (dT) cebador de construcción de biblioteca basada en el protocolo de iluminación estándar y por lo tanto, no causará iss aguas abajolores expresados con los niveles de mRNA transcripción. La cuantificación del ARN de partida utilizando regulares lecturas espectrofotométricas debe ser suficiente y no hay necesidad de usar métodos cuantitativos muy exactos, tales como RiboGreen desde las bibliotecas se cuantificar con precisión después de la preparación de qPCR y los niveles de expresión de genes se normalizaron en relación con el número total de lee durante las etapas de análisis de datos.
Cuantificación Biblioteca. Cuantificación precisa de las bibliotecas es vital para la generación adecuada de las agrupaciones. Sólo las moléculas de ADN con adaptadores ligados con éxito se forman agrupaciones. Lecturas espectrofotométricas no diferenciar entre ADN con los adaptadores y sin ADN, lo que dará lugar a una sobreestimación de la concentración de la biblioteca y en última instancia resultar en virtud de la agrupación de la celda de flujo. La cantidad de ADN sin necesidad de adaptadores ligados diferirá de una biblioteca a otra, incluso si el mismo ARN se utilizó como iniciarción de material, por lo que no precisa de suponer que un porcentaje estándar de la lectura espectrofotométrica es el ADN con adaptadores ligados. Realización de qPCR con cebadores específicos para los adaptadores detectará sólo aquellas moléculas de ADN con los adaptadores ligados con éxito a ambos extremos de la molécula. Esto permite una cuantificación absoluta de las bibliotecas ya su vez una densidad grupo precisa. Evaluación de las bibliotecas con un instrumento Experion o un bioanalizador también es importante. Esto permite una visualización de la gama del tamaño de la biblioteca, que es importante durante las etapas de análisis de datos, y se asegura de que no haya contaminación que puede interferir con la generación de clúster.
Análisis de los datos. En este protocolo, se aplicó TopHat para alinear RNA-seq lee a transcriptoma de referencia humano y Gemelos de montar transcripciones, estimar su abundancia, y la prueba de expresión diferencial en trombina tratados HMVEC-LBL células. TopHat y Gemelos son two herramientas populares, y son gratis, software de código abierto 11. Un estudio reciente mostró que Gemelos tenía una alta sensibilidad y especificidad en la detección de intrones anteriormente anotado 12. Sin embargo, TopHat Gemelos y no se ocupan de todas las aplicaciones de RNA-seq ni son las únicas herramientas para el análisis de RNA-seq 11. TopHat Gemelos y requieren un transcriptoma referencia secuenciales o genoma. Ellos son particularmente adecuados para el análisis de RNA-Seq datos generados a partir de cualquiera de las máquinas de secuenciación Illumina o sólidos, pero no 454 o la electroforesis capilar clásico plataforma de secuenciación. Los usuarios que trabajan sin una referencia del genoma secuenciado podría considerar la realización de novo asamblea transcriptome utilizando una de varias herramientas, como el Trinity ( http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), Trans-Abyss ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) o Oasis ( http://www.ebi.ac.uk/ ~ Zerbino / / oasis ). Muchos de los programas alternativos de análisis de transcriptoma ahora existe. Para un estudio de los diferentes programas, los lectores pueden desear leer el estudio de Garber et al. 13 y el examen realizado por Martin y Wang 14, que describe las ventajas y desventajas comparativas y las consideraciones teóricas de la mayoría de los programas en la actualidad y de uso común. La elección de las estrategias de análisis de transcriptoma (de referencia basado en la estrategia, estrategia de novo, y la estrategia combinada) y los programas depende de muchos factores, como la existencia o integridad de un genoma de referencia, la disponibilidad de la secuencia y recursos informáticos, el tipo de conjunto de datos generado y, lo más importante, el objetivo general del proyecto de secuenciación 14.
Otro punto debe hacerse: computer programas para el análisis de transcriptoma no puede dar una precisión del 100% de todos los informes de transcripción. Secuenciación de error es otra preocupación. Siempre es recomendable que cualquier transcripción expresados diferencialmente identificados por RNA-seq ser validado por PCR en tiempo real. TaqMan química basada en sondeos se considera el estándar de oro para PCR en tiempo real. Además, las transcripciones recientemente identificados deben ser validados por el método de Sanger de secuenciación de ADN antes de cualquier experimentación.
