Summary
Questo protocollo presenta una procedura completa e dettagliata di applicare RNA-seq, una potente tecnologia di nuova generazione di sequenziamento del DNA, per trascrittomi profilo in umano cellule endoteliali microvascolari polmonari con o senza trattamento trombina. Questo protocollo è generalizzabile a varie cellule o tessuti colpiti da diversi reagenti o stati di malattia.
Abstract
La caratterizzazione di espressione genica in cellule attraverso la misurazione dei livelli di mRNA è uno strumento utile nel determinare come la macchina di trascrizione della cellula è influenzata da segnali esterni (per esempio trattamento di droga), o come cellule differiscono tra uno stato di salute e di uno stato di malattia. Con l'avvento e il perfezionamento continuo della prossima generazione di tecnologia di sequenziamento del DNA, RNA-sequenziamento (RNA-seq) è diventato un metodo sempre più popolare di analisi del trascrittoma di catalogare tutte le specie di trascrizioni, per determinare la struttura della trascrizione di tutti i geni espressi e di quantificare i livelli di espressione di cambiamento del set totale di trascritti in un dato 1,2 cellula, tessuto o organismo. RNA-seq sostituisce progressivamente DNA microarrays come metodo preferito per l'analisi del trascrittoma perché ha i vantaggi di una profilatura transcriptome completa, fornendo un tipo di dato digitale (numero di copie di ogni trascrizione) e non basandosi su qualsiasi sequen genomica notace 3.
Qui vi presentiamo un protocollo completo e dettagliato di applicare RNA-seq per trascrittomi profilo in umano cellule endoteliali microvascolari polmonari con o senza trattamento trombina. Questo protocollo si basa sul nostro recente studio pubblicato dal titolo "RNA-Seq rivela trascrittoma Romanzo di geni e loro isoforme umane in cellule endoteliali microvascolari polmonari trattati con trombina," 4 in cui abbiamo effettuato con successo la prima analisi completa del trascrittoma umane polmonari cellule endoteliali microvascolari trattate con trombina utilizzando RNA-seq. Ha prodotto le risorse senza precedenti per la sperimentazione ulteriore di acquisire conoscenze sui meccanismi molecolari alla base di trombina-mediata disfunzione endoteliale nella patogenesi di condizioni infiammatorie, il cancro, il diabete e le malattie cardiache coronariche, e fornisce nuovi indizi per potenziali bersagli terapeutici per queste malattie.
Il testo descrittivo di questo protocolloè diviso in quattro parti. La prima parte descrive il trattamento di polmonari umane cellule endoteliali microvascolari con trombina e isolamento dell'RNA, analisi della qualità e quantificazione. La seconda parte descrive la costruzione della libreria e sequenziamento. La terza parte descrive l'analisi dei dati. La quarta parte descrive una RT-PCR convalida. I risultati rappresentativi di diversi passaggi chiave vengono visualizzati. Consigli utili o precauzioni per aumentare il successo in passaggi chiave sono forniti nella sezione di discussione. Sebbene questo protocollo utilizza polmonari umane cellule endoteliali microvascolari trattate con trombina, può essere generalizzato a trascrittomi profilo sia nelle cellule di mammiferi e non mammiferi e nei tessuti trattati con differenti stimoli o inibitori, o per confrontare trascrittomi in cellule o tessuti tra uno stato di salute e uno stato di malattia.
Protocol
Un diagramma di flusso che illustra questo protocollo è mostrato in Figura 1.
1. Il trattamento delle cellule con la trombina, l'RNA Isolation, della Qualità e di quantificazione di RNA
- La cultura umana del polmone cellule endoteliali microvascolari (HMVEC-LBL) al 90-100% confluenza in piastre da 6 pozzetti in EGM-2 media al 5% di FBS, fattori di crescita e gli antibiotici (Lonza, cat # CC-3202).
- Cambiare supporto ai media fame (0% FBS) 30 minuti prima del trattamento con trombina.
- Trattare le cellule con 0,05 U / ml di trombina o lasciato non trattato come un controllo per 6 ore a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Isolare RNA totale dalle cellule trattate e di controllo con il Ambion mir Vana kit secondo le istruzioni del produttore.
- Valutare la qualità del RNA con un eucariote Experion StdSense chip di RNA in base al protocollo standard Automated Stazione elettroforesi Experion (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
- Quantificare l'RNA utilizzando un metodo standard spettrofotometrico.
2. Biblioteca Edilizia e Sequencing
- Usare 1 pg di RNA di alta qualità totale per campione come materiale di partenza.
- Per costruire la biblioteca, seguire la procedura standard da Illumina (protocollo # 15008136 Rev. A). In questo protocollo, due cicli di poly (A) dell'mRNA contenenti selezioni vengono eseguite per rimuovere rRNA per minimizzare il sequenziamento rRNA.
- Valutare la qualità delle biblioteche utilizzando un chip di DNA 1K Experion secondo il protocollo standard sulla Stazione Experion elettroforesi automatica ( www.bio-rad.com ).
- Quantificare la libreria utilizzando qPCR: Utilizzare una libreria che è già stato sequenziato da una curva standard e primer specifici per gli adattatori legato. Utilizzare una serie di diluizioni delle biblioteche sconosciute (cioè 1:100, 1:500 e 1:1000). Eseguire l'acco qPCRrding al protocollo SyberGreen MM e calcolare la concentrazione originale stock di ogni libreria.
- Diluire le scorte di libreria a 10 nM e conservare a -20 ° C fino al momento di cluster di una cella di flusso.
- Quando si è pronti a raggrupparsi una cella di flusso, scongelare la piastra CBOT reagente in un bagno d'acqua. CBOT è uno strumento Illumina utilizzato per semplificare il processo di generazione di cluster.
- Lavare lo strumento CBOT.
- Denaturare le librerie: Combinare 13 microlitri 1x TE e 6 microlitri 10 mM biblioteca e, al lato del tubo, aggiungere 1 ml di NaOH 1 N (fornito da Illumina). Vortex, spin down, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e posizionare le librerie denaturati su ghiaccio.
- Diluire le librerie: Diluire le librerie denaturato con pre-raffreddata tampone di ibridazione (HT1, fornito da Illumina) combinando 996 microlitri HT1 e 4 microlitri biblioteca denaturato per una concentrazione finale di 12 pM. Posizionare le librerie denaturati e diluito su ghiaccio.
- Capovolgere ogni fila di tubi della piastra CBOT,assicurare che tutti i reagenti vengono scongelate. Centrifugare la piastra, rimuovere / forare le guarnizioni strisce e caricare sul CBOT.
- Aliquotare 120 ml di diluito, le biblioteche denaturati a un cilindro delle strisce, etichetta 1-8. Aggiungere 1,2 microlitri diluito, denaturati biblioteca controllo PhiX (da Illumina) in ciascuna provetta come un picco-in controllo. Vortex e centrifugare le provette e caricarli sul CBOT con l'orientamento corretto (tubo # 1 verso destra).
- Caricare una cella di flusso e collettore sul CBOT.
- Completate il flusso di controllo e iniziare la corsa di clustering.
- Una volta completata l'analisi, controllare la consegna dei reagenti in tutte le corsie. Prendere nota di eventuali anomalie. O iniziare la corsa di sequenziamento immediatamente o conservare la cella di flusso nel tubo fornito a 4 ° C.
- Scongelare il sequenziamento per sintesi (SBS, Illumina) reagenti.
- Caricare i reagenti ai punti giusti sui vassoi reagenti, facendo attenzione a non toccare gli altri reagenti dopo aver toccato il mix scissione.
- Utilizzando un non-sequenziamento cella di flusso (vale a dire quello che è stato sequenziato in precedenza), le linee dei reagenti prime due volte.
- Pulire accuratamente la cella di flusso di sequenza con il 70% EtOH e Kimwipes, seguito dal 70% EtOH e salviette. Ispezionare la cella di flusso per eventuali aloni. Re-pulirlo se necessario.
- Caricare la cella di flusso sul sequencer ed eseguire un flusso di controllare che la tenuta tra il collettore e la cella di flusso è stretto.
- Avviare la corsa di sequenziamento.
- Valutare le metriche di qualità (ad esempio, la densità di cluster, i cluster di passaggio filtro, Q30, di intensità) che vengono resi disponibili durante la corsa.
- Monitorare l'intensità per tutta la corsa.
- Dopo 101 cicli sono completati, effettuare chimica turnaround per completare la seconda lettura: Scongelare i reagenti terminali accoppiati e il secondo tampone Incorporation lettura (ICB, un componente di reagenti SBS, Illumina) e caricare i reagenti.
- Continua la corsa di sequenziamento, valutazione 2 ° letto intensità, Q30 unmetriche di qualità nd altre i progressi di esecuzione.
3. Analisi dei dati
- Utilizzare la versione più recente di casava (Illumina, attualmente 1.8.2) per convertire i file di base (chiamate. Bcl) file per file. Fastq, impostando fastq-cluster-count a 0 per garantire la creazione di un file fastq unico per ogni campione . Decomprimere i file fastq per l'analisi a valle.
- Eseguire l'allineamento fine accoppiato con le ultime versioni di TopHat (1.4.1) 5, che allinea l'RNA-seq legge di mammiferi di dimensioni genomi utilizzando l'ultra high-throughput allineatore breve lettura (, Bowtie 0.12.7) 6 e SAMtools (0.1. 17) 7. SAMtools implementa varie utilità per la post-elaborazione allineamenti in formato SAM. Il trascrittoma umano di riferimento può essere scaricato dal iGenomes ( www.illumina.com ). In esecuzione TopHat, abbiamo usato tutte le impostazioni di default dei parametri tra cui l'opzione di libreria dei tipi come fr-unstranded (default).
- Noizione del programma CuffDiff, parte dei gemelli (1.3.0) 8 pacchetto software, confronta le cellule trattate con trombina alle cellule controlli per escludere dei trascritti genici differenzialmente espressi nella ex basato sul trascrittoma umano di riferimento. Questo confronto rileva l'espressione differenziale dei trascritti noti. Utilizzare Microsoft Excel per visualizzare il risultato sotto forma di tabella. In esecuzione del programma Gemelli, abbiamo usato tutte le impostazioni di default dei parametri. Le trascrizioni del gene con FPKM <0,05 e p> 0,05 sono filtrati.
- Per rilevare isoforme nuovi, eseguire Gemelli senza un trascrittoma di riferimento. Confronta i file di esempio trascrizione al genoma di riferimento usando Cuffcompare e testare l'espressione differenziale con Cuffdiff utilizzando i file combinati trascrizione della trombina come il genoma di riferimento per una analisi e le file di controllo combinati trascrizione come il genoma di riferimento per una seconda analisi. Utilizzare Microsoft Excel per visualizzare il risultato in formato tabulare. Nuovamente, thostrascrizioni elettroniche gene con FPKM <0,05 e p> 0,05 sono filtrati. Dopo questo passo, gli investigatori possono scegliere di caricare un elenco di trascrizioni segnalate di recente al sito UCSC Genome Browser ( http://genome.ucsc.edu/ ) per verificare la validità di un controllo manuale.