Solución de problemas
Preparación de biblioteca: Un frotis de alto peso molecular ADN genómico después de los pasos de preparación de la biblioteca podría ser causado por un remanente de la etapa de purificación final talón durante la preparación de la biblioteca. Volviendo a las bibliotecas en el soporte magnético para un total de cinco minutos puede resolver el problema. Si no, el problema puede deberse a la fragmentación incompleta del ARN durante los primeros pasos de la preparación de la biblioteca. Esto podría ocurrir si bajaARN de calidad se utiliza o si el protocolo no se sigue con exactitud. Por ejemplo, alterando los tiempos de incubación o de la temperatura, la adición de reactivos en el orden incorrecto o la pausa entre la fragmentación y la síntesis de la primera hebra del ADNc. Si la devolución de las bibliotecas en el soporte magnético no elimina el ADN MW alto, es aconsejable repetir la preparación biblioteca con muestras de ARN.
Baja intensidad: si la intensidad del primer ciclo es inferior al esperado, es posible que los cebadores no se hibridó a las agrupaciones apropiadamente durante el último paso de la generación de clúster o la celda de flujo fue almacenado durante demasiado tiempo entre la agrupación y el inicio de la secuenciación ejecutar. En este caso, una rehibridación cebador debe ser realizada utilizando un kit de rehyb cebador de Illumina. Muy a menudo, esta rehyb resuelve los problemas de la intensidad y la carrera se puede iniciar otra vez sin ningún problema. Si después de un rehyb, las intensidades son todavía bajas, el problema puede sercon las bibliotecas o la secuencia de síntesis (SBS) reactivos y servicio técnico Illumina debe ser contactado para la solución de problemas. Si la intensidad de la primera lectura son buenas, pero las intensidades son bajas después de dar la vuelta, un rehyb cartilla de la cartilla segunda lectura puede ser necesario. Esto se realiza en el instrumento de secuenciación y servicio técnico Illumina debe ser contactado para el procedimiento.
High eliminación / prephasing: Si superior a la normal eliminación o prephasing se observa, una posible causa es la contaminación de los otros reactivos SBS con tampón de disociación. Durante las etapas de preparación de SBS, es esencial para manejar el tampón de disociación última y cambiar los guantes entre el manejo de la división de amortiguación y cualquier otro reactivo. Si la contaminación escisión búfer se sospecha una rehyb cartilla de la celda de flujo se deben realizar y los nuevos reactivos SBS debe estar preparado. Alternativamente, podría haber contaminación en las líneas de la inst rument. Si se sospecha esto, el instrumento debería someterse a un lavado de mantenimiento (un agua de lavado, seguidos por un lavado de NaOH, seguido de un lavado final con agua), un rehyb cebador se debe realizar en la celda de flujo y nuevos reactivos de SBS debe estar preparado. Si los valores de escalonamiento / prephasing son moderadamente alta (~ 0,5), la ejecución puede continuar hasta que las puntuaciones de Q30 y grupos que pasan filtro se calculan. Estos niveles pueden estar todavía en los límites aceptables incluso con la eliminación gradual de altura y / o prephasing.
Generalización de este protocolo
Aunque es específico para la HiScanSQ Illumina, este protocolo es aplicable a cualquiera de la familia HiSeq o el Genoma Analyzer II de Illumina instrumentos ( www.illumina.com ) con modificaciones menores de los pasos de generación de racimo y reactivos de secuenciación. Otras plataformas de próxima generación de secuenciación de ADN como la serie de sólidos ("_blank"> Www.lifetechnologies.com), el sistema GS ( www.454.com ), así como algunos sistemas emergentes nuevos también se emplea con el propósito de RNA-seq 11. Aunque su construcción de la biblioteca y procedimientos de secuenciación puede ser ligeramente diferente, los consejos de manipulación de ARN, las porciones de análisis de datos (aguas abajo de los pasos Casava) y la validación por RT-PCR se presenta en este protocolo puede ser de valor de referencia para sus aplicaciones RNA-Seq .
También hay que señalar que este protocolo es específico de RNA-seq en un punto de tiempo de trombina tratados HMVEC-LBL células, pero podría ser fácilmente adaptado a un estudio multi-punto de tiempo o estudios en otras células, los tejidos tratados con diferentes estímulos o inhibidores, o comparaciones de transcriptomes en células o tejidos entre un estado saludable y un estado de enfermedad.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Stephen Kingsmore y el Centro de Medicina del Genoma pediátrica en hospitales Mercy infantiles y clínicas para el uso de clusters sus computacionales para el análisis de datos, el equipo de iluminación de campo de servicio (Elizabeth Boyer, Cook Scott y Cook, Mark) y técnicos consultor equipo por sus respuestas rápidas y sugerencias útiles sobre el funcionamiento del instrumento generación siguiente secuenciación de ADN, HiScanSQ y análisis de datos de calidad. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud Grant HL080042 (a SQY) y la puesta en marcha del fondo y la dotación de los hospitales Mercy niños y las Clínicas de la Universidad de Missouri en Kansas City (a SQY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine - Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. | |||
References
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