- Presentazione delle liste di geni differenzialmente espressi Analisi Ingenuity Pathway (IPA, www.ingenuity.com ) per la caratterizzazione dei geni e le vie interessate dal trattamento trombina. In questa fase, gli investigatori possono scegliere di utilizzare cummerbund ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), un pacchetto di R che è stato progettato per aiutare e semplificare il compito di analizzare Gemelli RNA-seq uscita, per aiutare a gestire, visualizzare e integrare tutti i dati prodotti da una analisi Cuffdiff.
4. Validazione dei RNA-Seq Risultati della quantitativa in tempo reale-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)
- Eseguire isolamento dell'RNA totale di controllo e la trombina trattati HMVEC-LBL cellule, RNA qualità di valutazione e quantificazione RNA descritto nei passi 1,4-1,6.
- Generazione di DNA complementare da 1 mcg RNA totale di ciascun campione con SuperScript III First-Strand Synthesis Kit sistema RT, seguendo le istruzioni del produttore (Invitrogen, 18080-051).
- Eseguire qRT-PCR su Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System utilizzando Taqman Assay-on-Demand oligonucleotidi progettati per l'individuazione di CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1), e β-actina (ACTB, Hs99999903_m1). Ogni campione aveva un modello equivalente a 5 ng di RNA totale. Misurare quantificazione con il metodo DDCT e normalizzare per β-actina. Ogni saggio è stato eseguito in almeno tre repliche biologiche.
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Representative Results
Per Fase 1: Il 28s: 18s rapporto è tradizionalmente utilizzato come indicatore di degradazione dell'RNA. Idealmente, il picco 28s dovrebbe avere circa due volte l'area della banda 18s (un rapporto di 2), tuttavia questo rapporto ideale spesso non viene osservata nella pratica. Inoltre, 28s: 18s rapporti ottenuti da metodi spettrofotometrici può sottovalutare la quantità di degradazione dell'RNA. Per quantificare più accuratamente la degradazione, e quindi la qualità del campione RNA, il sistema calcola un Experion RNA Quality Indicator (RQI) numero. L'algoritmo confronta la RQI elettroferogramma di campioni di RNA di dati da una serie di standard, campioni degradati RNA e ritorna automaticamente un numero compreso tra 10 (RNA intatto) e 1 (RNA degradato). La qualità dell'RNA dovrebbe avere un RQI di almeno 7, preferibilmente maggiore di 8. Figura 2 mostra i risultati Experion con una elevata qualità del campione RNA con un RQI di 8,4.
PerFase 2: Le librerie dovrebbero avere una banda larga a circa 250-300 bp Figura 3 mostra i risultati di un Experion alta qualità library Figura 4 mostra i risultati di campioni qPCR curva standard e un campione ignoto (mostrato in blu scuro)... Progressi e la qualità della corsa sequenziamento dovrebbe essere costantemente osservati durante la corsa Figura 5 mostra densità appropriata cluster durante la prima fase del ciclo di imaging;. Questa è la prima indicazione della qualità di esecuzione. Cluster deve essere brillante e concentrato. Figura 6 mostra la relazione Base First generato dopo il primo ciclo è completo. È importante valutare la densità stimata cluster, livelli di intensità, e la qualità di messa a fuoco a questo punto. La qualità checkpoint successivo, dopo ciclo 4, è mostrata in Figura 7. Questo dimostra la densità assoluta del cluster per ogni corsia. La densità cluster non deve essere superiore 850 k / mm 2. Dopo il ciclo di 13,Statistiche fasatura (quando una base non viene aggiunto durante un ciclo) e prephasing (quando due basi sono aggiunti durante un ciclo) sono calcolati, come mostrato in Figura 8. Numeri tipici tra 0,1 e 0,25. La valutazione della qualità principale è possibile dopo il ciclo 24, quando le metriche di qualità diverse sono calcolati. La percentuale di legge sopra Q30, mostrato in Figura 9, è una misura della fiducia nella chiamata base. Una lettura con un punteggio di 30 Q significa che vi è una probabilità di 1 su 1000 chiamata di base che è sbagliato. I punteggi Q diminuisce con il progredire della corsa, ma dovrebbe iniziare con più del 95% della legge conformi o superiori Q30. I cluster passano filtro (PF), illustrato nella Figura 10, sono i cluster da cui i dati di sequenza effettivi verranno prese. Idealmente, questo dovrebbe essere superiore a 85%. Il PF di cluster si basa su molti fattori, compresa l'estinzione, prephasing, intensità e Q30. Non cambierà con il progredire della corsa. La percentuale allineata ( Per Fase 3: La tabella 1 presenta i geni espressi e isoforme sia il controllo e la trombina-trattati umane polmonari cellule endoteliali microvascolari. In particolare, ci sono circa 26.000 isoforme nuovi rilevati, che illustra la forza di RNA-seq-può identificare RNA sconosciuti, trascrizioni splicing alternativo e l'utilizzo promotore alternativo non rilevabili con tecniche di microarray 3. RNA-seq può misurare anche le trascrizioni meno abbondanti che vengono erroneamente quantificati o non rilevato da microarray. Figura 12 e nella Tabella 2 differentiall visualizzazioney geni espressi nella via di segnalazione trombina. Questo è un esempio del terzo analisi conoscenze percorso generazione di base-driven 9: approcci topologia pathway based, utilizzando il software Ingenuity Pathway Analysis. Mostra che un trattamento h sei trombina significativamente up-regola il recettore della trombina Par 4 e down-regola il recettore della trombina Par 3 mentre non vi è alcun cambiamento nell'espressione del recettore della trombina Par 1. Espressione di NFKB1, NF KB2 e Src sono anche significativamente up-regolato. Alcuni dei geni della famiglia Rho (Rho B, C, F e G) sono up-regolati, mentre altri (Rho J, Q, T1, U e V) sono down-regolata (Tabella 4). Gene della catena leggera della miosina 9 (MYL9) è up-regolato, mentre MYL12B è down-regolato. L'espressione di altri geni o è down-regolato o non sono interessate. Per Passo 4: Per convalidare l'RNA-Seq risultati utilizzando un approccio alternativo, abbiamo eseguito una qRT-PCR esperimento per saggio tre diversegeni affitto (Figura 13). In RNA-seq dati, TRAF1 è up-regolato da 7,96 volte; CELF1 era down-regolato da 1,16 volte, e FANCD2 è down-regolato da 1,70 volte. In qRT-PCR dei dati, questi numeri corrispondenti sono 7,25 volte, -1,15 -2,07 volte e volte, rispettivamente. I risultati di questi tre geni analizzati da RNA-seq e qRT-PCR sono in buon accordo, che conferma l'RNA-Seq risultati. Tabella 1. Gene / Isoform * Sommario Expression. Questa tabella elenca i geni, isoforme noti e nuove isoforme espresse nel controllo e trombina-trattati HMVEC-LBL cellule. La variazione piega è il rapporto di FragmentsPerKilobase trombina di frammenti perMillion trascrizione mappati (FPKM) per controllare FPKM. Tali geni, isoforme noti e nuovi isoforme con differenza di 2 volte o più tra i due gruppi sono statisticamente diversi livelli di espressione (come determinato dopo Benjamini-Hochberg correzione). * Questa tabella è riportato alla tabella 2 in riferimento 4. Tabella 2. Geni differenzialmente espressi e isoforme in trombina Signaling Pathway *. *, Questa tabella è riprodotta da S4 tabella nel Manuale 4 con una piccola modifica. **, Q-valore, un tasso di falsi scoperta regolata p-value. 93/4393fig1.jpg "alt =" Figura 1 "/> Geni Controllo Trombina Geni totale espressa 16636 16357 Controllo solo 783 Solo trombina 504 Up-regolamentato (differenza di 2 volte o superiore) 152 Down-regolata (2 volte o greater differenza) 2190 Isoforme noti Controllo Trombina Totale Isoforme noti Espresso 26807 26300 Controllo solo 1492 Solo trombina 985 Up-regolamentato (differenza di 2 volte o superiore) 480 Down-regolata (differenza di 2 volte o superiore) 3574 Nuovi Isoforme Controllo Trombina Isoforme Novel totale espressa 25880 25886 Controllo solo 418 Solo trombina 424 Up-regolamentato (differenza di 2 volte o superiore) 1775 Down-regolata (differenza di 2 volte o superiore) 12202 Down-geni regolati Gene Simbolo Nel complesso fold change Membri Individuale fold change q_value ** FPKM controllo FPKM trombina PLC -2,49 PLCB1 -2,97 0 6,75585 2,27611 PLCB2 -1,32 0.00183634 1,80892 1,36957 PLCB4 -10,04 6.28386E-14 0.682668 0,0679837 PLCL1 -2,53 5.26728E-09 0.602879 0.238017 GAQ -1,87 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 Gai -1,56 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 PKC -2,15 PRKCE -1,65 0 9,36364 5,67305 PRKCI -2,14 0 6,63566 3,09818 PRKD3 -2,61 0 16,0215 6,12878 IP3R -2,60 ITPR1 -1,39 0,000018734 1,51592 1,09009 ITPR2 -3,19 0 7,23283 2,26944 CREB -2,36 CREB1 -2,36 0 5,19117 2,2004 GATA -2,33 GATA3 -2,33 0.0228108 0.716773 0.307131 TBP -1,35 TBP -1,35 2.66E-05 8,48689 6,30476 G-proteina Alpha -1,64 GNA14 -1,49 0,000122496 2,78076 1,86573 GNAI1 -1,86 0 9,88417 5,31795 GNAI3 -1,49 0 35,7592 24,0198 GNAQ -1,87 0 24,0907 12,8996 PAR3 -1,87 F2RL2 -1,87 1.02474E-06 1,51286 0.810286 SOS1 SOS1 -2,27 0 8,94353 3,94679 Ras -1,69 KRAS -2,03 0 11,2766 5,5659 NRAS -1,61 0 38,0874 23,6491 AKT -1,77 Akt3 -1,77 0 15,8228 8,94223 MLCP -2,38 PPP1CB -2,10 0 39,585 18,8199 PPP1R12A -3,56 0 15,2274 4,27516 PPP1R12B -2,66 5.28466E-13 1,92123 0.722188 FAK -1,31 PTK2 -1,31 4.3856E-10 39,7935 30,3044 p70 S6K RPS6KB1 -1,99 0 8,46312 ROCK -3,68 Rock1 -3,54 0 19,5921 5,53112 Rock2 -3,86 0 16,0054 4,14759 CaMK -1,17 CAMK1 1,30 0,000255587 7,90794 10,296 CAMK2D -1,74 2.22911E-12 11,4497 6,56804 CAMK4 -2,58 0,000619045 0,62714 0.243277 Up-geni regolati Simbolo Nel complesso fold change Membri Individuale fold change q_value ** FPKM controllo FPKM trombina PAR4 1,59 F2RL3 1,59 9.19043E-13 4,99867 7,9253 Src 1,47 Src 1,47 0 14,1085 20,675 NF-kB 1,65 NFKB1 1,66 0 19,5113 32,3457 NFKB2 2,02 0 28,7563 58,1293 RELA 1,45 0 55,3482 80,28 Parziali Up-/Partial Down-geni regolati Simbolo Nel complesso fold change Membri Individuale fold change q_value ** FPKM controllo FPKM trombina G-proteina gammamma 1,22 GNG10 -1,34 2.17216E-08 27,192 20,2206 GNG11 1,31 5.66209E-05 770,922 1.011,05 GNG12 -1,44 5.11591E-13 112,397 78,3023 GNG2 2,43 6.38453E-09 0.465705 1,13132 G-proteina beta 1,27 GNB2 1,36 1.91268E-10 137,786 187,43 GNB3 -2,69 4.71259E-11 2,58703 0.962504 GNB4 -1,61 0 15,8275 9,85484 Rho GEF -1,16 ARHGEF12 -1,67 0 30,6424 18,3015 ARHGEF2 1,33 5.80478E-08 27,6288 36,758 ARHGEF3 -1,48 0 20,3279 13,7813 ARHGEF6 -2,08 0 2,67944 1,28635 ARHGEF9 -1,54 0.00469498 1,56367 1,0159 PI3K -1,80 ATM -6,84 0 4,98972 0.729483 PIK3C2A -5,09 0 17,7894 3,49234 PIK3C3 -1,49 4.66294E-15 12,6504 8,50852 PIK3CA -3,14 0 16,8398 5,36228 PIK3CB -1,36 8.4357E-09 9,68516 7,12129 PIK3CD 1,86 0 5,6579 10,5507 PIK3CG -1,76 2.32945E-10 1,86962 1,06419 PIK3R1 -1,79 0 5,48118 3,06256 PIK3R3 -1,59 1.50915E-05 5,24549 3,30763 PIK3R4 -1,40 7.18425E-12 8,34176 5,97942 Rho 1,19 RHOB 1,31 9.48429E-06 232,232 304,587 RHOC 1,38 458,267 630,235 RHOF 1,65 0 8,29676 13,7268 RHOG 1,40 1.02141E-14 58,6003 82,0172 RHOJ -1,57 0 127,446 80,9317 RHOQ -1,52 0 16,4802 10,8122 RHOT1 -1,96 3.00071E-12 8,48834 4,33755 RHOU -1,54 0.00184367 0.900141 0.586092 RHOV -3,32 0.0056467 1 0.413912 0.124591 RND3 -1,95 0 58,0564 29,7075 MLC -1,06 MYL12B -1,43 4.87832E-11 872,075 608,472 MYL9 1,48 0 202,636 299,559
Figura 1. Diagramma di flusso del protocollo per RNA-seq profilatura della trombina mediata transcriptome polmonari umane in cellule endoteliali microvascolari. Innanzitutto, il trattamento di cellule e di isolare e quantificare RNA. Preparare librerie dalla RNA di alta qualità e di valutare la loro concentrazione (tramite qPCR) e qualità (tramite un bioanalizzatore), poi cluster in una cella di flusso. Avviare il ciclo di sequenziamento e analizzare la qualità del percorso attraverso. I punti di controllo di qualità principali sono cicli 1, 4, 13 e 24. Utilizzando casava, convertire i file in file bcl fastq e quindi allineare quelli del genoma con TopHat. Rileva isoforme note e sconosciute con Gemelli e determinare l'espressione differenziale con CuffDiff. Visualizzare i file di output in Excel e filtrare i geni che hanno un livello di espressione inferiore a 0,05 FPKM o un p-value maggiore di 0.05. Invia i geni rimanenti Analisi Ingenuity Pathway per ulteriori informazioni sulle funzioni dei geni e vie diffected dal trattamento trombina. Di solito, selezionati set di geni differenzialmente espressi sono convalidati da un approccio alternativo come qRT-PCR. 
Figura 2. Un campione rappresentativo RNA con un RQI di 8,4 come analizzato dalla stazione automatizzata Electrophoresis Experion A) La traccia individuale di alta qualità RNA -.. L'asse x rappresenta il tempo e l'asse y rappresenta il segnale fluorescente B) L'immagine virtuale gel di una elevata qualità del campione RNA. L'intensità del picco 28S è maggiore di picco 18S e nessuna contaminazione è visto. Entrambi i gruppi sono taglienti e definiti. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Library alta qualità preparato da RNA come analizzato dalla stazione automatizzata Electrophoresis Experion un ampio picco tra 250 e 300 bp viene rilevato e non DNA ad alto peso molecolare (DNA contaminante) si osserva A) La traccia individuale di una libreria di alta qualità.. - l'asse x rappresenta il tempo e l'asse y rappresenta il segnale fluorescente B) L'immagine virtuale di un gel di alta qualità library. Un picco di ampio respiro tra 250 e 300 bp viene rilevato e non DNA ad alto peso molecolare (DNA contaminante) viene osservato. Clicca qui per ingrandire la figura .
<strong> Figura 4. risultati qPCR utilizzando SyberGreen e primer specifici per Illumina adattatori ligato. Una libreria precedenza cluster viene utilizzato come curva standard per determinare la concentrazione ottimale di clustering per la libreria appena preparata. La diluizione della biblioteca sconosciuta rientra nelle concentrazioni curva standard. I campioni della curva standard sono accusati dalle frecce e il campione sconosciuto è blu scuro e anche indicato da una freccia.
Figura 5. . Densità del cluster appropriato durante la prima fase del ciclo di imaging I grappoli sono chiare, mirate e luminoso A) Base A,. B) Base C, C) Base G, D) Base T.
| Metrico | Lane 1 | | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 | Lane 6 | Corsia 7 | Corsia 8 | |
| Cluster Densità (k / mm 2) | 420,94 | 412,95 | 410,81 | 408,54 | 416,71 | 416,56 | 410,02 | 411,84 |
| A Intensity | 25.870,5 | 23886 | 23.891,38 | 23.735,83 | 23.949,38 | 24.933,08 | 24.305,79 | 23.950,29 |
| C Intensità | 21.559,62 | 19.822,33 | 19.759,33 | 19472 | 19.954,21 | 20.611,75 | <td> 1989219.438,29 | |
| G Intensità | 13.619,46 | 11.756,67 | 11.486,44 | 10.498,38 | 12.186,62 | 12.195,5 | 11.826,88 | 11.010,5 |
| T Intensità | 19.402,67 | 17.663,79 | 17.854,42 | 17.353,75 | 17.545,54 | 18.060,67 | 18.457,92 | 17.397,12 |
| A Focus Punteggio | 68,2 | 67,46 | 67,67 | 67,75 | 67,41 | 67,43 | 67,63 | 67,05 |
| Punteggio di messa a fuoco C | 67,93 | 67,33 | 67,56 | 67,66 | 67,33 | 67,39 | 67,46 | 66,9 |
| G fuoco Punteggio | 65,4 | 64,14 | 63,98 | 63,92 | 63,29 | 63,41 | 63,47 | 63,74 |
| T Punteggio di messa a fuoco | 66,45 | 65,57 | 65,5 | 65,49 | 65,03 | 65,23 | 65,57 | 65,59 |
Figura 6. Il rapporto generato prima base dopo il primo ciclo è completo. La densità cluster (anche se sottovalutato in questa fase) è appropriato. Le intensità di guardare bene (10,000-26,000, con G con la più bassa intensità). I punteggi di messa a fuoco sono inoltre opportuno, cadendo attorno al 65-70, anche se i valori più alti sono anche appropriati.
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Figura 7. La densità del cluster calcolato dopo il ciclo 4 La densità cluster è inferiore a 850 k / mm 2 e anche in tutte le corsie A) sotto forma di tabella,... B) forma grafico Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 8. Fasatura (non aggiungendo una base durante un ciclo) e Pre-fasatura (aggiungendo due basi durante un ciclo). Entrambi i valori sono a 0,25 o inferiore, indicando opportuni phasing / pre-fasatura livelli. A) I valori di fasatura e pre-fasatura numerici . B) I valori di phasing in forma grafica. C) Il pre-graduale valori in forma grafica. Clic k qui per ingrandire la figura.
Figura 9. Le diverse rappresentazioni di Q30 punteggi dopo ciclo 24. Un punteggio di 30 o superiore indica una probabilità di 1 su 1000 che la chiamata di base è sbagliato. Circa il 90% dei punteggi Q sono superiore a 30 A) forma tabellare (Q30 punteggi qui vengono da la totalità della corsa, con ciclo di 24). B) Q30 partiture di ciclo. Ogni barra rappresenta la distribuzione delle legge di discesa Q30 o superiore per quel particolare ciclo. C) Q30 distribuzioni ottenuta tramite ciclo 24. La distribuzione dei punteggi Q su base cumulativa attraverso il ciclo 24. Punteggio Q è sul asse x e milioni di letture è l'asse y. Legge con Q30 superiore a 30 sono rappresentati in verde.oad/4393/4393fig9large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 10. Le diverse rappresentazioni di gruppi che passano cluster filtro. Passaggio filtro si basa su diversi parametri, tra cui Q30, l'intensità e la graduale / pre-fase. Almeno l'85% dei glomeruli passano filtro in ogni corsia A) forma tabellare,. B) forma grafico, caselle blu indicano il numero totale di cluster, caselle verdi rappresentano i cluster di passaggio filtri. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 11. . La percentuale dei cluster allineati al genoma PhiX Circa il 0,5% dei glomeruli allineare al genoma PhiX, appropriata per la quantità di PhiX arricchito nei campioni A) sotto forma di tabella,.. B) forma grafico Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 12. I geni differenzialmente espressi dal trattamento di trombina HMVEC-LBL nella via di segnalazione. Trombina La via di segnalazione di trombina è stato costruito da Ingenuity. Nel percorso, il colore rosso indica up-geni regolati (3 1.3 volte) e verde down-regolate geni (
Figura 13. qRT-PCR la convalida di tre geni differenzialmente espressi da trombina-trattati HMVEC LBL-RNA-Seq dati. qRT-PCR è stata effettuata come descritto nel protocollo. modifiche Piegare determinati dai valori relativi Ct del saggio TaqMan Gene Expression per CUGBP, Elav-come membro della famiglia 1 (CELF1), anemia di Fanconi, gruppo D2 complementazione (FANCD2) e TNF recettore-associated factor 1 (TRAF1)sono stati confrontati con quelli rilevati da RNA-seq. Repliche (n = 4) di ciascun campione sono stati eseguiti ed i valori Ct media. Tutti i valori Ct sono stati normalizzati per β-actina. Le barre di errore rappresentano la gamma di variazione piega come determinato dai dati Assist software. p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo relative modifiche volte tra trombina-treat gruppo e gruppo di controllo sia l'RNA-seq e qRT-PCR. Il livello di mRNA in gruppi di controllo da ciascun saggio è stata arbitrariamente impostata a uno, che non sono mostrati. *, P <0,05; **, p <0,01. Questa figura è riprodotta dalla figura 6 in riferimento 4.
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Discussion
Passaggi chiave
Manipolazione di RNA: RNasi peggiora anche i più di alta qualità RNA, pertanto è necessario prestare attenzione durante l'isolamento, lo stoccaggio e l'uso di RNA 10. I guanti sono sempre indossati per prevenire la contaminazione da RNasi presenti sulle mani umane. I guanti devono essere cambiati spesso, in particolare dopo la pelle toccare, maniglie delle porte o altre superfici comuni. Una serie di pipette deve essere dedicato esclusivamente a RNA lavoro e tutti i consigli e tubi dovrebbero essere RNase-free. Isolamento dell'RNA ea valle l'applicazione deve essere eseguita in condizioni di scarsa aree a traffico intenso, che siano periodicamente decontaminate con un prodotto come RNasi-Zap. La degradazione può verificarsi anche con ripetuti cicli di congelamento e scongelamento. Questi possono essere minimizzati aliquotandolo RNA per applicazioni a valle immediatamente dopo isolamento. In alternativa, cDNA può prevedere l'applicazione a valle come qRT-PCR direttamente dopo isolamento. RNA deve essere conservato a -80 ° C e mantenuto in ghiaccio durante l'uso. E 'anche important di scongelare completamente e vortex RNA campioni prima e durante l'uso.
La qualità di partenza del RNA è fondamentale per il successo di questo protocollo. L'uso di degradati o comunque di bassa qualità RNA può causare la preparazione biblioteca per fallire o risultare in bassa resa che non sarà sufficiente per il sequenziamento. Anche se abbastanza biblioteca può essere fatto da RNA degradati o di bassa qualità, non rappresenta accuratamente le trascrizioni presenti nel campione, con conseguente quantificazione imprecisa di espressione. Inoltre, qualsiasi DNA genomico non rimossi durante l'isolamento dell'RNA può causare una sovrastima della quantità di RNA utilizzati nel protocollo, ma se una quantità (ad esempio 1-2 mg) al centro del range suggerito (0,1-4 mg) viene usato, la quantità effettiva di RNA sarà sufficiente per il protocollo. Inoltre, qualsiasi DNA genomico non può essere raccolto da oligo (dt) costruzione della libreria primer a base Illumina nel protocollo standard e quindi non causerà iss valleUES con livelli di mRNA espressi trascrizione. La quantificazione di RNA di partenza usando regolari letture spettrofotometriche dovrebbe essere sufficiente e non vi è alcuna necessità di utilizzare metodi quantitativi molto accurati come RiboGreen poiché le librerie verrà accuratamente quantificato previa preparazione da qPCR e livelli di espressione genica sono normalizzati rispetto al numero totale di legge durante le fasi di analisi dei dati.
Quantificazione Biblioteca. Quantificazione accurata delle librerie è vitale per la generazione appropriato di cluster. Molecole di DNA solo con adattatori con successo legatura formeranno gruppi. Letture spettrofotometriche non distingue tra DNA e DNA con adattatori senza che si tradurrà in una sovrastima della concentrazione della biblioteca e in definitiva portare a errori di clustering della cella di flusso. La quantità di DNA senza adattatori ligato sarà diverso da libreria a libreria, anche se lo stesso RNA è stato utilizzato come iniziaremateriale di voce, così non si può assumere con precisione che una percentuale standard della lettura spettrofotometrica è il DNA con adattatori legato. Eseguire qPCR con primer specifici per gli adattatori rileverà solo le molecole di DNA con adattatori successo ligato ad entrambe le estremità della molecola. Ciò consente una quantificazione assoluta delle librerie ed a sua volta una densità accurata cluster. Valutazione delle librerie con uno strumento o un Experion bioanalizzatore è importante. Questo permette una visualizzazione della gamma dimensioni della libreria, che è importante durante le fasi di analisi dei dati, e assicura che non vi è alcuna contaminazione che può interferire con la generazione di cluster.
Analisi dei dati. In questo protocollo, abbiamo applicato TopHat di allineare RNA-seq legge al trascrittoma di riferimento umano e Gemelli da montare trascrizioni, valutare le loro abbondanze, e test per l'espressione differenziale in trombina trattati HMVEC-LBL cellule. TopHat e Gemelli sono two strumenti popolari, e sono libero, open-source software 11. Uno studio recente ha dimostrato che Gemelli aveva una alta sensibilità e specificità nel rilevare introni precedentemente annotati 12. Tuttavia, TopHat Gemelli e non prendono in considerazione tutte le applicazioni di RNA-seq né sono gli unici strumenti per RNA-seq analisi 11. TopHat Gemelli e richiedono un trascrittoma di riferimento o in sequenza del genoma. Sono particolarmente adatti per l'analisi di RNA-seq dati generati da entrambi macchine Illumina o solido sequenziamento ma non 454 o l'elettroforesi capillare classico sequenziamento piattaforma. Gli utenti che lavorano senza un genoma sequenziato di riferimento può prendere in considerazione l'esecuzione de novo assembly trascrittoma utilizzando uno dei numerosi strumenti, come il Trinity ( http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ ), Trans-Abyss ( http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/trans-abyss/releases/0.2) o Oasi ( http://www.ebi.ac.uk/ ~ Zerbino / / oasi ). Molti programmi alternativi di analisi del trascrittoma ora esistono. Per una rassegna di programmi diversi, i lettori potrebbero voler leggere lo studio di Garber et al. 13 e la recensione di Martin e Wang 14, che descrivono i vantaggi comparativi e gli svantaggi e le considerazioni teoriche della maggior parte dei programmi attualmente e comunemente utilizzati. La scelta di strategie di analisi del trascrittoma (basato su riferimenti strategia, la strategia de novo, e strategia combinata) e programmi dipende da molti fattori, tra cui l'esistenza o la completezza di un genoma di riferimento, la disponibilità di risorse di calcolo e di sequenziamento, il tipo di set di dati generato e, soprattutto, l'obiettivo primario del progetto di sequenziamento 14.
Un altro punto dovrebbe essere: computer programmi per l'analisi del trascrittoma non può produrre una precisione del 100% di tutte le segnalazioni trascrizione. Sequencing errore è un'altra preoccupazione. E 'sempre consigliabile che ogni trascrizione differenzialmente espressi identificati da RNA-seq essere convalidate mediante real-time PCR. Chimica TaqMan probe-based è considerata il gold standard per PCR in tempo reale. Inoltre, trascrizioni di nuova identificazione devono essere convalidati con il metodo Sanger di sequenziamento del DNA prima di ogni ulteriore sperimentazione.
Risoluzione dei problemi
Preparazione biblioteca: uno striscio di DNA ad alto peso molecolare genomico dopo le fasi di preparazione della biblioteca potrebbe essere causato da un riporto dalla fase finale di purificazione tallone durante la preparazione biblioteca. Tornando le librerie al supporto magnetico per cinque minuti può risolvere il problema. Se no, il problema può derivare dalla frammentazione incompleta del RNA durante le prime fasi della preparazione biblioteca. Ciò potrebbe verificarsi se a bassaqualità dell'RNA è utilizzato o se il protocollo non è seguito esattamente. Ad esempio, modificando i tempi di incubazione o della temperatura, l'aggiunta di reagenti in modo non corretto o pause tra frammentazione e la sintesi del primo filamento del cDNA. Se dovessi tornare le librerie per il supporto magnetico non rimuove il DNA ad alta MW, si consiglia di ripetere la preparazione biblioteca con nuovi campioni di RNA.
Bassa intensità: Se l'intensità del primo ciclo è inferiore al previsto, è possibile che gli iniettori non si ibridizzano con i cluster correttamente durante l'ultima fase di generazione di cluster o la cella di flusso è stato conservato troppo a lungo tra raggruppamento e l'inizio del sequenziamento eseguire. In questo caso, un rehybridization primer deve essere eseguita utilizzando un kit rehyb primer Illumina. Molto spesso, questo rehyb risolve i problemi intensità e la corsa può essere iniziato più senza alcun problema. Se, dopo un rehyb, le intensità sono ancora bassi, il problema potrebbe esserecon le librerie o la sequenza di sintesi (SBS) reagenti e Illumina servizio tecnico deve essere contattato per la risoluzione dei problemi ulteriori. Se intensità la prima lettura sono buone, ma le intensità sono basse dopo giro intorno, una rehyb innesco del primer seconda lettura può essere necessario. Questo viene eseguita sullo strumento e sequenziamento Illumina servizio tecnico deve essere contattato per la procedura.
Alta graduale / prephasing: se superiore al normale o phasing prephasing si osserva, una possibile causa è la contaminazione dei reagenti altri SBS con buffer di scissione. Durante le fasi di preparazione SBS, è essenziale per gestire il buffer clivaggio ultima e cambiare i guanti tra la movimentazione del tampone di scissione ed eventuali altri reagenti. Se il tampone contaminazione scissione si sospetta, una rehyb fondo della cella di flusso deve essere eseguita e nuovi reagenti SBS deve essere preparato. In alternativa, ci potrebbe essere la contaminazione nelle linee del inst RUMENT. Se si sospetta, lo strumento deve essere sottoposto a lavaggio di manutenzione (un lavaggio seguito da un lavaggio NaOH, seguito da un lavaggio finale di acqua), un rehyb primer deve essere eseguita sulla cella a flusso e nuovi reagenti SBS deve essere preparato. Se i valori di fasatura / prephasing sono moderatamente alti (~ 0.5), la corsa può essere continuato fino a quando le Q30 punteggi e dei cluster di passaggio del filtro vengono calcolati. Questi livelli possono essere ancora in limiti accettabili anche con fasatura alta e / o prephasing.
La generalizzabilità di questo protocollo
Anche se è specifico per il HiScanSQ Illumina, questo protocollo è applicabile a qualsiasi della famiglia HiSeq o il Genome Analyzer II di Illumina strumenti ( www.illumina.com ) con piccole modifiche di passi di generazione del cluster e dei reagenti di sequenziamento. Altri sequenziamento di prossima generazione di piattaforme di DNA, come la serie Solid ("_blank"> Www.lifetechnologies.com), il sistema GS ( www.454.com ) nonché alcuni sistemi emergenti più recenti sono anche impiegati per lo scopo di RNA-seq 11. Anche se la loro costruzione della libreria e le procedure di sequenziamento possono essere leggermente diversi, le punte di movimentazione di RNA, le porzioni di analisi dei dati (a valle dei passi casava) e la convalida mediante RT-PCR presentato in questo protocollo può essere di valore di riferimento per il loro RNA-Seq applicazioni .
Va inoltre sottolineato che questo protocollo è specifico per RNA-seq in un dato momento della trombina-trattati HMVEC-LBL cellule, ma potrebbe essere facilmente adattato per un multi-point tempo di studio o studi in altre cellule, tessuti trattati con stimoli diversi o inibitori, o confronti di trascrittomi nelle cellule o tessuti tra uno stato di salute e uno stato di malattia.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Stephen Kingsmore e il Pediatric Medicine Center Genome presso Ospedali Mercy bambini e cliniche per l'uso dei loro cluster di calcolo per l'analisi dei dati, il campo Illumina di assistenza tecnica (Elizabeth Boyer, Scott Cook e Mark Cook) e tecnica team di consulenti per le loro risposte rapide e suggerimenti utili sul funzionamento dello strumento di prossima generazione di sequenziamento del DNA, HiScanSQ, e la qualità dei dati di analisi. Questo lavoro è stato in parte finanziato dal National Institutes of Health di Grant HL080042 (a SQY) e start-up fondo di dotazione e degli Ospedali Mercy bambini e Cliniche, Università del Missouri a Kansas City (a SQY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine - Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge - Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. | |||
References
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